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A cura di Prof Mario Giusiani AZIENDA OSPEDALIERA UNIVERSITARIA PISANA SEZIONE DIPARTIMENTALE DI TOSSICOLOGIA FORENSE VIA ROMA 55 PISA ATTIVITA’ DI LABORATORIO.

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1 A cura di Prof Mario Giusiani AZIENDA OSPEDALIERA UNIVERSITARIA PISANA SEZIONE DIPARTIMENTALE DI TOSSICOLOGIA FORENSE VIA ROMA 55 PISA ATTIVITA’ DI LABORATORIO DI I° E II° LIVELLO

2 SEZIONE DI TOSSICOLOGIA FORENSE La sezione attualmente si trova collocata in Pisa via Roma 55 ed è costituita da: Portineria Segreteria Direzione Sala prelievi Laboratorio preparazioni Laboratorio cromatografia e spettrofotometria Laboratorio immunochimica

3 ORGANIGRAMMA DELLA SEZIONE DIPARTIMENTALE DI TOSSICOLOGIA FORENSE

4 TIPOLOGIA DELLE INDAGINI ESEGUITE DALLA SEZIONE DI TOSSICOLOGIA UNIVERSITARIA

5 DOTAZIONE STRUMENTALE TECNICHE IMMUNOCHIMICHE 1 Sistema AxSym (Abbott) per analisi immunochimiche con tecnica FPIA 1 Sistema ILab 650 (Instrument Laboratory) per analisi immunochimiche con tecniche CEDIA, EMIT, DRI

6 Ultimamente sono state messe a punto nuove metodiche immunochimiche che ci hanno permesso di ampliare la gamma di sostanze per le quali è possibile richiedere la determinazione su campioni urinari. In particolare: 6-monoacetil morfina (6-MAM, metabolita specifico dell’eroina) 6-monoacetil morfina (6-MAM, metabolita specifico dell’eroina) cocaina (come tale) cocaina (come tale) EDDP (metabolita del metadone) EDDP (metabolita del metadone) MDMA (ecstasy, come tale) MDMA (ecstasy, come tale) etilglucuronide (metabolita specifico dell’etanolo) etilglucuronide (metabolita specifico dell’etanolo) LSD LSD sample check (per identificazione di campioni di urina adulterati) sample check (per identificazione di campioni di urina adulterati) La determinazione di queste nuove sostanze è di notevole importanza sia a livello tossicologico-forense ma anche clinico in quanto offre una possibilità in più per il monitoraggio del paziente. ANALISI DI TIPO CHIMICO-CLINICO RECENTEMENTE INTRODOTTE

7 DOTAZIONE STRUMENTALE TECNICHE CROMATOGRAFICHE 1 GC FOCUS CON DETECTOR FID 1 GC FOCUS CON DETECTOR DI MASSA A SINGOLO QUADRUPOLO (DSQII) ENTRAMBI GESTITI DA AUTOCAMPIONATORE TRIPLUS (THERMO FINNIGAN) 1 GC TRACE CON DETECTOR MS/MS A TRAPPOLA IONICA (POLARIS Q) CON AUTOCAMPIONATORE AS2000 (THERMO FINNIGAN) 1 GC MS QP 2010 ULTRA SHIMADZU SINGOLO QUADRUPOLO CON AUTOCAMPIONATORE 1 GC 9000 (FISONS) CON DETECTOR FID 1 HPLC PERKIN HELMER LC 250 CON DETECTOR DAD LC MS AD ALTA RISOLUZIONE (ACQUISTO IN PROGRAMMAZIONE)

8 DOTAZIONE STRUMENTALE TECNICHE SPETTROFOTOMETRICHE 1 Strumento JASCO V630 per analisi spettrofotometriche nel campo UV/VISIBILE

9 CLASSIFICAZIONE DEI LABORATORI Laboratorio di base nell ’ ambito della Biochimica Tossicologica Laboratorio di I° livello (solo test di screening) Matrice biologica urina Tipo di analisi immunochimica Cut-off stabilito a livello regionale Strumentazioni analizzatori automatici di chimica clinica Procedure stabilite nei manuali della qualità e linee guida Controllo di qualità si, partecipazione a programma VEQ Catena di custodia no

10 CLASSIFICAZIONE DEI LABORATORI Laboratorio di base nell ’ ambito della Biochimica Tossicologica Laboratorio di II° livello (screening e conferma) Matrice biologica tutte Tipo di analisi immunochimica e cromatografica Cut-off stabilito a livello regionale Strumentazioni analizzatori automatici di chimica clinica, GC-MS, HPLC-MS Procedure stabilite nei manuali della qualità e linee guida Controllo di qualità si, partecipazione a programma VEQ Catena di custodia si

11 MATRICI UTILIZZATE NEI LABORATORI DI II LIVELLO MATRICI CONVENZIONALI: urine sangue MATRICI ALTERNATIVE: saliva sudore capelli peli unghie

12 NECESSITA’ DELLE ANALISI DI SECONDO LIVELLO O DI CONFERMA I test di screening immunochimici possono fornire : Falsi positivi Falsi negativi NON SONO QUINDI DIFENDIBILI IN CASO DI CONTENZIOSO Nel referto redatto dal laboratorio di I° livello dovrebbe sempre essere specificato che il risultato non è stato confermato con tecniche specifiche (es. GC/MS) e quindi è da considerarsi solo indicativo.

13 Campi di applicazione relativi ai laboratori di Tossicologia Forense di II livello Diagnosi con valenza medico-legale nei seguenti campi: 1. valutazione tossicodipendenza e/o assunzione droghe; 2. determinazione causa della morte da droga e/o altri tossici; 3. idoneità alla guida; 4. infortunistica stradale; 5. mansioni lavorative a rischio; 6. porto d ’ armi; 7. idoneità a specifiche norme concorsuali; 8. affidamento di minori; 9. annullamento di matrimonio, 10. etc.

14 Settori inerenti l’attività della Sezione di Tossicologia Forense valutazione tossicodipendenza e/o assunzione droghe (Ser.T.; carceri, Altre USL ecc.) idoneità alla guida (artt. 119, 186 e 187 C.D.S.); mansioni lavorative a rischio; determinazione causa della morte da droga e/o altri tossici; accertamento principi attivi stupefacenti su reperti clandestini infortunistica stradale; porto d’armi; idoneità a specifiche norme concorsuali; affidamento di minori; annullamento di matrimonio, etc. tutte diagnosi con valenza medico-legale

15 Scelta della matrice e prelievo del campione Laboratorio Preparazione del campione Separazione delle sostanze in esame Trattamento pre-analisi Analisi strumentale Valutazione critica del risultato

16 Scelta della matrice e prelievo del campione saliva capelli o altro materiale pilifero organi sangue unghie umor vitreo urinesudore

17 In rapporto all’informazione che si vuole ottenere: Diagnosi di attualità d’uso: sangue, saliva Diagnosi di attualità d’uso: sangue, saliva Diagnosi di uso recente: urina, sudore Diagnosi di uso recente: urina, sudore Diagnosi di uso/esposizione abituale: capelli, peli, unghie Diagnosi di uso/esposizione abituale: capelli, peli, unghie Diagnosi di avvelenamento (sangue, urine, organi) Diagnosi di avvelenamento (sangue, urine, organi) Scelta della Matrice Biologica

18 URINA GIORNI CAPELLI MESI tempo (giorni) SANGUE ORE

19 Tipo di MatriceVolume campioneSostanze e metaboliti ricercati Test impiegatiTempo medio di rilevamento e picco massimo Il sangue Matrice il cui prelievo è invasivo. Dimostra una esposizione relativamente recente (poche ore dopo l ’ assunzione). Occorre il consenso del soggetto. Matrice di grande importanza, soprattutto perché conosciuta in ogni sua caratteristica. Quantità del prelievo limitata. I volumi sono variabili, a seconda del test impiegato. ll prelievo di sangue su vivente viene fatto con l ’ uso di un anticoagulante come eparina, sodio citrato o ossalato. Il campione deve essere refrigerato fino al momento della analisi. 1.ALCOOL 2.OPPIACEI 3.COCAINA 4.AMFETAMINE 5.CANNABINOIDI 6.BENZODIAZEPINE 7.BARBITURICI 8.ETC.. È matrice di uso comune per la rivelazione di tutto ciò che può essere stato assunto. 1.Ria 2.Emit 3.Eia 4.FPIA Direttamente per alcune sostanze o dopo deproteinizzazione 1.GLC 2.HPLC 3.GC/MS Dopo estrazione Dipende dalla emivita del tossico: via di assunzione tipo di farmaco La concentrazione che un tossico raggiunge nel sangue dipende dal suo volume di distribuzione apparente (Vd) in relazione al fatto che la distribuzione avvenga solo nell ’ acqua plasmatica o nell ’ acqua totale (H 2 O extracellulare (plasmatica e interstiziale) e H 2 O intracellulare). Se un composto chimico si distribuisce rapidamente nei tessuti, abbassa la sua concentrazione nel sangue. Via di entrata della sostanza nella matrice Risultati e cut-off VantaggiSvantaggiPossibili adulterazioni Dal flusso sanguigno: 1.e.v. 2.assorbimento: - Gastrointestin., - polmonare, - cutaneo. I risultati ottenuti valutano un uso recente di sostanza stupefacente (limitato ad ore), visto che la durata di uno xenobiotico è breve nel sangue. I cut-off variano da sostanza a sostanza e sono legati alla metodica impiegata. 1.matrice di impiego comune 2.non può essere soggetto a modificazioni e/o adulterazioni 3.relazionabile con altre matrici 4.molteplici metodiche e test la impiegano come matrice di elezione insieme alle urine 1.la sostanza ha una permanenza in matrice di poche ore 2.necessita generalmente di una estrazione 3.concentrazioni in genere basse o nulle dopo poco tempo 4.non discrimina la cronicità d ’ abuso, ma solo la fase acuta 5.matrice pericolosa per l ’ operatore: trasmissione di possibili infezioni. Non può essere adulterata o modificata se non dopo il prelievo. Il prelievo deve essere compiuto con anticoagulanti che possono dare interazione in alcuni casi. Possibile interfrenza del disinfettante, se a base alcolica, sull ’ alcolemia.

20 Tipo di MatriceVolume campioneSostanze e metaboliti ricercati Test impiegatiTempo medio di rilevamento e picco massimo La saliva È senza dubbio la matrice non convenzionale più comunemente usata in sostituzione al sangue per la discriminazione di droghe. Si preleva per via orale: Espettorazione. Tampone (in genere ottenuto dopo stimolazione con Acido Citrico). Prelievo non è invasivo. Relazionabile in alcuni casi con la concentrazione di xenobiotico nel sangue. I volumi sono molto piccoli, con concentrazioni di sostanze spesso molto basse. Matrice ottimale nei test “ road-side ”, vista la sua facile campionatura e la velocità di analisi di screening. 1.OPPIACEI (morfina e codeina) 2.COCAINA (ecgonina metilestere e cocaina) 3.AMFETAMINE 4.CANNABINOIDI 5.BENZODIAZEPINE 6.BARBITURICI 7.PCP 8.ALCOOL 9.NICOTINA 10.ETC.. 1.QED per fluido orale 2.SPME 3.Syva Rapid Test 4.Biomedix 5.Frontline 6.DrugWipe 7.CortezDako 8.Eia 9.GC/MS 10.etc… 1.Dipende dalla emivita del tossico: via di assunzione tipo di farmaco (acido o basico). Volume di distribuzione del farmaco 1.Dipende anche dal rapporto saliva/plasma 2.Dipende dal pH Generalmente valuta le ore dopo la somministrazione. Per la cocaina ad es. valuta le ore dopo somministrazione orale ed è rilevabile anche per 2-5 gg Via di entrata della sostanza nella matrice Risultati e cut-off VantaggiSvantaggiPossibili adulterazioni e.v. assorbimento oralmente intranasale fumo etc… si valuta il farmaco in saliva perché la sua azione farmacologica dipende dalla frazione libera di farmaco nel plasma (non legata alle proteine seriche). Questa frazione è normalmente escreta dalla ghiandola salivare nella saliva. Correlazioni siero/saliva per morfina 1/3 che nel siero. Basse concentrazioni di droga in relazione alla assunzione di droga stessa, fatta eccezione che per l ’ alcool. Limite di sensibilità del saggio GC/MS 1 ng/ml per tutti gli analiti (cocaina, ecgonina metilestere, etc…) cut-off: impiegati generalmente quelli del sangue 1.non invasività del prelievo. 2.facilità di prelievo ripetuti nel tempo. 3.possibilità di quantizzare la frazione libera del farmaco. 4.non sempre, ma spesso relazionabile con le concentrazioni di sangue ed urine. 5.matrice meno deplorevole rispetto alle urine di maggior impiego. 1.necessità di tecniche analitiche sensibili per farmaci a piccole concentrazioni 2.concentrazioni molto inferiori a quelle urinarie. 3.alterazione della concentrazioni salivare di un farmaco nei casi di stimolazione del flusso salivare per la raccolta. 4.soggetto alla differenza di pH della saliva. 5.la sostanza ha una permanenza in matrice limitata, relazionabile a quella presente nel sangue. Facilmente adulterabile, soprattutto per contaminazione orale. Dipende dal pH. Rischio di contaminazioni orali, intranasali.

21 Tipo di MatriceVolume campioneSostanze e metaboliti ricercati Test impiegatiTempo medio di rilevamento e picco massimo Le urine Prelievo non invasivo. Si ottiene per minzione. La raccolta deve essere fatta in contenitore sterile; volume mai inferiore ai 40 ml; pH tra 4.6 e 8; temperatura di °C. Con le urine si effettua lo screening generale di ricerca di sostanze d’abuso. Il campione deve essere refrigerato fino al momento della analisi. Viene considerata però matrice deplorevole e facilmente adulterabile. 1.OPPIACEI 2.COCAINA 3.AMFETAMINE 4.CANNABINOIDI 5.BENZODIAZEPINE 6.BARBITURICI 7.ETC.. È matrice di uso comune per la rivelazione di tutto ciò che può essere stato assunto, farmaci e droghe. 1.Ria 2.Emit 3.Eia 4.FPIA 5.Strip EasyCheck 6.ecc. Direttamente su campione urinario 1.GLC 2.HPLC 3.GC/MS Dopo estrazione Dipende dalla emivita del tossico: via di assunzione tipo di farmaco (acido o basico). Volume di distribuzione del farmaco Il tempo di discriminazione dipende anche: Dose Frequenza di utilizzo. Le sostanze possono permanere nelle urine per alcuni giorni. Generalmente il picco massimo di droga si ha nelle 6 ore. Via di entrata della sostanza nella matrice Risultati e cut-off VantaggiSvantaggiPossibili adulterazioni Dal sangue per filtrazione glomerulare. La concentrazione trovata dipende molto anche dal tipo di sostanza ricercata e dal pH delle urine. I risultati ottenuti valutano lo stato acuto Il tempo di rivelazione medio va da 1 a 5 giorni. Cut-off sondati e accettati a livello internazionale. 1.possibilità di campionare grandi volumi. 2.possibilità di analizzare sia le sostanze che i loro metaboliti, anche dopo diversi giorni 3.relazionabile con altre matrici. 4.molte metodiche e test, la impiegano come matrice di elezione. 5.matrice di screening di maggior impiego. 1.scarsa rilevanza clinica nella quantitativa vista la dipendenza da: soggetto, dose, via di somministrazione, tempo di latenza, stato fisiologico dell’individuo, ecc. 2.fornisce un dato di presenza/assenza ma non fornisce indicazioni sulla quantità di dose assunta e sul momento di assunzione. 3.la concentrazione dipende dai volumi urinari. 4.mancanza di correlazione con lo stato psico-fisico del soggetto. Facilmente adulterabile. Assunzione di molti liquidi o sostanze che interagiscono o falsano la concentrazione. Aggiunta di diverse sostanze dopo il prelievo. Per valutare l’idoneità del campione, si può ricorrere alla determinazione urinaria di creatinina del pH e del peso specifico.

22 Tipo di MatriceVolume campioneSostanze e metaboliti ricercati Test impiegatiTempo medio di rilevamento e picco massimo Il sudore Matrice non convenzionale di utilizzo sempre più frequente. Prelievo non invasivo. Viene prelevato da: Ascella. Palmo, Etc… In genere il prelievo viene fatto con un “sweat patch”. Volumi molto piccoli, con concentrazioni di sostanze spesso molto basse. Matrice ottimale vista la sua facile campionatura ed a lungo responso. 1.NICOTINA (cotinina) 2.METADONE 3.OPPIACEI (eroina) 4.COCAINA 5.AMFETAMINE 6.CANNABINOIDI 7.BENZODIAZEPINE 8.BARBITURICI 9.PCP 10.ALCOOL 11.ETC.. È matrice di uso comune per la rivelazione di tutto ciò che può essere stato assunto, farmaci e droghe. 1.Ria 2.SPME 3.DrugWipe 4.GC/MS dopo estrazione 5.LC/DAD 6.LC/MS 7.etc… Problematica la valutazione del picco massimo. Generalmente si studia la concentrazione in un certo tempo (es. 1 settimana). Alcuni studi compiuti su volontari ci indicano che la concentrazione di cocaina dopo somministrazione sottocute, ha un picco dopo 2 ore, ed è rilevabile fino al 3° giorno. Via di entrata della sostanza nella matrice Risultati e cut-off VantaggiSvantaggiPossibili adulterazioni Dal flusso sanguigno: 1.e.v. 2.assorbimento: - gastrointestin., - polmonare, - cutaneo. Si rileva il 10% della cocaina. Deve essere fatto un prelievo entro 2 ore ai fini della rivelazione di cannabis. Il cut-off per la cocaina considerato in diversi studi è > 15ng/puff. La sensibilità dei test su sudore per: amfetamine 92% cocaina 67% oppiacei 62% 1.matrice molto studiata negli ultimi anni. 2.si ritrova generalmente in studi comparati con la saliva. 3.impiegata anche in test “road side”. 4.esistono diversi studi che indicano la correlazione tra sudore e plasma o urine per l’abuso di amfetamine. In tutti si indica la possibilità da parte di test di screening di discriminare MDMA e HMMA la dove esiste una reale positività in sangue e urine (impiegando il “Drugwipe”). 1.volume molto basso: piccole concentrazioni dipendenti per lo più dal soggetto. 2.la concentrazione dipende molto dalle caratteristiche del soggetto, dalla sua temperatura e da altri fattori specifici del campionamento 3.la sostanza ha una permanenza in matrice piuttosto lunga ma a concentrazioni basse 4.difficoltà, in alcuni casi, alla raccolta. 5.facile inquinamento ambientale del patch e possibili adulterazioni del campione. 6.poca relazionabilità con le altre matrici. Facilmente adulterabile. Molti falsi (+) e (-) dovuti al maneggiamento errato del “patch”. Dipendenza con la temperatura del soggetto, ad esempio: all’ aumento della T, aumenta la produzione di sudore e quindi migliora il campionamento. Facile inquinamento ambientale. Volumi non ben quantificabili. Dipendenza con il tempo di permanenza del “patch” sulla cute.

23 Tipo di MatriceVolume campioneSostanze e metaboliti ricercati Test impiegatiTempo medio di rilevamento e picco massimo Le unghie Matrice di nuovo impiego (anche se per avvelenamento impiegata già nell’800) Crescita media dell’unghia 0.1 mm/giorno. L’unghia normale di un soggetto adulto si rinnova in circa 4 mesi (crescita media mm/settimana). L’unghia grande del piede si rinnova totalmente in 12 mesi (variabilità soggettiva elevata). Prelievo non invasivo su vivente (taglio). 1.AMFETAMINE: 3-4 metilendiossi amfetamina. 3-4 metilendiossi metamfetamina. 1.COCAINA: (che ritroviamo in quantità di 2-10 volte maggiore della benzoilecgonina) 1.CANNABINOIDI 2.etc. 1.Ria (su cocaina), ma risente nella incorporazione, della natura liofila e dello stato di ionizzazione della droga 2.GC/MS Il tempo di rilevamento va da soggetto a soggetto. La crescita di 1-2 cm al mese, in modo discontinuo, fa si che non sia possibile definire un ben preciso tempo medio. Analogamente è impossibile poter definire un picco massimo di incorporazione. Via di entrata della sostanza nella matrice Risultati e cut-off VantaggiSvantaggiPossibili adulterazioni 1.dalla lunula per via circolatoria e conseguente incorporazione. 2.dal letto dell’unghia (radice ungueale) per diffusione alla stessa. 3.esposizione alla contaminazione esterna ed a fluidi biologici dal margine libero (sudore, sebo, saliva, urine…) E’ da ricordare che durante l’accrescimento la droga può essere incorporata continuamente o come singolo evento. I risultati ottenuti sono in grado di dare una discriminazione di presenza/assenza di droga nella matrice (per lo più positività di tipo qualitativo), ma vista la possibile differenziazione di crescita ed i numerosi fattori di influenza, non è possibile fornire un risultato che dia notizie chiare su come e quando si è fatto uso di droga, e se in maniera occasionale oppure in modo continuo. Ricordiamo la difficile relazionabilità con altre matrici. 1.facilità di stoccaggio 2.stabilità del campione 3.discrimino droghe per mesi e/o anni. 1.contaminazione ambientale 2.fattori di variabilità: età (più lento accrescimento nell’anziano; nel neonato in 6-8 settimane si rinnova) sesso ereditarietà ambiente differenza di crescita individuale 3.non proprio chiara la incorporazione del farmaco Da ricordare primo fra tutti l’inquinamento ambientale sotto unghia (soprattutto delle mani) in tal caso è utile ad esempio prelevare quelle dei piedi meno soggette ad inquinamento.

24 Tipo di matriceVolume campioneSostanze e metaboliti ricercati Test impiegatiTempo medio di rilevamento e picco massimo I peli del corpo Matrice di nuovo impiego, apparentemente simile al capello. Prelievo non invasivo. Si attua in soggetto vivente per taglio a livello della cute. La grammatura di campione varia a seconda del metodo impiegato. Si parla di peli pubici, ascellari, barba, baffi etc… 1.COCAINA (cocaina e benzoilecgonina) 2.OPPIACEI (morfina e monoacetilmorfina) 3.AMFETAMINE (amfetamina, metamfetamina, MDMA, MDE) 4.METADONE (metadone, metadone metabolita) 5.CANNABINOIDI THC, THC carbossilato) 6.CODEINA 7.etc…. Gli stessi che per il capello. oRIA oEMIT oFPIA oHPLC oGC/MS in SIM Dopo lavaggio dei peli sminuzzati, estrazione e derivatizzazione Il tempo di rilevamento riguarda la lunghezza che per il pelo ha una fase di crescita di circa sei mesi e poi si ferma. Abbiamo quindi una discriminazione a lungo termine. La maggior parte dei peli vengono cambiati ogni circa 1 anno, con crescita controllata. Impossibile definire un picco massimo. Sembra comunque che la sostanza appaia già nel pelo dopo poche ore dalla somministrazione.. Non è da dimenticare la possibile contaminazione esterna. Via di entrata della sostanza nella matrice Risultati e cut-off VantaggiSvantaggiPossibili adulterazioni 1.diffusione dalla circolazione sanguigna e immagazzinamento. 2.escrezione in sudore dalla cute che bagna i peli. 3.per mezzo di una matrice oleosa proveniente dal follicolo del pelo stesso. 4.per contaminazione ambientale. Come per il capello. I risultati ottenuti sono di natura qualitativa e quantitativa. I peli ascellari sembrano fermare la loro crescita al raggiungere 5- 6 cm. 1.prelievo non invasivo 2.minore potenziale di inquinamento 3. facilità di prelievo 4.livelli di droga sono maggiori nei peli pubici quindi nel capello ed infine nei peli ascellari. 1.falsi (+) e falsi (-) per assorbimento dall’ambiente. 2.% di crescita non costante per cui influenza l’incorporazione del farmaco (analisi non affidabile come sul capello). 3.difficoltà nel determinare il tempo di discriminazione. 4.scarsa correlazione con il capello a causa della crescita più veloce e del minor contatto con il sudore del capello. Contaminazione esterna, anche da parte delle urine.

25 Tipo di MatriceVolume campioneSostanze e metaboliti ricercati Test impiegatiTempo medio di rilevamento e picco massimo I capelli Matrice di nuovo impiego ma già sondata a lungo negli ultimi anni. Prelievo non invasivo in soggetto vivente (per taglio a livello della cute). La grammatura di campione varia a seconda del metodo impiegato anche se generalmente se ne prelevano 100 mg (range di prelievo mg). Il campione viene prelevato dalla regione occipitale o nuca. 1.COCAINA (cocaina e benzoilecgonina) 2.OPPIACEI (morfina e monoacetilmorfina) 3.AMFETAMINE (amfetamina, metamfetamina, MDMA, MDE) 4.METADONE (metadone, metadone metabolita) 5.CANNABINOIDI THC, THC carbossilato) 6.CODEINA oRIA oEMIT oFPIA oHPLC oGC/MS in SIM dopo lavaggio dei capelli sminuzzati, estrazione e derivatizzazione Il tempo di rilevamento riguarda la lunghezza del prelievo di capelli. La crescita difatti è di circa 0.35 mm al giorno con una variabilità di sesso (maggiore nelle donne). Abbiamo discriminazione a lungo termine: mesi e anni. Impossibile definire un picco massimo anche se la concentrazione di sostanza decresce lungo il capello. Via di entrata della sostanza nella matrice Risultati e cut-off VantaggiSvantaggiPossibili adulterazioni 1.diffusione dalla circolazione sanguigna e immagazzinamento. 2.escrezione in sudore dalla cute che bagna i capelli. 3.per mezzo di una matrice oleosa proveniente dal follicolo del capello stesso. 4.per contaminazione ambientale. I risultati ottenuti sono di natura qualitativa e quantitativa. Vanno indicati come ng di xenobiotico/mg capelli. Alcuni cut-off (ng/mg): 6MAM: 10 consumo alto COCAINA: 20 consumo alto Principali fattori di variabilità: meccanismi incorporazione; natura legame droga/matrice; stato solido e disomogeneità del capello; velocità di crescita capelli; pigmentazione: nel capello biondo si ha minore concentrazione di droga rispetto al capello scuro. Inoltre varia con: età, luogo di prelievo, tipo di droga. 1.prelievo non invasivo. 2.scarso potenziale di inquinamento. 3.il farmaco rimane all’interno del capello per un tempo indefinito. 4.facilità di prelievo. 5.ripetibilità del dato in caso di eventuali conferme. 6.monitoraggio farmaci assunti. 7.possibilità differenziazione assuntori leggeri, moderati, pesanti 1.difficile interpretazione del dato analitico. 2.variabilità cinetica di incorporazione dei farmaci dovuta alla velocità di crescita del capello. 3.falsi (+) e falsi (-) per assorbimento dall’ambiente. 4.non esistono metodiche standardizzate sia per il prelievo che per l’estrazione della matrice e cut-off fissi. 5.mancanza di standard di riferimento. 6.pochi kit commerciali per l’analisi del capello. 7.concentrazione maggiore alla radice rispetto al fusto 8.Scarsa correlazione pelo/capello Risente dell’uso di: sbionditura tinta permanente particolari detergenti.

26 Biologia del capello

27 Diagramma di incorporazione delle droghe di abuso nei capelli

28 Idoneità del campione (es. capelli) Idoneità del campione (es. capelli) Modalità di Raccolta dei capelli epidermide cm 0 3 6

29 Sostanze identificate Contenuto di informazione composto immodificato (es. cocaina, THC) ++ metaboliti specifici (es. 11OH-THC, 6-acetilmorfina, benzoilecgonina) +++ metaboliti non specifici (es. morfina) + Individuazione degli Analiti

30 Catena di custodia: Catena di custodia: processo atto a garantire processo atto a garantire AUTENTICITÀ, AUTENTICITÀ, INTEGRITÀ INTEGRITÀ TRACCIABILITÀ TRACCIABILITÀ del campione dal prelievo allo smaltimento del campione dal prelievo allo smaltimento Controcampione (per eventuale analisi di revisione) Controcampione (per eventuale analisi di revisione) Modalità di Raccolta del Campione

31 Preparazione del campione correzione del pH omogenizzazione deproteinizzazione filtrazione e/o centrifugazione idrolisi aggiunta s.i.


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