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La cellula e i suoi componenti: Tecniche di visualizzazione Fluorescence image of actin in yeast DIC image of yeast cell EM image of yeast.

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Presentazione sul tema: "La cellula e i suoi componenti: Tecniche di visualizzazione Fluorescence image of actin in yeast DIC image of yeast cell EM image of yeast."— Transcript della presentazione:

1 La cellula e i suoi componenti: Tecniche di visualizzazione Fluorescence image of actin in yeast DIC image of yeast cell EM image of yeast

2 Tecniche di visualizzazione invasive: implicano la morte e/o rottura cellulare. ElettroMicroscopia : permette di studiare la struttura della cellula Attenzione agli artefatti del fissaggio!!! Yeast cell

3 Tomografia Permette di visualizzare strutture intracellulari e di averne una immagine tridimensionale

4 Tecniche non invasive:permettono lo studio delle cellule vive e quindi sono utilizzate per lo studio della dinamica dei processi Microscopia ottica Nel microscopio ottico a campo chiaro la luce della sorgente di illuminazione converge sul preparato attraverso il condensatore. I campioni analizzati attraverso il microscopio a campo chiaro vengono spesso colorati, poichè il basso contrasto rende il campione poco visibile.microscopio ottico Yeast cells DIC image

5 Microscopia a contrasto di fase indice di rifrazione: Parametro che rappresenta il fattore numerico per cui la velocità di propagazione di una radiazione elettromagnetica viene rallentata, rispetto alla sua velocità nel vuoto, quando questa attraversa un materiale. Microscopio a contrasto di fase si basa sull'incremento delle differenze di contrasto tra il campione da analizzare e il mezzo circostante, in modo tale da consentirne la visualizzazione senza ricorrere a metodologie di colorazione. Il principio alla base di questo tipo di microscopia è che il campione, per esempio un preparato di cellule, ha un indice di rifrazione differente dal mezzo circostante e quando la luce lo attraversa viene deviata e ritardata. L'obiettivo del microscopio a contrasto di fase amplifica questo effetto e porta alla formazione di una immagine scura su campo chiaro.

6 Proteine fluorescenti Il fenomeno della fluorescenza è stato descritto per la prima volta da Sir. George Stroke Le molecole fluorescenti agiscono come fonte di luce localizzata nell’area specifica in cui viene emessa la fluorescenza Che cosa è la fluorescenza esattamente? L’energia assorbita eccita gli elettroni nel fluoroforo a uno stato energetico più elevato. Questi vibrando e ruotando perdono parte dell’energia acquisita, il resto è restituita come luce fluorescente quando gli elettroni ritornano allo stato quiescente Che cosa è la fluorescenza esattamente? L’energia assorbita eccita gli elettroni nel fluoroforo a uno stato energetico più elevato. Questi vibrando e ruotando perdono parte dell’energia acquisita, il resto è restituita come luce fluorescente quando gli elettroni ritornano allo stato quiescente Cellule HeLa che esprimono GFP

7 Green Fluorescent Protein (GFP) Struttura Fluoroforo di GFP: Ser 65 -Tyr 66 -Gly 67 Che cosa è la fluorescenza esattamente? L’energia assorbita eccita gli elettroni nel fluoroforo a uno stato energetico più elevato. Questi vibrando e ruotando perdono parte dell’energia acquisita, il resto è restituita come luce fluorescente quando gli elettroni ritornano allo stato quiescente Che cosa è la fluorescenza esattamente? L’energia assorbita eccita gli elettroni nel fluoroforo a uno stato energetico più elevato. Questi vibrando e ruotando perdono parte dell’energia acquisita, il resto è restituita come luce fluorescente quando gli elettroni ritornano allo stato quiescente It is very resistant to denaturation requiring treatment with 6 M guanidine hydrochloride at 90 C or pH of Partial to near total renaturation occurs within minutes following reversal of denaturing conditions by dialysis or neutralization. bioc.rice.edu/ Bioch/Phillips/ Papers/gfpbio.html

8 Images from Le proprietà spettrali delle proteine fluorescenti sono dipendenti dalla struttura del fluoroforo così come dalla localizzata interazione dei residui aminoacidici nelle immediate vicinanze, e in alcunicasi, dei residui lontani dal fluoroforo

9 Sorgente luminosa Shift di STROKE L’energia di una fonte luminosa viene catturata dal fluoroforo della proteina fluorescente e viene riemessa ad una lunghezza d’onda maggiore Ogni fluoroforo ha una lunghezza d’onda di eccitazione e di emissione specifica La variazione di lunghezza d’onda assorbita ed emessa si chiama Shift di Stroke

10 Video microscopia: studio della dinamica delle proteine in vivo Time lapse:4 focal plane 0.2 micron apart x image Visualizzazione dell’anello actomiosinico durante a contrazione con l’utilizzo di proteine fuse a GFP wt+Myo1GFP Myo1GFP Wagner et al.,2002

11 Microscopia confocale Mlc1p-YFP Sec2p-CFP Immagine microscopia epifluorescente

12 Nuove tecnologie: High throughput / High content microscopy Microscopia ottica:

13 The cell is identified by the software using DAPI intensity within the nuclei

14 Metodi meccanici : 1. Omogenizzatori 2.Frantumazione con abrasivi 3.Presse 4.Sonicazione Metodi enzimatici: Lisozima (batteri), Zimoliasi, Liticasi (lieviti) Chitinasi (funghi filamentosi ) Metodi di rottura delle cellule

15 1.Prodotto non omogenizzato 2.Prodotto non omogenizzato 1a. Omogenizzatori a pestello: adatto per cellule animali e tessuti vegetali non va bene per cellule di microorganismi. -Il tessuto viene messo in un provettone di vetro all'interno del quale agisce un pestello di vetro o di metallo -Il tessuto è forzato a passare tra le pareti della provetta, che viene mantenuta ferma, e il pistone mobile che ruota.. Le forze frizionali che si svilupperanno dipenderanno anche dalla velocità di rotazione del pestello sono maggiori alla superficie del pestello e minori vicini alle pareti dela provetta.. 1. omogenizzatori Metodi meccanici :

16 Microscopia a contrasto di fase prima (1)durante (2)dopo (3) Cellule di lievito visualizzate tramite microscopia a contrasto di fase: DIC image: Al punto di fuoco i raggi di luce convergente mostrano un interferenza che si traduce in un aumento o diminuzione dell’ampiezza dell’onda risultante percepita dall’occhio come una differenza di luminosità

17 1b. Omogenizzazione con palline di vetro : per lieviti e batteri Rottura meccanica delle cellule con GLASS BEADS Figure 1. Negative control yeast without glass beads. Figure 3. Yeast disrupted for 10 min. with mesh glass beads. Figure 2 Yeast disrupted for 5 min. with mesh glass beads. prima (1)durante (2)dopo (3) Cellule di lievito visualizzate tramite microscopia a contrasto di fase:

18 segue….Metodi meccanici : 2. Frantumazione con abrasivi: Sospensioni di cellule vegetali e batteriche. Le cellule vengono disgregate dall’abrasivo Si può effettuare a mano con un pestello in un mortaio in presenza di allumina o sabbia e tampone. 3. French Press:: Adatta cellule microbiche La rottura avviene a causa di forze taglienti

19 4. ultrasuoni: Viene utilizzato per piccole preparazioni di cellule di microorganismi. le cellule vengono introdotte in una camera dove vengono generate onde sonore ad alta frequenza (maggiori di 20kHz) per tempi variabili (30-60 secondi). Queste onde generano ondate pressorie elevate che rompono le cellule tramite forze taglienti e cavitazionali. Le bolle di gas presenti nel mezzo inizialmente sono sotto pressione ma quando si decomprimono si producono onde d’urto che causano la rottura cellulare. Questo metodo determina un elevato sviluppo di calore, è quindi preferibile operare mantenendo il campione in ghiaccio.

20 Perché la lisi cellulare va effettuata in Tamponi di lisi ? I processi biologici richiedono un pH ottimale Il pH ottimale per un dato enzima sarà il pH del compartimento cellulare in cui l’enzima lavora : Es. citoplasma pH =neutro, Lisosomi pH=5, succhi gastrici pH=1 Gli studi in vitro dei processi metabolici devono quindi considerare il pH ottimale del processo enzimatico o cellulare da studiare

21 pH e Soluzioni tampone Gli elettroliti che reagiscono con l’H 2 O e aumentano la quantità di OH - sono BASI, mentre gli acidi aumentano la quantità di H + una soluzione tampone e’ una soluzione salina che permette di mantenere il pH della soluzione inalterato anche in presenza di basi o acidi aggiunti…. naturalmente entro certi limiti!!! (capacità tamponante)

22 Una soluzione tampone resiste alle variazioni di concentrazione degli ioni H + in seguito all’aggiunta di acidi o basi La capacità tamponante  = db / d(pH) db= db = quantità di base aggiunta d(pH)= aumento del valore del pH risultante dall’aggiunta della base Nella pratica le soluzioni tampone sono costituite da una miscela di acido o base debole e dal loro sale Es. acido acetico e sodio acetato La capacità tamponante sarà massima quando pH=pKa Ed ad alta concentrazione del tampone

23 Tamponi di estrazione: COSA CONTENGONO? Soluzioni tampone comunemente usate Tris-HCl, K-fosfato con forze ioniche tra 0.1 e 0.3 M e un pH tra 7 e 8

24 2.Substrati enzimatici e cofattori 3.Agenti chelanti ioni divalenti :EDTA, EGTA 4.Sodio azide 1.Antiossidanti : DTT,  mercaptoetanolo, cisteina o glutatione ridotto. La cellula ha un ambiente riducente ma dopo rottura le proteine si trovano esposte ad un ambiente ossidante Che cos’altro contengono i tamponi di lisi ? SH- HS ossidazione S- S

25 Inibitori degli enzimi. 1)Inibitori di serin proteasi: PMSF (fenilmetil sulfonilfluoro). DFP (di-isopropilfosfofluoruro), TPCK (Tosilfenilalanil-clorometilchetone) 2) Inibitori dell’ tiolo proteasi: iodoacetato ; cistatina. 3) Inibitore dell’ aspartico proteasi : pepstatina. 4) Inibitori delle metalloproteasi: EDTA ; 1,10-fenantrolina 5) Inibitori della esopeptidasi: Amastatina; Bestatina

26 METODI DI Estrazione delle proteine

27 Ionici: SDS, sodio deossicolato, CTAB e CHAPS Non – ionici: Triton X-100 e Nonoident P-40 DETERGENTI Si usano per solubilizzare proteine intrinseche di membrana

28 Proteine di membrana:Integrali e transmembrana Richiedono detergenti o solventi non- polari per l’estrazione, sebbene alcune di loro (beta-barrels) possono essere estratte usando agenti denaturanti. Image from :

29 Le proteine periferiche di membrana sono temporaneamente attaccate alla membrana lipidica o a proteine integrali di membrana tramite una combinazione di legami idrofobici, elettrostatici e altre interazioni non covalenti Proteine solubili possono associarsi reversibilmente o permanentemente a membrane grazie a modificazioni Post-traduzionali che aggiungono code lipidiche (es: prenili o GPI= glycosylphosphatidylinositol ) Proteine periferiche di membrana Membrana Image from :http://en.wikipedia.org/wiki/Membrane _protein

30 Esempio di estrazione di proteine associate alle membrana Le proteine intrinseche di membrana si solubilizzano con detergenti Quelle periferiche di membrana dissociano a seguito di un trattamento con reagenti polari, come soluzioni che possiedono un elevato pH o alte concentrazioni saline


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