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UV-VIS Dott. Alfonso Zoleo Laboratorio di Metodologie Spettroscopiche per le Biotecnologie AA 2013-2014.

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1 UV-VIS Dott. Alfonso Zoleo Laboratorio di Metodologie Spettroscopiche per le Biotecnologie AA

2 Concetti fondamentali [c],  I 0 ( ) I( ) l Trasmittanza: T= I /I 0  quanta luce è trasmessa Assorbanza: A=log(I 0/ I) = log(1/T)  quanta luce è assorbita Legge di Lambert-Beer A = assorbanza  = assorbività molare o coefficiente di estinzione molare (in M -1 cm -1 ) Concentrazione (in mol l -1 ) Cammino ottico (in cm)

3 Concetti fondamentali Additività delle assorbanze L’assorbanza totale è la somma delle assorbanze delle singole specie Equilibri protici in soluzione HnAHnA H n-1 A - + H + H n-1 A H n-2 A - + H + H n-2 A H n-3 A - + H + Molte sostanze organiche e biologiche contengono eteroatomi (N,O,..) e possono protonarsi e deprotonarsi: lo spettro UV-VIS è spesso la somma degli spettri risultanti dalle diverse specie!

4 Concetti fondamentali Come conseguenza degli equilibri protici, lo spettro UV-VIS di un colorante in acqua dipende spesso dal pH Fluoresceina in soluzione acquosa a vari pH basico acido

5 Concetti fondamentali La fluoresceina è presente in quattro forme protiche H + K1K1 K2K2 K3K3

6 Concetti fondamentali - - H + Il dianione della fluoresceina è la specie con l’assorbività più alta, con un massimo a 490 nm

7 H3F+H3F+ H 2 F + H + H2FH2F HF - + H + Concetti fondamentali HF - F 2- + H + Conviene avere in soluzione la sola specie dianionica Imponiamo la condizione: ( il 99% in forma dianionica) pH>8.43

8 In laboratorio Scopo dell’esperienza: determinazione dell’assorbività molare in acqua a 490 nm della fluoresceina dianione Ogni gruppo deve preparare 5 soluzioni a differenti concentrazioni fra 20  M e 2  M Si parte da una soluzione madre 1 mM di fluoresceina 50 ml 1 ml Ogni gruppo prepara una soluzione 20  M a partire dalla soluzione madre. La soluzione va portata a pH=10 con NaOH 0,1 M 1 ml di sol. 1 mM + 5 ml di NaOH 0,1 M diluiti a 50 ml

9 In laboratorio 10 ml Ogni gruppo dispone di tre matracci da 10 ml e due pipette tarate da 3 e 5 ml. Con questa attrezzatura prepara tre soluzioni a partire dalla soluzione 20  M : 1) 8 ml di soluzione 20  M ml di NaOH 0.1 M in 10 ml 2) 5 ml di soluzione 20  M ml di NaOH 0.1 M in 10 ml 3) 3 ml di soluzione 20  M ml di NaOH 0.1 M in 10 ml Si effettuano 4 misure di assorbanza: delle soluzioni 1), 2) e 3) e della soluzione madre da 20  M. Si svuota il matraccio della soluzione 2) e si usa per preparare la soluzione 4: 5 ml di soluzione 3) ml di NaOH 0.1 M diluiti a 10 ml. Sulla soluzione più diluita si effettua una misura di fluorescenza

10 In laboratorio Le assorbanze a 490 nm sono diagrammate contro le relative concentrazioni C A (A 0,C 0 ) (A 1,C 1 ) (A 2,C 2 ) (A 3,C 3 ) (A 4,C 4 ) A=  b C Dal fitting dei punti si ricava la pendenza e l’errore relativo: Dalla pendenza, noto il cammino ottico (1 cm) si ricava l’assorbività molare a 490 nm. Indicare l’errore sull’assorbività. Elaborazione

11 Relazione Ogni gruppo deve presentare una relazione sulle misure UV-VIS La relazione deve essere essenziale: 1)Max. una paginetta di introduzione con le basi e l’obiettivo del lavoro 2)Max 2 pagine di parte sperimentale


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