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Frazionamento di un lisato cellulare tramite CENTRIFUGAZIONE Capitolo 3 Centrifugazione preparativa e analitica.

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Presentazione sul tema: "Frazionamento di un lisato cellulare tramite CENTRIFUGAZIONE Capitolo 3 Centrifugazione preparativa e analitica."— Transcript della presentazione:

1 Frazionamento di un lisato cellulare tramite CENTRIFUGAZIONE Capitolo 3 Centrifugazione preparativa e analitica

2 1. Centrifugazione preparativa Centrifugazione analitica è utilizzata principalmente per gli studi di macromolecole purificate o di complessi sovramolecolari isolati 2. Ultracentrifugazione analitica Centrifugazione preparativa permette di separare i vari elementi di un omogenato cellulare

3 Centrifughe Centrifughe preparative Centrifughe da tavolo Massimo volume di carico: 24 microprovette da ml 1,5/2.0 Massima velocità (RPM): Massima accelerazione centrifuga Centrifuga tipo sorvall

4 Ultracentrifuga analitica Puo’ operare a velocita’ di rpm ( g) Il rotore e’ contenuto in una camera blindata, refrigerata e sottovuoto. Il rotore è fatto in un materiale particolarmente resistente Es. TITANIO La sedimentazione è controllata da un sistema ottico per consentire l’ osservazione del materiale che va sedimentandosi

5 Ultracentrifugazione analitica viene utilizzata per determinare: -il grado di purezza di una macromolecola -la massa molecolare relativa di soluti nel loro stato nativo -le costanti di affinità tra ligandi e proteine -esaminare i cambiamenti di massa molecolare relativa di complessi sovramolecolari - studiare i cambiamenti conformazionali

6 Rotore Verticale Centrifugazione isopicnica Rotore ad angolo fisso separazione differenziale Rotore a bracci Oscillanti Centrifugazione isopicnica massima risoluzione delle bande Tipi di rotori Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

7 Che cosa è il campo centrifugo?

8 CAMPO CENTRIFUGO: Una qualsiasi particella che viene fatta ruotare all’interno di un rotore da centrifuga avrà una velocità di sedimentazione che sarà pari al campo centrifugo G applicato G =   r  velocita’ angolare del rotore espressa come 2  rad r = distanza radiale (cm) della particella dall’asse di rotazione Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

9 Una rivoluzione del rotore e’ pari a 360°= 2rev min -1 =2r.p.m. la velocita’ angolare (   del rotore si può esprimere come velocità del rotore in giri al min= rev min -1 =r.p.m. 2 r.p.m. 60 da cui la velocità angolare rad sec -1  = Campo centrifugo G =   r = 2 r.p.m. 60 r = distanza radiale della particella dall’asse della rotazione espressa in cm 4    r.p.m.) r 2 = r

10 RCF = rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo e il peso della particella in presenza della sola forza di gravita’ Campo centrifugo relativo (RCF) RCF =G =   r = 4    r.p.m) 2 r 3600 x 981 gg = = 1.12x10 -5 r.p.m 2 r RCF= = 1.12x10 -5 r.p.m. 2 r campo gravitazionale terrestre g = 981 cm s -2 si esprime in g = il rapporto tra campo centrifugo G, a uno specifico raggio, e la velocità all’accellerazione normale g=981

11 Le centrifughe sono provviste di NOMOGRAMMA che permettono di trasformare r.p.m in g Forza centrifuga relativa Distanza radiale (mm) RCF (xg) NOMOGRAMMA Velocità del rotore (r.p.m) Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

12 Una volta stabilito che cosa è il campo centrifugo Ci interesserà sapere quali leggi governano la sedimentazione Di una particella in quel determinato compo centrifugo relativo

13 Una miscela di particelle eterogenee, approssimativamente sferiche, può essere separata mediante centrifugazione, in base alla : 1. densità 2. dimensione delle particelle, 3. tempo di sedimentazione, 4. livello di sedimentazione raggiunto dopo un periodo di tempo definito..

14 La velocita’ di sedimentazione di una particella e’ proporzionale alle sue dimensioni, alla differenza tra le densita’ di particella e mezzo e al campo centrifugo applicato La velocita’ di sedimentazione dipende anche dalla forma della particella : una particella allungata offre maggior attrito rispetto ad una con la stessa massa ma di forma globulare quindi le particelle allungate sedimentano piu’ lentamente =2r p 2 (  p  m )   r 9   = coef. di viscosita’ del mezzo  p  densita’della particella  m=densita’ del mezzo r p=raggio della particella Legge di STOKES

15 La velocita’ di sedimentazione di una particella disciolta in una soluzione dipendera’ non solo dal campo centrifugo applicato ma anche dalla: 1.massa della particella In sommario: 2.Densita’ e viscosita’ del solvente in cui avviene la sedimentazione e 3.dalla sua forma (sferica o allungata) Quando si riportano le condizioni per la separazione di particelle bisogna quindi specificare: 1)la velocita’ del rotore, 2)dimensioni dell raggio (o tipo di rotore) 3)tempo di centrifugazione

16 Coefficienti di sedimentazione Il coefficiente di sedimentazione s È dato dalla velocità di sedimentazione v su campo centrifugo G applicato s = v/ G = v/    r E’ espresso in secondi e dipende dalla 1)temperatura 2)densita’ 3)viscosita’ del mezzo Per convenzione si usa esprimere il coefficiente di sedimentazione trovato sperimentalmente in quel valore che si otterrebbe in un mezzo la cui viscosita’ e densita’ fosse pari all’ acqua a 20°C

17 Coefficienti di sedimentazioni standard = Svedberg units 1unita’ Svedberg = sec Es. 5S RNA =5x sec vescicole xg unita’ Svedberg Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

18 Segue…CENTRIFUGAZIONE

19 Frazionamento cellulare ~2µm = GFP-Sec2p DAPI Nuclei (P1) Apparato del Golgi (P2) Vescicole secretorie (P3)

20 Centrifugazione differenziale e’ la sedimentazione successiva di particelle aventi dimensione e densità diverse P1 LT P2 S1 S2 P3 S1S2 500g35000g 10g

21 P1 S1 LT P2 S2 Lisato P1 S1 S2 P2P3 S3 6500g 13000g Es. schematico di centrifugazione differenziale di un lisato cellulare: PM, Nucleo Mitocondri ER, Golgi Vescicole ER, Golgi Membrane frammentate g

22 CE from wt cells expressing GFP-Mlc1p P1/ S1= 6.250xg P2/ S2 = xg P3/ S3= xg Pdr5p : PM protein Sec61p :ER +Golgi protein Sec4p : vesicles and cytosol Centrifugazione differenziale di GFP-Mlc1p e Sec4p Esempio di

23 Centrifugazione in gradiente di densita’: Tecnica zonale di velocita’ e isopicnica 1. Nella tecnica zonale di velocita’ le particelle si separano principalmente per differenza di dimensioni, perchè particelle biologiche di tipo simile sono spesso simili in forma e la loro densita’ rientra in una gamma ristretta. 2.Nella tecnica isopicnica: la separazione dipende dalla densita’ idrostatica delle particelle e non dalla forma ne’ dalla dimensione ed e’ indipendente dal tempo: Questa tecnica viene utilizzata per separare particelle di dimensioni simili ma di diversa densita’

24 Materiali usati per la formazione dei gradienti La scelta del soluto dipende dalla natura delle particelle da separare Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

25 Separazione di velocita’ su gradiente di densita’ Particelle a bassa densita’ Particelle ad alta densita’ GRADIETEGRADIETE Campo centrifugo campione Il campione viene fatto stratificare su un gradiente pre-formato la cui densita’ massima non deve superare quella delle particelle piu’ dense da separare Separazione isopicnica zonale di velocità: la corsa deve essere terminata prima che le particelle raggiungano la base del tubo Nota: Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma dimensioni simili non sono ben separati con questo metodo

26 Centrifugazione isopicnica all’equilibrio Il gradiente non è preformato ma si genera durante la centrifugazione Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma dimensioni simili sono separati con questo metodo

27 Centrifugazione isopicnica con metodo dell’isodensita’ all’equilibrio Campione +mezzo Particelle a bassa densita’ Particelle ad alta densita’ La centrifugazione va fatta all’equilibrio (densita’ idrostatica = a quella dell gradiente) Il campione viene mescolato con il mezzo del gradiente GRADIETEGRADIETE Campo centrifugo Il gradiente si forma durante la centrifugazione

28 Centrifugazione isopicnica con metodo all’equilibrio GRADIETEGRADIETE Campo centrifugo Particelle a bassa densita’ Particelle ad alta densita’ campione Il campione viene stratificato sotto (o sopra) il gradiente la cui densita’ massima deve superare quella delle particelle piu’ dense da separare Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma dimensioni simili sono separati con questo metodo TEMPO di centrifugazione La centrifugazione va fatta all’equilibrio (densita’ idrostatica = a quella del gradiente)

29 wt cells expressing GFP-Mlc1p Sucrose Velocity gradient Esempi di

30 wt cells expressing GFP-Mlc1p Density gradient Esempi di frazioni Cellule wt +GFPMlc1p Gradiente di saccarosio

31 Metodi di determinazione della concentrazione di proteine nel lisato cellulare Paragrafo 8.3.2

32 Metodi colorimetrici: La soluzione proteica reagisce con un reagente che da luogo ad un prodotto colorato. La quantita’ del prodotto viene quindi determinata allo spettrofotometro. Con appropriata calibratura si correla l’ intensita’ della colorazione alla quantita’ della proteina Metodi colorimetrici : Metodo di Lowry, BCA e Bradford.

33 Metodo di Bradford Questo metodo si basa sul legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine (non molto accurato, poco sensibile 20g/cm 3 ) E’ basato sull’ immediato shift di assorbimento da 465nm a 595 nm che occorre quando il colorante Comassie Brilliant blue G-250 si lega alle proteine in soluzione acida. Protein + Comassie brilliant blue Protein Dye complex (acidic, A465nm) (A595nm) Si assume che il colorante si leghi alla proteina via attrazione elettrostatica dei gruppi acidi sulfonici del colorante. Gli studi sul meccanismo della formazione di questo complesso suggeriscono che la forma anionica del colorante e’ la specie che complessa con la proteina. Questa interazione causa lo shift di assorbimento con un picco a 595nm

34 Metodo di Lowry: rileva quantitativi proteici inferiori a 10µg/cm 3. Schema di reazione Lowry modificato = prodotto +stabile Proteine+Cu + OH - complesso tetracoordinato-Cu +1 + Folin fenolo+ Acido Fosfomolibdenico / fosfotugstenico complesso colorato Blu A 750nm Interference.: con tamponi Tris, e zwitterionici (PIPES, HEPES) o contenenti EDTA Le proteine si fanno reagire con una soluzione alcalina contenente solfato di rame in presenza di tartrato (reagente di Folin: tugstato, molibdato e fosfato di sodio) si sviluppa un colore blu porpora che assorbe ad un massimo di A 660nm

35 Assorbimento della luce ultravioletta: utile per piccole quantita’ di proteine e per riutilizzare il campione (sensibilita’ fino a 10  g/cm 3 ) I residui aromatici della tirosina e triptofano hanno un assorbimento max a 280nm. In una miscela complessa si puo’ calcolare con buona approssimazione che una soluzione con A 280 = 1.0 (considerando 1cm di percorso) abbia una concentrazione proteica di circa 1mg/cm 3 Attenzione : questo metodo e’ soggetto ad interferenza. es.: anche gli acidi nucleici assorbono a 280nm 1 Fattore di correzione: Proteine mg/cm 3 =1.55A A 260

36 2 Misurazione dell’ assorbanza dei legami peptidici a nm. Questo metodo ha una sensibilita’ maggiore fino a >1  g/cm 3. Nota che: I legami peptidici assorbono ad un massimo di 190nm ma gli spettrofotometri hanno scarsa resa a queste lunghezze d’onda applicazioni : FPLC= Fast Protein liquid chromatography HPLC= High Performance Liquid Chromatography

37 METODI DI FRAZIONAMENTO delle proteine Paragrafo 8.3.4

38 Frazionamento stabilità : -denaturazione tramite temperatura Frazionamento per solubilità e/o idrofobicità :- -Sali, -solventi organici, -punto isoleletrico, Frazionamento per carica: -colonne a scambio ionico

39 Fattori che diminuiscono la stabilità delle proteine: -Temperatura -Congelamento -Scuotimento -pH dei buffer di solubilizzazione -Ossidazione -Presenza di metalli come co-fattori -Sali Frazionamento per STABILITA’

40 SOLUBILITA’ differenziale delle proteine Può essere un criterio di purificazione di proteine da una miscela complessa Precipitazione delle proteine meno solubili Precipitazione delle proteine più solubili Precipitazione della proteina d’interesse Pag Figures from:http://biotecnologie.unipr.it/didattica/att/5cc0.file.doc

41 Frazionamento per solubilità e/o idrofobicità Precipitazione delle proteine -Precipitazione con Sali -Precipitazione con Solventi organici -Precipitazioni con PEG

42 Perche’ in presenza di sali o metanolo le proteine precipitano? quindi la loro solubilita’ sara’ diversa in presenza di concentrazioni diverse di sali o solventi organici. Le proteine differiscono nel numero di gruppi polari esposti al solvente Precipitazione della proteina d’interesse % del solvente

43 Una proteina e’ solubile in acqua fintanto che i gruppi carichi sono solvatati da molecole di acqua e i gruppi idrofobici sono mantenuti all’ interno della proteine. I gruppi idrofobici sono rivolti verso l’interno I gruppi idrofilici sono rivolti verso l’esterno. Questo permette interazioni dipolari con il solvente H O- H + +

44 In una soluzione acquosa contenente proteine e sali.. Se si aumenta la concentrazione di sali le molecole libere di H 2 O che possono solvatare gli ioni salini diminuiscono. Le prime molecole di H 2 O che si rendono disponibili a questo punto sono quelle che si trovano intorno ai gruppi idrofobici delle proteine poiche’ le altre sono impegnate con interazioni elettrostatiche con i gruppi polari delle proteine e quindi sono piu’ difficilmente cedibili. PRECIPITAZIONE CON SALI

45 I gruppi idrofobici sono rivolti verso l’interno I gruppi idrofilici sono rivolti verso l’esterno. H O- H + +H H + +H H + +H H + +H H + + Na+-Cl- al crescere della concentrazione salina i gruppi idrofobici delle proteine vengono scoperti

46 Questi frammenti idrofobici esposti causano l’ aggregazione delle proteine e a seguito di interazioni idrofobiche che e causano la precipitazione delle proteine o ‘ salting out ’. Naturalmente più la proteina contiene tratti idrofobici e’ piu’ risultera’ insolubile a basse concentrazioni saline (e vice versa). Precipitazione delle proteine meno solubili Precipitazione delle proteine più solubili Precipitazione della proteina d’interesse Schema di percipitazione in presenza di Ammonio solfato

47 In una soluzione acquosa contenente solventi organici (metanolo, etanolo, butanolo, acetone) le molecole di acqua si dispongono a idratare le molecole di solvente organico. L’ acqua di solvatazione viene quindi rimossa dai gruppi carichi e polari sulla superficie delle proteine. I gruppi carichi delle proteine vengono quindi scoperti e le proteine si aggregano per formazione di interazioni ioniche tra le molecole proteiche. PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI

48 I gruppi carichi delle proteine vengono quindi scoperti e le proteine si aggregano per formazione di interazioni ioniche tra le molecole proteiche Igruppiidrofobicisono rivolti verso l’interno Igruppiidrofilicisono rivolti verso l’esterno. H O- H + + H O- H + + H O- H + + H O- H + + H O- H + + H O- H + + H O- H + + H O- H + +

49 Di conseguenza le proteine presenti in una soluzione acquosa contenente solventi organici precipitano H O- H + + H O- H + + H O- H + + H O- H + + in ordine decrescente a seconda del numero di gruppi carichi presenti sulla loro superficie e in misura maggiore man mano che aumenta la concentrazione del solvente

50 IlPEG e’un polimero organico che precipita le proteine con un meccanismo simile a quello dei solventi organici richiede concentrazionipiu’basse per precipitare le proteine e ha minorprobabilita’di determinare la lorodenaturazione. PEG puo’ essere usato Poly(ethylene glycol) (PEG): HO-(CH 2 CH 2 O) n CH 2 2 -OH 1. perguidareleproteineeacidinucleiciaformarecristalli. 2.Perpurificazioni proteiche:PEG +destrano+ buffer--> e’ unsistemabi- fasicoutile perospitaremateriali biologici 3.peraiutarelafusione cellulare. IlPEGinteragiscecon le membrane cellulari, a unprocesso chiave usatoinbiotecnologia. 4.Illegamecovalentedel PEGalleproteinedaconiugatichenonsono"- immunogenici" eantigenici=usoinvaccini. 5.Illegame covalentedel PEG asuperficieretardal’assorbimento delle proteineaqueste superfici

51 Frazionamento per dimensioni: -centrifugazione, -cromatografia a settaccio molecolare, Frazionamento per affinità : Co-immunoprecipitazione utilizzando interazione tra antigene-anticorpo colonne di affinità per cofattori Altri metodi di frazionamento delle proteine


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