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Lezione 7-8 mercoledì 4 Marzo 2011 corso vettori biologici II Biotec industriali ore 14:00 -16:00 aula 6A.

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1 Lezione 7-8 mercoledì 4 Marzo 2011 corso vettori biologici II Biotec industriali ore 14:00 -16:00 aula 6A

2 vari metodi e kit di estrazione i kit piu’ utilizzati si basano sull’utilizzo di matrici silicee: gli acidi nucleici si legano alle particelle della matrice differenti tipi di acido nucleico adsorbono più o meno bene alla matrice di silice, a seconda della forza ionica e del pH della soluzione dopo avere lavato la matrice silicea, gli acidi nucleici sono eluiti con un tampone a bassa concentrazione salina o con acqua e sono pronti per le successive reazioni

3 DNA genomico ad alto PM Dalla lisi alla estrazione: Estrazione di DNA da piccole quantit à di materiale biologico (sangue, cellule, tampone, siero, bulbo capellifero) Microcon Millipore operare sotto cappa per mantenere sterilit à ed evitare contaminazione In una provetta eppendorf si mette, a seconda del materiale a disposizione: -il cotone del tampone orale (swab) con la mucosa bucale (si incide e si asporta il cotone con una lametta, facendo ben attenzione a cambiare sempre la lama) -siero o sangue (diluito) -altro (estremit à del capello con il bulbo, ecc..) Si aggiungono 300  l (su 300  l di siero) del tampone di estrazione: Buffer di estrazione: 100mMTris/Hcl 100mM NaCl 10mM EDTA pH 8,00 2% SDS e 7,5  l di proteinasi K. ( 20 mg/ml) Incubare a 56°C o. n. Agitare e centrifugare (breve spinnata). Nel caso di cotone (tampone-swab) strizzare bene o centrifugare pi ù a lungo. Sul supernatant aggiungere 300  l di fenolo/cloroformio/alcool isoammilico (25:24:1). Agitare – mescolare senza vortex fino ad ottenere una emulsione lattacea Cg rpm per 3 min. prendere la fase acquosa evitando l’interfaccia (proteine)

4 dopo l’estrazione la purificazione Aggiungere 100  l di H2O sterile a un tubo concentratore Microcon 100 (Millipore costituito da una filtro e da un tubo da 2 ml). Trasferire la fase acquosa ottenuta dalla centrifugata (contenente il DNA) sul filtro del tubo - Cg (centrifugare 2500 rpm per 25 min - eliminare il liquido filtrato e aggiungere 200  l di H2O (lavaggio) - Cg 2500 rpm per 25 min - trasferire il filtro su un nuovo tubo - risospendere il DNA in 100  l di ddH2O sterile ( è importante la sterilit à dell ’ H2O soprattutto in questa fase dove il DNA viene eluito) - delicatamente invertire il filtro e porlo su una nuova eppendorf, centrifugare a 3500 rpm per 5 min - conservare il DNA eluito a – 20 C

5 Da quantità maggiori di cellule o tessuto Si parte da un prelievo di sangue di almeno 5-10 ml in EDTA 50mM finale ACD 1 ml per 6 ml di sangue (acido citrico e glucosio: per 100 ml acido citrico 0.48 gr citrato sodico 1.32 gr glucosio 1.47 gr se sono una decina di milioni di linfociti fare l'estrazione in 4 ml di Tris - EDTA ed il resto in proporzione -risospendere in 10 ml Tris-HCL 10 mM pH 8.3 ed EDTA 5mM -si lisano con 1 ml di SDS 10% e 100 microlitri di proteinasi K (10mg/ml) per due o tre ore a 60 gradi, -poi aggiungere 2 ml NaCL 5 M e si mescola delicatamente. -aggiungere 1 volume di fenolo cloroformio e mescolare delicatamente minuti -centrifugare Falcon da 50 ml (4 mila rpm 20 minuti) e prendere la fase acquosa (superiore) evitando l'interfaccia con le proteine lasciando 1-2 ml di fase acquosa -aggiungere 1 volume di cloroformio / isoamilico 24:1 (4 ml isoamilico e 96 cloroformio) e mescolare per inversione 15 minuti -centrifugare (4 mila rpm 20 minuti) prendendo la fase acquosa (superiore) evitando interfaccia se c'e' ancora molta zozzeria al''interfaccia ripetere un cloroformio - aggiungere 2 volumi di alcohol etilico freddo oppure 1 vol. isopropilico -se si forma la nuvoletta di DNA precipitato, prenderla con una pipetta da 1 ml a punta tagliata a becco di flauto e trasferirla in una eppendorf da 2 ml sterile (se c ’è la nuvola sono almeno 10  di DNA alto PM) - aggiungere 1.5 ml di alcohol 80% centrifugare e buttare il sopranatante -aggiungere 1 ml di alcohol 80% per conservare il DNA pronto per il trasporto

6 estrarre RNA Facile ma delicato = degradabile Una tipica cellula di mammifero contiene circa picogrammi di RNA. La popolazione di RNA cellulari è molto eterogenea: RNA totale : RNA codificante (~4%) Comprende le molecole di mRNA citoplasmatico e i precursori nucleari RNA non codificante (~96%) - RNA ribosomiali con i relativi precursori, che costituiscono fino all’80% dell’RNA totale - tRNA e altri piccoli RNA a localizzazione nucleare, nucleolare o citoplasmatica

7 vincere contro le RNasi - le DNasi richiedono ioni metallici per la loro attività e sono termolabili, per cui sono facilmente inattivate da agenti chelanti e dalla sterilizzazione in autoclave - le RNasi non hanno bisogno di cofattori, resistono a trattamenti drastici (ebollizione prolungata, sterilizzazione in autoclave) e sono attive entro un ampio range di pH. - o sono più antiche o ce ne è maggior bisogno - l’RNA è a basso peso molecolare e si può agitare anche in vortex

8 metodi diversi di estrazione - Fenolo acido ed a 45°C (temperatura non troppo alta perché è instabile incendiabile e può scoppiare) - guanidina isotiocianato - derivati di guanidio con fenolo e cloroformio (Trizol della Invitrogen) - resine per arricchimento Sigma con oligo dT per legare mRNA polyAAA - colonnine di silicio per purificazione Qiagen: * for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast * Fast procedure delivering high-quality total RNA in minutes * Ready-to-use RNA for high performance in any downstream application * Consistent RNA yields from small amounts of starting material * No phenol/chloroform extraction, no CsCl gradients, no LiCl or ethanol precipitation

9 accorgimenti e sterilità Tamponi e soluzioni di uso comune che se utilizzati senza opportune precauzioni, possono ospitare batteri o altri microrganismi che rilasciano i loro enzimi; autoclavarli non inattiva le RNasi, anzi può introdurle nei reagenti, per es. liberandole dai corpi batterici contaminanti. lavorare senza guanti può introdurre nelle soluzioni RNasi batteriche e cellulari batteri veicolati dall’aria possono sedimentare sulla superficie delle soluzioni, portando con sè RNasi Pipette Mai utilizzare le stesse pipette che hanno già dispensato soluzioni di Rnasi, solo materiale monouso sterile plastico E’ importante quindi : Dividere le soluzioni in piccole aliquote Utilizzare plastica garantita RNasi-free Trattare la vetreria per almeno 4 ore a 200°C Indossare sempre guanti e cambiarli spesso Mantenere un’area di lavoro separata, dedicata all’RNA, con dotazione di pipette, puntali, provette, reagenti e tamponi esclusivi. Ciò è importante particolarmente, se nelle stesso laboratorio si usa RNasiA per estrazione di DNA.

10 protezione per RNA in soluzione 2-mercaptoetanolo, un agente riducente in grado di rompere i ponti disolfuro delle proteine Temperatura: lavorare mantenendo le provette in ghiaccio è un modo di inibire le ribonucleasi Sostanze deproteineizzanti: fenolo, cloroformio, SDS, proteinasi K RNase inhibitors: RNAsin proteine di origine umana (placenta) o non umana (E. coli ricombinante), che si legano in modo non covalente alle RNasi e ne inibiscono così più del 90% dell’attività. DEPC (dietilpirocarbonato): un agente che reagisce con le proteine determinando la perdita dell’attività enzimatica (tossico e cancerogeno).

11 Rnasin inhibitor di RNAsi RNasin® Plus RNase Inhibitor RNasin® Plus RNase Inhibitor is a recombinant mammalian RNase inhibitor that is expressed as a soluble protein in E. coli, allowing easy purification through a combination of ion exchange and hydrophobic interaction chromatography. The protein is capable of inhibiting eukaryotic RNases (e.g., RNase A and RNase B) similarly to human placental RNase inhibitor. RNasin® Plus RNase Inhibitor is tested in RT-PCR and is compatible with enzymes such as AMV ( avian mieloblast. Virus ), M-MLV ( Moloney leuk virus ) and ImProm-II™ Reverse Transcriptases or Taq and Tfl DNA Polymerases. RNasin® Plus RNase Inhibitor also is tested and compatible with quantitative, real-time RT-PCR

12 estrazione RNA totale 1)Metodo della guanidina tiocianato in gradiente di cloruro di cesio Colture cellulari o tessuti molli si lisano direttamente. Gli altri tessuti si polverizzano in azoto liquido. (Le RNasi endogene si attivano quando si rompono le cellule!) Lisi cellulare e denaturazione delle proteine (RNasi) sono immediate nella soluzione di guanidina tiocianato. Aggiungendo detergenti (SDS) e agenti riducenti (DTT) si dissociano i complessi proteine-acidi nucleici. L’RNA è più denso degli altri componenti cellulari e quindi attraversa il cuscino di cloruro di cesio. Si perdono i piccoli RNA cellulari: tRNA e rRNA 5S. Si ricupera l’RNA dal fondo e si trasferisce in provetta. Si precipita l’RNA in etanolo e sali, poi si sospende il pellet di RNA in una soluzione tampone. Si analizza la qualità dell’RNA estratto con spettrofotometro o su gel denaturante

13 estrazione di RNA con fenolo acido Il metodo del fenolo acido-guanidina tiocianato (Trizol®) si basa sull’osservazione che il DNA passa nella fase organica se il fenolo è tamponato con una soluzione a pH acido 5-6, mentre l’RNA rimane nella fase acquosa. Si procede quindi alla precipitazione alcolica in presenza di cloruro di litio, ammonio acetato o sodio acetato. Elevate concentrazioni di LiCl solubilizzano gli RNA di piccole dimensioni (tRNA e 5S RNA) mentre non solubilizzano quelli di maggiori dimensioni (rRNA e mRNA), pertanto questi ultimi sono selettivamente precipitati e raccolti per centrifugazione (flocculano).

14 arricchire mRNA La maggior parte degli mRNA eucariotici hanno un poliA all’estremità 3’. L’mRNA poliadenilato può quindi ibridare con sequenze sintetiche di oligo(dT) (corti polimeri di desossitimidina), mentre le altre specie di RNA che non ibridano con l’oligo(dT) possono essere eliminate (non si legano alla resina su colonnina o su microsfere (beads) di silica. Questo metodo è adatto per gli mRNA eucariotici, comunque solo una 5% percentuale dell’ RNA totale è poliadenilato con code di poliA (da siti di poliadenilazione anche diversi per uno stesso gene).

15 La preparazione di RNA totale è fatta passare attraverso una colonna costituita da un polimero ricoperto con oligo(dT). Solo l’mRNA polidanilato ibriderà con l’oligo(dT), mentre le altre specie verranno eliminate mediante lavaggi con tamponi a bassa concentrazione salina. L’eluato finale sarà costituito dalla miscela di tutte le specie di mRNA presenti nella cellula al momento dell’estrazione. polyA mRNA

16 Le preparazioni di RNA totale sono composte prevalentemente di RNA ribosomiali (80-85% dell’RNA della cellula). Elettroforesi in gel di agarosio/formaldeide Agente denaturante: FORMALDEIDE. mantiene l’RNA in forma denaturata. Questo effetto dura fino a che la formaldeide è presente nel gel o nel tampone. Tampone di corsa: poiché l’RNA si idrolizza facilmente a pH alcalino, si utilizzano sistemi tampone che mantengono il pH del gel intorno ai valori di neutralità (es. MOPS). analisi della qualità dell’RNA mRNA = 5% del tot si vede poco ed è smearato perché è di molti pesi molecolari

17 E' possibile dosare gli acidi nucleici con: 1) Metodo Spettrofotometrico (spettroscopia nell’ultravioletto) 2) Metodo Fluorimetrico 3) Metodo Colorimetrico (spettroscopia nel visibile) Dosaggio, quantificazione

18 Il metodo spettrofotometrico sfrutta la capacità degli acidi nucleici di assorbire la luce UV con un massimo di assorbimento alla lunghezza d'onda di 260 nm. Tale assorbimento è determinato dalle basi azotate, per cui è caratteristico del DNA a doppio e singolo filamento e dell’RNA. 1A 260 di DNA a doppio filamento = 50 µg/ml 1A 260 di RNA = 40 µg/ml metodo spettrofotometrico

19 Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza della preparazione degli acidi nucleici, perchè le proteine, che sono la principale fonte di contaminazione, assorbono a 280 nm. Anche il fenolo legge a 260nm e va eliminato. Preparazioni pure di DNA con valori di A260/A280 uguali a 1,8 Preparazioni pure di RNA hanno valori di A260/A280 uguali 2 purezza

20 In questo caso la concentrazione degli acidi nucleici può essere stimata in base alla fluorescenza emessa dall’ Etidio Bromuro. L’Etidio bromuro è una molecola che si intercala negli acidi nucleici ed emette fluorescenza rosso-arancio quando eccitata dalla luce UV. Il dosaggio fluorimetrico è un dosaggio di tipo RELATIVO. Quantità crescenti e a concentrazione nota di acido nucleico vengono caricate su un gel accanto al campione a concentrazione incognita. Dopo la corsa elettroforetica il gel viene immerso in una soluzione di Etidio Bromuro che si intercala tra le basi dell'acido nucleico rendendolo fluorescente alla luce UV. Poiché la quantità di fluorescenza emessa da ciascuna banda osservata è proporzionale alla massa del DNA presente nella banda stessa, la quantità di DNA nella banda del campione può essere stimata dal confronto con la fluorescenza delle bande della serie standard. metodo fluorimetrico

21 Il metodo si basa sulla formazione di complessi colorati di particolari sostanze con il ribosio o con il deossiribosio dello scheletro degli acidi nucleici. Ci permette di valutare esattamente la quantità di DNA o RNA presenti in soluzione, anche se la soluzione contiene entrambi gli acidi nucleici. Orcinolo per l’RNA Difenilammina per il DNA L’intenso colore verde-azzurro, che si produce al termine della reazione, consente il dosaggio colorimetrico dell’RNA a 660 nm. L’intenso colore blu, che si produce al termine della reazione, consente il dosaggio colorimetrico del DNA a 595 nm. Per il dosaggio, è necessario costruire una retta di taratura con soluzioni di RNA o DNA a concentrazione nota e crescente. metodo colorimetrico nel visibile


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