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Reazioni non elementari: Bioreazioni e bioreattori Reazioni enzimatiche Reazioni con microorganismi Bioreattori.

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Presentazione sul tema: "Reazioni non elementari: Bioreazioni e bioreattori Reazioni enzimatiche Reazioni con microorganismi Bioreattori."— Transcript della presentazione:

1 Reazioni non elementari: Bioreazioni e bioreattori Reazioni enzimatiche Reazioni con microorganismi Bioreattori

2 Reazioni enzimatiche catalitiche o Un enzima, E, è una proteina o una sostanza simile ad una proteina con proprietà catalitiche. o Un substrato, S, è la sostanza che viene chimicamente trasformata ad una velocità accelerata dovuta alla presenza dell’enzima. o Un enzima può catalizzare SOLO una reazione. Reazioni non volute sono facilmente controllate. o Enzimi sono prodotti principalmente da organismi viventi (batteri, per esempio). o Enzimi solitamente funzionano in condizioni blande (pH 4~9, 25~ 70 C).

3 Enzimi o La maggioranza degli enzimi prendono il nome dalla reazione che catalizzano (***asi), ad esempio: o ureasi: l’enzima che catalizza la decomposizione dell’urea o atpasi: l’enzima che trasforma ATP in ADP o Fosfatasi : enzimi che trasferiscono un gruppo fosfato …. o Tre tipi di reazioni enzimatiche: o Enzima solubile – substrato insolubile (e.g. detergenti lavanderia) o Enzima insolubile – substrato solubile (simile al PBR con catalizzatore) o Enzima solubile – substrato solubile(e.g. molte reazioni bio) o Due meccanismi principali di interazione substrato – enzima o Lock and key model o Induced fit model

4 Classificazione degli enzimi 1. OSSIDOREDUTTASI Nome sistematico: donatore : accettore ossidoreduttasi Reazioni di ossidoriduzione Nome comune: deidrogenasi o reduttasi 2. TRANSFERASI Nome sistematico: donatore : accettore gruppo transferasi Trasferimento di gruppi funzionali Nomenclatura corrente: Transaminasi (ma meglio, Amminotransferasi) Cinasi (fosfotransferasi) 3. IDROLASI Nome sistematico: substrato idrolasi Idrolisi: Rottura di un legame con intervento H 2 O Nome comune: substrato + suffiso asi 4. LIASI Nome sistematico: substrato : gruppo-liasi Rottura non idrolitica di un legame C-C, C-O, C-N o altro oppure addizione ad un doppio legame Schema comune di reazione: un substrato = due prodotti (o viceversa) Uno dei prodotti contiene un doppio legame (neoformato o preesistente) Nomenclatura comune: Rottura legame C-C: decarbossilasi (o carbossilasi) o aldolasi Rottura legame C-O: Idro-liasi 5. ISOMERASI Nome sistematico: in generale isomerasi Equilibrio fra isomeri Nome comune simile al sistematico, ma semplificato. 6. LIGASI Nome sistematico: X : Y ligasi (prodotto idrolisi) X e Y = nome molecole da unire; eventualmente, Fomazione di un legame accoppiata con idrolisi ATP o altro nucleotide Nome comune: Ligasi In alcuni casi si usa Sintasi o Carbossilasi.

5 Reazioni catalizzate da enzimi: esempio Il meccanismo proposto per l’azione catalitica dell’ ureasi che permette la Decomposizione dell’urea in ammoniaca e anidride carbonica: (Levine e LaCourse, 1967) 1. L’enzima ureasi reagisce col substrato urea per formare un complesso enzima-substrato, ES: 2. Il complesso si decompone (indietro) in urea e ureasi: 3. Oppure può reagire con acqua per dare ammoniaca, anidride carbonica e ureasi: S E ES W P

6 Velocità di sparizione del substrato: Velocità netta di formazione del complesso ES: L’enzima non è consumato nella reazione: PSSH A B C D E

7 Poiché la reazione viene condotto in soluzione acquosa: (W) ~ costante k’ 3 Questa è la forma della “Equazione di Michaelis-Menten” E K m è detta la costante di Michaelis V max (S) -r S V max A bassa concentrazione di substrato: (S) << K m Ad alta concentrazione di substrato: (S) >> K m Caso speciale in cui V max /2 KmKm K m è uguale alla concentrazione del substrato alla quale la velocità di reazione è uguale alla metà della velocità massima A B B’ B’’

8 Equazione di Michaelis-Menten o V max e K m caratterizzano la reazione enzimatica descritta dalla cinetica di Michaelis-Menten. o V max dipende dalla concentrazione totale dell’enzima. o K m è indipendente dalla concentrazione totale dell’enzima.

9 Esempio: cinetica di Michaelis-Menten o Urea che si decompone in ammoniaca e CO 2 1/-r s (1/S) (i.e. 1/C urea ) Pendenza= 0.02 = Intercetta = 0.75 = Lineweaver-Burk plot A B

10 o Oppure: Eadie – Hofstee plot o Oppure Hanes – Woolf plot o Oppure regressione diretta non lineare di per ottenere V max e K m o Polymath model: rate = Vmax*Curea/(Km+Curea) o Risultato: V max = 1.2 mol/dm 3 s e K m = mol/dm 3 A B Esempio: cinetica di Michaelis-Menten

11 Reattore batch per reazione enzimatica o Progetto di un rene artificiale o Reattore batch in fase liquida a volume costante (dN/dt=-rV): Intercetta= Pendenza= A B c d

12 Esempio: reattore batch o Calcolare il tempo necessario per convertire 99% di urea in ammoniaca e CO 2 in un reattore batch da 0.5 dm 3. Concentrazione iniziale di urea 0.1 mol/dm 3 e concentrazione ureasi di g/dm 3. Reazione isoterma alla T dell’esercizio precedente. o Vale la eq: o Conc E = (contro 5 caso precedente)  o V max =0.001/5*1.33 = mol/s/dm 3 o K m = mol/dm 3 o t = s = 840 s = 14 min

13 Effetto della temperatura sulle reazioni enzimatiche o Molto complesso o Se l’enzima restasse immutato, l’effetto sarebbe un effetto Arrenhius o All’aumentare della T l’enzima si richiude e denatura o Perdita capacità catalitica o Due tendenze opposte o Quindi all’aumentare di T –r S sale raggiunge un massimo e poi scende o La parte discendente è chiamata de attivazione termica o denaturazione termica V maz -r s T

14 Inibizione di reazioni enzimatiche o La velocità di una reazione catalizzata da enzimi è influenzata da pH e dalla presenza di inibitori. o Tre sono i più comuni tipi di inibizione reversibile: o Competitiva o Il substrato e l’inibitore sono molecole simili che competono per lo stesso sito sull’enzima. o Acompetitiva o L’inibitore deattiva il complesso enzima-substrato, normalmente attaccando se stesso oppure sia il substrato che le molecola dell’enzima nel complesso o Non competitiva o Per enzimi che contengono almeno due tipi diversi di siti. L’inibitore attacca solo un tipo di sito ed il substrato solo l’altro.

15 Bioreattori o Bioreattore è un reattore che produce cellule e culture tissutali o Tutte le reazioni cellulari sono catalizzate da enzimi o Microorganismi e cellule mammarie sono usate per produrre una varietà di prodotti, come insulina, molti antibiotici, e polimeri. o Vantaggi: o Condizioni di reazione blande o Alte rese o Catalizzano passi successivi in una reazione per organismi con molti enzimi o Sono catalizzatori stereospecifiche (si può formare un singolo isomero desiderato)

16 Bioreattori o In generale, la crescita di un organismo in condizioni aerobiche segue: o La velocità di questa reazione è proporzionale alla concentrazione di cellule e la reazione è auto catalitica.

17 Crescita delle cellule o Sono identificate 4 fasi durante la crescita delle cellule in un batch o (1) Lag phase o Scarso aumento della concentrazione delle cellule o Sintesi e trasporto delle proteine per muovere il substrato nella cellula o Sintesi dell’enzima per utilizzare il nuovo substrato o Inizio del lavoro di replicazione del materiale genetico cellulare o (2) Exponential growth phase o La velocità di crescita delle cellule è proporzionale alla loro concentrazione o Le cellule utilizzano il nutriente efficientemente o (3) Stationary phase o Le cellule raggiungono il minimo spazio biologico dove la mancanza di uno o più nutrienti limita la crescita cellulare. o Molti importanti prodotti di fermentazione, inclusi antibiotici, sono prodotti nella fase stazionaria o (4) Dead phase o Risultato della formazione di un sotto prodotto tossico e/o la interruzione della fornitura di nutriente tempo Log conc. cellule

18 Velocità di reazione in bioreattori L’espressione più comunemente usata per la crescita esponenziale è l’equazione di Monod : Velocità di crescita delle cellule Concentrazione delle cellule Velocità di crescita specifica= Velocità massima della reazione specifica di crescita Costante di Monod Concentrazione substrato Per crescita di E. coli su glucosio:  max = 1.3 h -1 e K s = mol/dm 3

19 Tenendo conto dell’inibizione (modello) Dove C p * = concentrazione del prodotto alla quale tutto il metabolismo si ferma e n = costante sperimentale Altre velocità di crescita: Equazione di Monod Equazione di Tessier Equazione di Moser La velocità di morte delle cellule è: Concentrazione di un substrato tossico per la cellule Costante di velocità di morte naturale specifica Costante di velocità di morte tossica specifica A B C

20 Effetto della temperatura o Simile all’effetto sulle reazioni enzimatiche o Effetto Arrenhius a basse T o All’aumentare della T l’enzima si richiude e denatura o Perdita capacità catalitica o Due tendenze opposte I’ T A B

21 Stechiometria della crescita cellulare o Molto complessa… varia con o il sistema microorganismo / nutriente; o condizioni ambientali; o Ancora più complessa se più nutrienti contribuiscono alla crescita delle cellule. o Si può semplificare (un solo nutriente) in: Dove Y c/s è il coefficiente di resa: Dove Y p/s è il coefficiente di prodotto:

22 Consumo del substrato Produce nuove cellule Mantiene le attività delle cellule Valore tipico = 0.05 h -1 Il coefficiente di resa, Y’ c/s, tiene conto del consumo del substrato per manutenzione: Quindi, la velocità di consumo del substrato per manutenzione: Stechiometria della crescita cellulare A

23 Formazione prodotto Durante la fase di crescita Durante la fase stazionaria La velocità netta di consumo del substrato: Velocità di consumo per crescita delle cellule Velocità di consumo per formazione di prodotto Velocità di consumo per manutenzione Stechiometria della crescita cellulare A B C

24 Se il prodotto è formato durante la fase di crescita Se il prodotto è formato durante la fase stazionaria Dove C sn è la concentrazione del nutriente secondario Simile alla eq. Di Monod Stechiometria della crescita cellulare A B C D E

25 Bilancio generale di Massa sulle cellule o Bilancio di massa sul microorganismo per un CSTR /batch Velocità di accumulo delle cellule Velocità di cellule in ingresso Velocità di cellule in uscita Velocità di generazione netta di cellule vive

26 Bilancio generale di Massa sul substrato o Bilancio di massa sul substrato per un CSTR / batch Velocità di accumulo del substrato Velocità del substrato in ingresso Velocità del substrato in uscita Velocità di generazione netta del substrato

27 Batch: bilancio di Massa sulle cellule o Bilancio di massa sul microorganismo per un Batch o No ingresso e uscita Velocità di accumulo delle cellule Velocità netta di generazione di cellule vive

28 Batch: bilancio di Massa sul substrato o Bilancio di massa sul substrato per un batch o No input ed output o Substrato usato per crescita e per manutenzione Velocità di accumulo del substratoVelocità di substrato usato per crescita cellule e prodotti Velocità di substrato usato per manutenzione In fase di crescita Nella fase stazionaria Velocità di formazione prodotto A B C

29 Esempio: crescita batterica in un reattore batch Un processo di fermentazione (da glucosio ad etanolo) è condotto in un reattore Batch. Riportare in grafico la concentrazione delle cellule, substrato e prodotto ed anche le velocità di crescita in funzione del tempo. La concentrazione iniziale è di 1.0 g/dm 3 e la concentrazione del substrato è 250 g/dm 3. Valori dei parametri:

30 Bilancio di massa Cellule: Substrato: Prodotto Leggi cinetiche Stechiometria A B C D E F G H I J

31 Differential equations as entered by the user d(Cc)/d(t)=rg-rd d(Cs)/d(t)=Ysc*(-rg)-rsm d(Cp)/d(t)=rg*Ypc Explicit equations as entered by the user Rd=Cc*0.01 Ysc=1/0.08 Ypc=5.6 Ks=1.7 m=0.03 umax=0.33 rshghm=m*Cc Kobs=(umax*(1-Cp/93)^0.52) rg=kobs*Cc*Cs/(ks+Cs) Polymath results

32 Chemostats o Chemostats sono dei CSTR che contengono microorganismi o Una delle caratteristiche più importanti è che permettono all’operatore di controllare la crescita cellulare o Aggiustando la portata volumetrica della carica o Bilancio di massa sulle cellule o Bilancio di massa sul substrato o Ipotesi: o Portata volumetrica costante (uguale in ed out) o No cellule in ingresso A B

33 Chemostats o Definiamo la velocità di diluizione: D = v 0 / V o Reciproco del tempo di residenza medio o Si ottiene o Cellule: o Substrato: o In stato stazionario A B C D

34 Chemostats o Trascurando la velocità di morte (r d ) si ottiene per il flusso in uscita di cellule dal sistema F c o Dividendo per C c V si ottiene o … la crescita specifica delle cellule è controllata dalla diluizione o Ricordando Monod …. A B C E D

35 Chemostats o Supponendo di essere in presenza di un singolo nutriente e che la manutenzione della cellula sia trascurabile o Alla fine si ottiene: A B C


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