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FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Individuazione della causa di malattie e monitoraggio del decorso DIAGNOSTICA.

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1 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Individuazione della causa di malattie e monitoraggio del decorso DIAGNOSTICA MOLECOLARE Tecniche a disposizione: -“Southern blot”, “Northen blot”, digestione enzimatica, sequenziamento - PCR

2 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SOUTHERN BLOT

3 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE i.e., your cloned gene(s) We could just 35,000 Northern to monitor expression of all genes!!! mRNAs separated on gel according to size mRNAs transferred to a membrane and hybridized with small number (1-5) of radioactively labeled DNA probes. Probe corresponds to gene of interest Target RNA is spatially fixed and the labeled probe is in solution Low throughput Northern Blot

4 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Rompendo il DNA in corrispondenza del sito di restrizione, gli enzimi di restrizione possono determinare la formazione di frammenti di dsDNA con estremità “piatte” (A) o “coesive” (B): ENZIMI DI RESTRIZIONE

5 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE L’uso sequenziale di appropriati enzimi di restrizione e ligasi permette di tagliare ed incollare (“cut and paste”) catene di dsDNA allo scopo di isolare le sequenze geniche di interesse ed ottenere costrutti genici che le includono. DNA LIGASI

6 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SOUTHERN BLOT Consente l’inidividuazione di alterazioni genetiche : - estrazione di DNA intatto - digestion - separazione mediante mobilità elettroforetica - blotting e rivelazione Applicazioni: meccanismi patologici, indagine prenatale, settore oncologico

7 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE L’estrema importanza in biologia molecolare della PCR è determinata da due fattori principali: - E’ possibile ottenere fattori di amplificazione (rapporto fra copie di dsDNA prodotte e sequenze dsDNA target originali) elevatissimi, anche dell’ordine di La reazione di amplificazione è specifica: scelta adeguata di “primers” -Applicazioni in: Genetica, microbiologia e virologia, medicina forense, oncologia. REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) PCRamplificazione DNA (singola molecola) Moltemolecole

8 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Schema della PCR DNA RNA DNA Estrazione del DNA o DNA o RNA dal campione Rivelazione Amplificazione Reverse transcription

9 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE LIMITI DI RIVELABILITA’ DELLA PCR

10 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Campioni di DNA adatti per l’identificazione possono essere ottenuti da svariate fonti: - gomma da masticare - francobolli - capelli (devono però avere la radice intatta) - spazzolini da denti - lamette di rasoio - mozziconi di sigaretta -qualsiasi campione biologico, anche notevolmente degradato Tali test sono utilizzati per scopi quali test di paternità o per verificare l’identità di un soggetto, nonché per usi in campo forense. Il costo per l’ottenimento di un profilo del DNA contenuto in un campione è dell’ordine di €. CAMPIONI PER PCR

11 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Rivelazione del prodotto amplificato: elettroforesi,sonde geniche RIVELAZIONE DEL PRODOTTO DELLA PCR

12 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE FASI POST-PCR ed ORGANIZZAZIONE LABORATORIO PCR Controlli: verifica della specifictà e della sensibilità della reazione e dell’ eventuale presenza di falsi positivi o negativi. Organizzazione del laboratorio: Elettroforesi su gel Analisi di restrizione Tecniche d’ibridazione AREA PRE-PCRPreparazione del campione Separazione del siero Isolamento dei linfociti periferici Lisi cellulare Estrazione acido nucleico Preparazione della reazione Preparazione del tampone Preparazione aliquote dei reagenti Allestimento della reazione Rivelazione del prodotto AREA POST-PCR

13 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE La PCR in situ permette di combinare lo studio della localizzazione cellulare mediante ibridazione in situ con l’estrema sensibilità dell’amplificazione SCCP ( single strand conformational polymorfism) PCR “in situ”

14 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE APPLICAZIONI DELLA PCR Diagnosi d’infezioni batteriche e virali: Tecniche classiche : 1) Isolamento in coltura 2) Identificazione mediante anticorpi Diagnosi cliniche di malattie causate da mutazioni Controllo efficacia terapie anti-cancro

15 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Le tecniche PCR presentano definiti vantaggi quando applicate alla diagnostica di infezioni virali o batteriche permettendo di superare alcune limitazioni delle tecniche diagnostiche convenzionali, quali: -tecniche di coltura -metodi immunometrici Es: diagnosi da infezione da immunodeficienza acquisita (HIV) La PCR (qualitativa e quantitativa) permette la diagnosi precoce e la valutazione della terapia antivirale La PCR rappresenta un importante strumento diagnostico s: -valutare patologie virali non diversamente diagnosticabili -Monitorare l’andamento della malattia -Valutazione di variazioni nel genoma virale PCR: diagnosi di infezioni virali o batteriche

16 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Diagnosi di neoplasie maligne Per quanto riguarda la diagnosi di neoplasie maligne, le tecniche di biologia molecolare hanno portato alla identificazione e caratterizzazione di numerosi elementi genetici (oncogeni, geni oncosoppressori, ecc.) coinvolti nell’evoluzione delle malattie neoplastiche. Le tecniche di PCR quantitativa possono essere invece utilizzate per valutare il grado di amplificazione di un oncogene (numero di copie presenti nel genoma delle cellule neoplastiche), comunemente considerato un indice prognostico sfavorevole. PCR: applicazioni in campo oncologico

17 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Diagnosi molecolare di malattie genetiche La PCR permette di fare: - diagnosi (prenatale e asintomatica) - prevenzione PCR: diagnosi di malattie genetiche

18 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Diagnosi molecolare di malattie genetiche Identificazione di mutazioni note Per la diagnosi simultanea di un numero elevato di mutazioni, si utilizzano approcci “multiplexed” basati su micropiastra o microarray, nei quali sonde complementari per il legame delle varie possibili sequenze mutate vengono immobilizzate in differenti posizioni di un supporto solido. Identificazione di mutazioni non note. Le tecniche PCR possono essere utilizzate anche per l’identificazione e la caratterizzazione di eventuali mutazioni non note, o eventualmente per la diagnosi di mutazioni talmente rare che non sono disponibili (o non è conveniente sintetizzare) sonde specifiche. La PCR nella diagnostica

19 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Le caratteristiche intrinseche della PCR limitano la sua applicazione quando è richiesta una accurata valutazione quantitativa della sequenza target: la quantità di prodotto ottenuto dipende infatti anche da fattori non facilmente controllabili (es. presenza di inbitori).. L’importanza applicativa di una PCR quantitativa è però talmente elevata che sono state sviluppate diverse metodologie che permettono di ridurre questi inconvenienti. PCR QUANTITATIVA

20 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Si effettua l’amplificazione su di una serie di diluizioni seriali del campione, allo scopo di individuare la massima diluizione alla quale l’amplificazione è ancora possibile. -Svantaggi: -Richiede un numero elevato di reazioni di amplificazione per ogni campione -Non tiene conto degli eventuali fattori di variazione interprovetta -Per diluizioni molto elevate la sensibilità della PCR non è sufficientemente alta PCR Fattore di diluizione limite PCR QUANTITATIVA: DILUIZIONE SCALARE

21 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Si basa sulla costruzione di una curva di calibrazione ottenuta amplificando standard a concentrazione nota di sequenza target. n Y Y [dsDNA] iniziale [dsDNA] iniziale crescente - La reazione di amplificazione deve essere interrotta nella fase esponenziale, riducendo così la quantità di amplificato ottenibile - Essendo una calibrazione esterna, non può tenere conto dell’effetto di eventuali inibitori o di altri fattori dipendenti dal particolare campione che si analizza Reazioni interrotte dopo la fase di amplificazione esponenziale n = costante PCR QUANTITATIVA: STANDARD ESTERNO

22 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE La PCR quantitativa non competitiva utilizza uno standard interno: questa tecnica prevede l’amplificazione simultanea all’interno del campione della sequenza dsDNA target e di una sequenza standard aggiunta in quantità nota, ognuna delle quali sfrutta una DIVERSA coppia di “primers”. Vantaggi: le variabili non controllabili legate alle caratteristiche del campione dovrebbero influenzare nello stesso modo le due reazioni di amplificazione. Svantaggi: poiché la reazione deve essere bloccata nella fase esponenziale, differenze nella cinetica ed efficienza di amplificazione per le diverse coppie di “primers” possono modificare il risultato dell’analisi. dsDNA standard (quantità nota) dsDNA target (quantità incognita) PCR Amplificato dello standard Amplificato del target dsDNA standard (quantità nota) dsDNA target Amplificato dello standard Amplificato del target = PCR QUANTITATIVA: PCR NON COMPETITIVA

23 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Anche la PCR quantitativa competitiva utilizza uno standard interno: in questa tecnica la sequenza dsDNA target e la sequenza standard aggiunta in quantità nota vengono amplificate utilizzando la STESSA coppia di “primers” Si costruisce una curva di calibrazione interna: quando le quantità dei due amplificati sono equivalenti, la quantità di dsDNA target iniziale coincide con quella della sequenza standard aggiunta. La misura può essere effettuata anche quando l’amplificazione ha raggiunto il “plateau”. Amplificati della sequenza target e dello standard interno separati mediante elettroforesi su gel PCR QUANTITATIVA: PCR COMPETITIVA target competitore Punto di equivalenza

24 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE La PCR ha quindi applicazioni specifiche nella diagnostica se: - non esistono (o non sono sufficientemente specifici) marcatori sierologici di infezione (antigeni e/o anticorpi) - occorre un risultato molto tempestivo - è richiesta una particolare sensibilità - occorre discriminare ceppi o varianti, oppure identificare diverse specie, non differenziabili con altri sistemi. In particolare questa possibilità può essere importante per studi epidemiologici, allo scopo di confermare o escludere una epidemia da fonte comune sulla base delle differenze genetiche fra i ceppi virali o batterici. - occorre identificale mutazioni responsabili, ad esempio, dell’insorgenza di resistenza alle terapie. La PCR nella diagnostica

25 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE La PCR nella diagnostica

26 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Tecniche di identificazione basate sul profilo del DNA Queste tecniche si basano sul fatto che lo schema delle bande dei frammenti ottenuti dopo l’azione sul DNA di uno o più enzimi di restrizione è, ad eccezione di gemelli identici, unico per ogni individuo. Applicazioni cliniche

27 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE It’s used for accurate quantitation of DNA samples In real time PCR the concentration of a DNA sample is proportional to the amount of fluorescence generated at each round of amplification. It’s based on the detection and quantitation of a fluorescent reporter This signal increases in direct proportion to the amount of PCR product in a reaction. By recording the amount of fluorescence emission at each cycle, it is possible to monitor the PCR reaction during exponential phase where the first significant increase in the amount of PCR product correlates to the initial amount of target template. Real time PCR

28 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE The best method for quantitative detection of the amplicon uses fluorescent probes. The TaqMan probes use the fluorogenic 5' exonuclease activity of Taq polymerase to measure the amount of target sequences in cDNA samples. TaqMan probes are oligonucleotides that contain a fluorescent dye usually on the 5' base, and a quenching dye on the 3' base. When irradiated, the excited fluorescent dye transfers energy to the nearby quenching dye molecule rather than fluorescing (this is called FRET = Förster or fluorescence resonance energy transfer). Thus, the close proximity of the reporter and quencher prevents emission of any fluorescence while the probe is intact. Real time PCR

29 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE L’andamento della reazione di amplificazione viene seguito in tempo reale, e quindi è possibile visualizzare l’accrescimento esponenziale dell‘amplificato permettendo l’analisi simultanea di campioni a contenuto di DNA molto differente La formazione dell’amplificato viene seguita attraverso misure di fluorescenza, attraverso l’impiego di: -Intercalanti fluorescenti del DNA, che permettono la rivelazione del dsDNA (es. SYBR® Green). -“TaqMan probes”, cioè oligonucleotidi in grado di ibridizzare con una regione interna del prodotto dell’amplificazione che portano un tracciante fluorescente in 5’ ed un “quencher” in 3’. Essi normalmente non sono fluorescenti ma quando durante la PCR viene replicata una catena ssDNA alla quale è legata una di queste molecole, l’attività 5' esonucleasica della polimerasi rompe la molecola rendendo possibile la fluorescenza. -“Molecular beacons” disegnati per ibridizzare con una regione interna del prodotto dell’amplificazione. “TaqMan probes” e “molecular beacons” permettono di effettuare PCR multiple (ad esempio è possibile amplificare anche uno standard interno) poiché sono specifici per una data sequenza amplificata (i segnali fluorescenti dei due “probes”possono essere differenziati usando due fluorofori che emettono ad una diversa lunghezza d’onda). PCR “REAL TIME”

30 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Plot di amplificazione PCR cycle number Normalised reporter fluorescence (R n ) E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold Indica il valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato Linea soglia scelta dall’operatore In maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale

31 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Quantitativa assoluta log 10 quantity Ct unknown sample 3500 copies

32 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Quantitativa relativa Plot di amplificazione Numero di cicli CTCT Sample Control

33 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Analisi tramite software

34 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Genomics Gene Sequencing Conventional Karyotyping FISH (Fluorescent in Situ Hybridization) CISH (Chromogenic in Situ Hybridization) CGH (Comparative Genomic Hybridization) SKY (Spectral Karyotyping) Real Time RT-PCR cDNA Microarrays Novel analytical tools

35 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE 2D-PAGE MS (Mass Spectrometry) HPLC (High Performance Liquid Chromatography) CA (Capillary Array) MALDI (Matrix Associated Laser Desorption/Ionisation) MALDI-TOF – MS (Time of Flight) MALDI – ION TRAP- TOF – MS ESI (Electron Spray Ionisation) Tandem – MS Quadrupole Functional proteomics TWO YEAST– HYBRID SYSTEM PROTEIN MICROARRAY FRET (Fluorescence Resonance) SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionisation) TISSUE MICROARRAY Proteomics

36 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Multispot Arrays Sonde (DNA, oligonucleotidi, proteine, anticorpi) Spots sulla superficie di un substrato solido Deposito o sintesi Gene chip, DNA chip, DNA array, Protein chip….. Sonde: antigeni anticorpi cDNA oligonucleotidi prodotti di PCR plasmidi BACs (Bacterial Artificial Chromos.) YACs (Yeast Artificial Chromos.) Substrato: vetro nitrocellulosa nylon vetro rivestito di poliacrilammide polipropilene silicone polistirene Deposito blotting printing elettrodipendente Sintesi in situ meccanica fotolitografica elettrodi printing di precisione deposito sulla superficie tensione-dipendente

37 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Attualmente è possibile costruire dei chips - i vetrini su cui si posizionano gli spots di DNA - contenenti fino a sequenze DNA/cm 2 e fino a oligonucleotidi/cm 2 per studi di trascriptomica Microarray a DNA

38 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Microarray a DNA

39 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Applied Biosystems Human Genome Survey Microarray V2.0 The Applied Biosystems Human Genome Survey Microarray V2.0 contains 32,878 probes for the interrogation of 29,098 genes, making it the most informative and comprehensive genomic coverage of any microarray platform. Access the most comprehensive human genome set available, with probe designs for 2,180 more genes than any other microarray platform. Interrogate more than 8,000 genes not covered by other commercial microarrays. Microarray a DNA Applications Clinical diagnosis Environmental surveillance Industry Food and Agriculture Military Advantages: Speed Feasibility Sensitivity Reproducibility Sample from specific organ to show which genes are expressed Compare samples from healthy and sick host to find gene-disease connection Probes are sets of human pathogens for disease detection

40 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Campione eterogeneo Campione A Campione B Microdissezione Popolazione eterogenea Laser capture microdissection (LCM) Popolazione omogenea Popolazione omogenea

41 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ANALISI PROTEOMICA Possibilità di individuare markers molecolari di tumori (o altre patologie) Siero Proteine Frazionamento Digestione con enzimi proteolitici Peptidi Cromatografia o 2D-PAGE Spettrometria di massa Analisi con algoritmi specifici Sidransky D. Emerging molecular markers of cancer. Nature Cancer Rev 2002; 2:210-9.

42 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE PROTEIN MICROARRAYS (ProteinChip) Sono utilizzati per esaminare: i livelli di espressione delle proteine le interazioni proteina-proteina le interazioni proteina-piccole molecole (farmaci, etc) le attività enzimatiche Page, M. J. et al. Proteomic definition of normal human luminal and myoepithelial breast cells purified from reduction mammoplasties. PNAS 1999; 96:12589–12594.

43 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE PROTEIN MICROARRAYS Esistono due tipi principali di chip: antibody arrays Ab Microarray 500™ - BD Biosciences' Clontech division, Palo Alto, CA > 500 anticorpi per quantificare proteine in lisati cellulari o altri campioni biologici TranSignal Human Cytokine Antibody Array 2.0 (Redwood City, CA) > 21 anticorpi per misurare citochine general protein arrays Yeast ProtoArray™ from Protometrix, Branford, CT, con circa polipeptidi da Saccharomyces cervisiae per monitorare le interazioni proteina-proteina e proteina-piccole molecole (farmaci….) Yeast ProtoArray™

44 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE PROTEIN MICROARRAYS Conrads TM et al. Cancer diagnosis using proteomic patterns. Expert Rev Mol Diagn 3: (2003) Individuazione nuovi biomarkers Siero Proteine Bio-chip SELDI-TOF MS m/z Pattern proteicoRiconoscimento del pattern

45 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Nuovi Biomarkers individuati con il ProteinChip e tecnologia SELDI-TOF-MS TumorekDaNomeAutore Pancreas16.57HIP/PAP-1Rosty et al. Cancer Res 2002; 62: Vescica3.4Alpha-DefensinaVlahou et al. Am J. Pathol 2002; 158: Nasofaringe Serum Amyloid A (SAA) isoformYip et al - AACR 2002 Prostata100PSMAWang et al. Int J. Cancer 2002; 92: Ovaio Frammento di Aptoglobina Transferrina Catena pesante Ig Ye et al. Poster AACR 2002 Rai et al. Arch. Pathol. Lab. Med 2002; 126: “ “ “

46 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Curva di dissociazione Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione

47 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Tm melting peak Curva di dissociazione

48 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Metodi di rilevamento della fluorescenza SYBR Green TaqMan Molecular Beacons Scorpion probe

49 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Il “cocktail” per la reazione PCR contiene: -l’enzima DNA polimerasi, che catalizza la crescita della sequenza complementare ad una sequenza ssDNA nella direzione 5’>3’. -un largo eccesso di due “primers” (corte sequenze di ssDNA specifiche per il legame al dsDNA target – ne occorrono due in quanto devono legarsi alle due estremità 5’ delle catene del dsDNA target). -desossiribonucleotidI trifosfati (dNTPs) -Ioni magnesio -DNA bersaglio COMPOSIZIONE DI UNA REAZIONE DI PCR

50 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE CICLO 2 SCHEMA DELLA PCR copie di dsDNA target CICLO 1 Fasi di un ciclo di PCR: Denaturazione Appaiamento (“annealing”) Estensione

51 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Denaturazione (90-95°C, 1 min) Legame dei “primers” (60°C, 1 min) Sintesi del dsDNA (70-75°C, 1 min) Denaturazione (90-95°C, 1 min) Una copia di dsDNA target cicli di amplificazione in “thermal cycler” TT copie di dsDNA target Rappresentazione schematica del processo PCR.

52 FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE RT-PCR: 1.Isolate RNA (total or polyA) 2.Convert to cDNA (complementary DNA, using the reverse transcriptase) 3.Use the DNA as template for the PCR reaction 4.Visualize fragment on agarose gel Reverse Transcriptase PCR


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