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LE MALATTIE DEL SANGUE. EMOPATIE NON NEOPLASTICHE LEUCOCITI ERITROCITI PIASTRINE LEUCOCITOSI LEUCOPENIE PIASTRINOSI PIASTRINOPENIE POLIGLOBULIE ANEMIE.

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1 LE MALATTIE DEL SANGUE

2 EMOPATIE NON NEOPLASTICHE LEUCOCITI ERITROCITI PIASTRINE LEUCOCITOSI LEUCOPENIE PIASTRINOSI PIASTRINOPENIE POLIGLOBULIE ANEMIE CARATTERISTICHE GENERALI PATOGENESI QUADRI SPECIFICI

3 EMOPATIE NEOPLASTICHE LEUCOCITI ERITROCITI PIASTRINE CELLULE LINFOIDI CELLULE MIELOIDI Policitemia vera Trombocitemia primitiva Leucemia linfoblastica acuta Leucemia linfatica cronica Leucemia prolinfocitica Leucemia a cellule capellute Linfomi di Hodgkin Linfomi non Hodgkin Leucemia mieloide acuta Leucemia mieloide cronica Sindromi mielodisplastiche Mielofibrosi idiopatica

4 APLASIA MIDOLLARE: emocromo EsameRisultatiU.M. Intervallo di riferimento Globuli bianchi (WBC) 1.0x10 3 /µL Globuli rossi (RBC) 4.0 x10 6 /µL Emoglobina (Hb) 8.5gr/dl Ematocrito (Hct)28.0% MCV88.0fl MCH26.0pg MCHC33.0gr/dl Piastrine (Plt)22.0x10 3 /µL Neutrofili44.0% Linfociti45.0% Monociti 8.0% Eosinofili 1.5% Basofili 1.5%

5 APLASIA MIDOLLARE: biopsia midollare

6 APLASIA MIDOLLARE: biopsia ossea

7 LEUCEMIA ACUTA: emocromo EsameRisultatiU.M. Intervallo di riferimento Globuli bianchi (WBC) 40.0x10 3 /µL Globuli rossi (RBC) 4.1 x10 6 /µL Emoglobina (Hb) 9.2gr/dl Ematocrito (Hct)30.0% MCV88.0fl MCH27.0pg MCHC33.0gr/dl Piastrine (Plt)40.0x10 3 /µL Neutrofili10.0% Linfociti74.0% Monociti 12.0 % Eosinofili 2.5% Basofili 1.5%

8 LEUCEMIA ACUTA: biopsia midollare

9 LEUCEMIA ACUTA: biopsia ossea

10 LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: emocromo EsameRisultatiU.M. Intervallo di riferimento Globuli bianchi (WBC) 56.2x10 3 /µL Globuli rossi (RBC) 4.5 x10 6 /µL Emoglobina (Hb)11.0 gr/dl Ematocrito (Hct)35.0% MCV84.0fl MCH30.0pg MCHC33.0gr/dl Piastrine (Plt) 420.0x10 3 /µL Neutrofili73.0% Linfociti20.0% Monociti 4.0 % Eosinofili 1.0% Basofili 2.0%

11 LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: biopsia midollare

12 LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: biopsia ossea

13 LEUCEMIA LINFATICA CRONICA: emocromo EsameRisultatiU.M. Intervallo di riferimento Globuli bianchi (WBC) 25.0x10 3 /µL Globuli rossi (RBC) 4.5 x10 6 /µL Emoglobina (Hb)14.0 gr/dl Ematocrito (Hct)43.0% MCV86.0fl MCH33.0pg MCHC34.0gr/dl Piastrine (Plt) 250.5x10 3 /µL Neutrofili20.0% Linfociti76.0% Monociti 4.0 % Eosinofili 0.0% Basofili 0.0%

14 LEUCEMIA LINFATICA CRONICA: biopsia midollare

15 LEUCEMIE ACUTE: Fisiopatologia e Clinica Eziopatogenesi ed epidemiologia

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18 LEUCEMIE ACUTE : FISIOPATOLOGIA 1)INSUFFICIENZA MIDOLLARE 2) INFILTRAZIONE DI TESSUTI E ORGANI NON EMOPOIETICI DA PARTE DELLE CELLULE BLASTICHE 3) LIBERAZIONE DI CITOCHINE

19 LEUCEMIE ACUTE : CLINICA INSUFFICENZA MIDOLLARE - INSUFFICIENTE PRODUZIONE ERITROCITI: - astenia, cardiopalmo, dispnea - INFUFFICIENTE PRODUZIONE PIASTRINE: - porpora, ecchimosi, epistassi, gengivorragie, disturbi del visus, ipermenorrea, metroraggie; piu rare: macroematuria, emorragie tratto GI, SNC - INSUFFICIENTE PRODUZIONE LEUCOCITI : - infezioni

20 LEUCEMIE ACUTE : il DANNO DELLE CELL. LEUCEMICHE LEUCEMIE ACUTE : il DANNO DELLE CELL. LEUCEMICHE

21 EZIOPATOGENESI DELLE LEUCEMIE ACUTE HSC progenitore mieloide/linfoide cellule leucemiche Alterazione genetica ? altro evento trasformante Cellule mature Fattori ambientali X ? Condizioni ereditarie

22 FATTORI AMBIENTALI ED EPIDEMIOLOGIA Agenti fisici Radiazioni ionizzanti Sorgenti elettriche/magnetiche Agenti chimici Benzene (sigarette, industrie inquinamento atmosferico) Altri composti aromatici Ossido di etilene Fenossi-erbicidi Uretano, nitrosamine (sigarette) Chemioterapia (es. alchilanti) Agenti virali HTLV-1 EBV

23 CONDIZIONI EREDITARIE Sindromi ereditarie Sindrome Down (trisomia 21) Sindromi con deficit del “DNA-repair” (S. Bloom, Anemia di Fanconi) Sindromi da immunodeficienza (S. Wiskott Aldrich) Alto rischio familiare di LA Monosomia del 7 (SMD) Mutazione AML-1

24 LEUCEMIE ACUTE: ALTERAZIONI GENETICHE Promoter/Enhancer TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE Gene cromosoma A Promoter/Enhancer Gene cromosoma B Promoter/Enhancer Gene di fusione A/B Promoter/Enhancer Gene di fusione B/A I Promoter/Enhancer II Gene del cromosoma A regolato dal promoter del gene del cromosoma B

25 TRASLOCAZIONE AML1-ETO CBFβ AML1 Sito CBFGeni target Sito CBFGeni target AML1 ETO NCor HD

26 RAS signalling cascade

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28 RAS signalling pathways

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30 DELEZIONI CROMOSOMICHE E MONOSOMIE Alcun tipi di delezioni del 5q Delezione del cromosoma 17 (p13) Monosomia 7 e delezione 7q Perdita di geni oncosoppressori

31 Cytogenetic Abnormalities in Adult ALL t(9;22) (20-30%) Diploid and others (30-40%) 7q35 (3-5%) 14q11 (5%) 8q24 (1-2%) t(1;19) (5-7%) t(4;11) (5-7%) 11q23 (3-4%) 9p21 (7-15%) t(12;21) (1-2%) BCR-ABL TCR  TCR  C-MYC E2A-PBX1 AF4-MLL ETV6-AMLI MLL p16/p14/p15 TAL1 TAL2 LCK TAN1 LYL1 RHOM1 RHOM2 TCL1 HOX11 Ig  Ig Ig H AF1P AF10 ENL ? ATM ? 13q14 Faderl S, et al. Cancer. 2003;98:

32 EPIDEMIOLOGIA DELLE LEUCEMIE ACUTE LAM Incidenza: 3,5 casi/ abitanti/anno Ogni età Età mediana: Esposizione professionale o iatrogena a Rx, benzene, chemioterapici LAL 80% delle LA per età < 15 aa 20% delle LA nell’adulto Agenti ambientali (?) eziologia virale (EBV, HTLV-1)

33 LEUCEMIE ACUTE: PROCEDURE DIAGNOSTICHE

34 LEUCEMIE ACUTE DIAGNOSI SANGUE PERIFERICO ASPIRATO MIDOLLARE IMMUNOFENOTIPO (Citofluorimetria) CARIOTIPO BIOLOGIA MOLECOLARE

35 CITOFLUORIMETRIA

36 Citofluorimetria: definizione Tecnica multiparametrica che misura le caratteristiche fisiche e/o chimiche di cellule in sospensione all’interno di un fluido di trasporto Tre componenti: 1.Fluida 2.Ottica 3.Elettronica

37 Citofluorimetria: principi base Nel citofluorimetro, singole cellule passano allineate attraverso un sistema di rilevazione ottico/elettronico. scatter di luce Parametri misurati fluorescenza

38 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid Camera di flusso (componente fluida) All’interno della camera di flusso, le particelle sono in fila grazie alla differenza di pressione tra il campione ed il fluido di trasporto Il raggio laser, di forma ellittica, è focalizzato in modo da colpire le cellule Al centro del canale di conta=fluido di trasporto

39 Componente ottica LIGHT SOURCE Fonte di luce: LASER (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation) Un microscopio usa la luce per illuminare le cellule sul vetrino Un citofluorimetro usa una fonte di luce monocromatica da focalizzare sulle cellule

40 FALS Detector Laser Forward scatter Forward scatter = indicatore relativo delle dimensioni cellulari

41 FALS Detector 90oLS Detector Laser Side (90 o ) scatter Indicatore relativo della complessità cellulare interna (granuli)

42 Laser Fluorescence FALS Detector Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.) Misura della fluorescenza Frequency Le diverse emissioni di colore per diverse sostanze fluorescenti vengono separate da filtri ottici per cui si possono analizzare separatamente le diverse fluorescenze I fotomoltiplicatori trasformano I segnali luminosi in impulsi elettrici Direttamente proporzionali alla luce Raccolta e gli impulsi vengono elaborati Da un software (conversione analogico-digitale)

43 Misura della fluorescenza: utilità  Le cellule possono essere identificate grazie alle loro molecole di superficie e relativo specifico marker (CD, “cluster di differenziazione”)  Anticorpi monoclonali per specifici antigeni CD possono essere utilizzati per identificare il tipo di cellula  L’anticorpo monoclonale può essere coniugato con un Fluorocromo (FITC, PE, Tandem ECD, PC5) e si può eseguire un test di immunofluorescenza diretta

44 Citofluorimetria: analisi e output dei dati I segnali luminosi, trasformati in impulsi elettrici, vengono processati da un sistema di conversione analogico-digitale Plot degli eventi in scala grafica Istogramma one-parameter Dot-plots a due dimensioni

45 Citofluorimetria: selezione della popolazione da analizzare Cluster analysis (software per analisi dei dati): analisi di tutti i marker in relazione a tutti gli eventi analisi di tutte le sottopopolazioni cellulari Gating (filtro dei dati): Forward scatter versus side-scatter CD45 versus side scatter analisi di una singola sottopopolazione per volta

46 Analisi citofluorimetrica nelle leucemie acute: immunofenotipo  Diagnosi delle leucemie acute  Classificazione delle leucemie acute  Monitoraggio malattia minima residua (sensibilità – )

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