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Lezioni di biotecnologie 2 Lezione 3 Biotecnologie avanzate 3 © Zanichelli editore, 2014.

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Presentazione sul tema: "Lezioni di biotecnologie 2 Lezione 3 Biotecnologie avanzate 3 © Zanichelli editore, 2014."— Transcript della presentazione:

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2 Lezioni di biotecnologie 2

3 Lezione 3 Biotecnologie avanzate 3 © Zanichelli editore, 2014

4 L’evoluzione delle biotecnologie Le biotecnologie hanno conosciuto un’evoluzione continua, grazie anche agli avanzamenti tecnologici. Infatti le biotecnologie sono una disciplina applicativa e quindi le loro potenzialità aumentano con l’aumentare del grado di perfezionamento degli strumenti a disposizione. Di seguito vedremo alcuni esempi di applicazioni biotecnologiche avanzate. 4 © Zanichelli editore, 2014

5 Le tecnologie “omiche” Per tecnologie “omiche” si intendono quelle applicazioni biotecnologiche che hanno un potere di indagine molecolare esteso all’intero potenziale codificante della cellula. Si distinguono: la genomica: che studia la dinamica di tutti i geni di un organismo; la proteomica: che studia l’intero complemento proteico cellulare. 5 © Zanichelli editore, 2014

6 Analisi genomica: microarray (I) Oggi è possibile analizzare l’espressione di tutti i geni di una cellula contemporaneamente grazie ai microarray o biochip. Si tratta di piccole lastre di vetro o plastica delle dimensioni di un chip di computer, su cui sono immobilizzate migliaia di sonde molecolari ognuna corrispondente ad una singola sequenza genica, all’interno di micropozzetti da 50 µm. Oggi sono disponibili set di microarray che coprono tutta la porzione codificante del genoma umano (90 milioni di sonde). 6 © Zanichelli editore, 2014

7 Analisi genomica: microarray (II) 7 Due biochip, uno per l’analisi del genoma umano e uno per quella del genoma del topo. Immagine: Schutz via Wikimedia Commons © Zanichelli editore, 2014

8 Analisi genomica: microarray (III) Una applicazione dei microarray è l’analisi dell’espressione differenziale di geni in due popolazioni cellulari. 1.L’mRNA è estratto da cellule di controllo (ad es. cellule di un individuo sano) e dal campione sperimentale (es. cellule tumorali). 2.L’mRNA viene convertito in cDNA e marcato con sonde fluorescenti di diverso colore per i controlli (ad es. verde) e i campioni (ad es. rosso). 8 © Zanichelli editore, 2014

9 Analisi genomica: microarray (IV) 9 3.I cDNA vengono ibridati al microarray. L’illuminazione al laser rivelerà segnali rossi o verdi in corrispondenza dei geni espressi solo in ciascuna delle due popolazioni, e gialle (rosso+verde) per quelli espressi in entrambe. © Zanichelli editore, 2014

10 Interferenza a RNA: generalità (I) Comprendere la funzione di un gene può essere più facile se si osserva l’effetto a livello cellulare (fenotipo) causato dalla mancata espressione del gene di interesse. L’inibizione dell’espressione di un gene viene detta silenziamento genico o knock down. È possibile silenziare uno specifico gene all’interno del genoma grazie alla tecnologia dell’ interferenza a RNA (RNA interference, RNAi). 10 © Zanichelli editore, 2014

11 L’RNAi è un processo naturale usato dalle cellule per regolare l’espressione genica. La cellula esprime RNA che non servono a codificare proteine, ma che sono processati da una serie di enzimi per generare dei corti RNA (20-30 nt) detti siRNA (small interfering RNA, piccoli RNA interferenti). Ciascun siRNA è complementare alla sequenza di un mRNA. Il suo appaiamento porta alla degradazione specifica dell’mRNA prima che venga tradotto. 11 Interferenza a RNA: generalità (II) © Zanichelli editore, 2014

12 12 Meccanismo di azione dell’interferenza a RNA Interferenza a RNA: generalità (III) © Zanichelli editore, 2014

13 Analoghi ai siRNA sono i miRNA (micro RNA) che inibiscono l’espressione genica anche a livello della traduzione (ribosomi). 13 Modello computerizzato di un miRNA Interferenza a RNA: generalità (IV) © Zanichelli editore, 2014

14 Interferenza a RNA: applicazioni (I) Grazie ai siRNA è possibile silenziare uno alla volta tutti i geni di un organismo. Una tipica applicazione consiste nell’identificare quali geni sono coinvolti in un certo processo (per esempio la crescita di cellule tumorali o l’infezione di un virus). Il punto di partenza è una libreria di siRNA, ciascuno specifico per un singolo gene del genoma. Oggi esistono librerie in grado di coprire la maggior parte dei geni umani (≈ siRNA). 14 © Zanichelli editore, 2014

15 Interferenza a RNA: applicazioni (II) Gli effetti del silenziamento genico per interferenza a RNA possono essere macroscopici, come nel caso del colore del fiore delle petunie. A sinistra la varietà di partenza, a destra gli effetti del silenziamento di alcuni geni coinvolti nella pigmentazione. 15 © Zanichelli editore, 2014

16 Analisi proteomica Così come è possibile analizzare la variazione di espressione di tutti i geni del genoma, è anche possibile studiare le variazioni dei livelli di tutte le proteine presenti nella cellula. Tecnologie molto diffuse sono quelle basate su microarray di proteine. 16 © Zanichelli editore, 2014

17 Microarray di proteine Sul microchip posono essere immobilizzati: anticorpi; proteine purificate; lisati cellulari. 17 © Zanichelli editore, 2014

18 Microarray di proteine: anticorpi Ogni anticorpo occupa un singolo micropozzetto ed è specifico per una singola proteina. Quando il lisato è messo in contatto con l’array, le proteine si legheranno al rispettivo anticorpo. Le proteine marcate con gruppi fluorescenti potranno essere lette al laser, rivelando così quali proteine sono state legate; l’analisi computerizzata consente anche di valutare la quantità di proteina legata. 18 © Zanichelli editore, 2014

19 Microarray di proteine: proteine purificate È possibile immobilizzare molte proteine diverse sul microchip. Questo array può venire interrogato con diversi ligandi (DNA, RNA, altre proteine) per studiare le interazioni con le proteine presenti sul microchip. Per esempio si può utilizzare questa tecnica per trovare tutte le proteine che legano una specifica sequenza di DNA o RNA, che viene somministrata sotto forma di sonda marcata con un gruppo fluorescente. 19 © Zanichelli editore, 2014

20 Microarray di proteine: lisati cellulari È possibile immobilizzare sul microchip anche un lisato cellulare. In questo caso non si conosce la posizione sull’array delle diverse proteine, che è casuale. L’array è interrogato con anticorpi specifici per una proteina nota, marcati con gruppi chemiluminescenti (come visto per il Western Blotting). Questa tecnica è usata per studiare la differente espressione di una proteina nota in condizioni diverse (ad es. cellule trattate vs. controllo). 20 © Zanichelli editore, 2014

21 Genome editing Il genome editing è una tecnica che consente di introdurre, eliminare o alterare sequenze di DNA all’interno del genoma in una posizione specifica. Questa tecnica si basa sull’utilizzo di particolari endonucleasi ingegnerizzate. Questi enzimi possono essere costruiti in modo da tagliare sequenze di DNA stabilite dallo sperimentatore. 21 © Zanichelli editore, 2014

22 Genome editing: ricombinazione (I) Grazie al specifiche endonucleasi è possibile introdurre un taglio in una regione specifica del genoma. Se insieme a questi enzimi si fornisce alla cellula una sequenza di DNA che contiene l’informazione che desideriamo introdurre (ad es. un gene) insieme a brevi sequenze fiancheggianti identiche a quelle presenti ai lati del sito di taglio, il macchinario cellulare inserirà il DNA esogeno nel punto in cui hanno agito le endonucleasi, grazie al fenomeno della ricombinazione omologa. 22 © Zanichelli editore, 2014

23 Genome editing: ricombinazione (II) 23 Un vettore (plasmide) che trasporta la sequenza omologa è inserito in una cellula animale Grazie alle endonucleasi il DNA esogeno Viene inserito nel cromosoma. © Zanichelli editore, 2014

24 Genome editing: knock in e knock out Con la tecnologia del genome editing è possibile inattivare un gene specifico (knock out) oppure introdurre un gene esogeno all’interno di una cellula (knock in). Queste tecniche trovano applicazione, oltre che negli studi su cellule in coltura, anche nella generazione di animali transgenici. 24 Le cellule cancerose dei topi possono essere rese fluorescenti ingegnerizzando gli animali per esprimere una particolare proteina chiamata GFP. © Zanichelli editore, 2014

25 Anticorpi monoclonali Uno strumento molto utile in ambito biotecnologico sono gli anticorpi monoclonali. Si tratta di anticorpi prodotti da un singolo clone di linfociti B e pertanto del tutto identici nella loro regione variabile (quella che riconosce l’antigene). Gli anticorpi monoclonali quindi riconoscono un’unica regione della proteina bersaglio (epitopo) e risultano essere altamente specifici. 25 © Zanichelli editore, 2014

26 Anticorpi monoclonali: produzione 26 © Zanichelli editore, 2014

27 Clonazione di interi organismi 27 © Zanichelli editore, 2014 Per clonazione artificiale si intende la generazione di un intero organismo a partire da una singola cellula non zigotica. Questa tecnica permette di ottenere copie geneticamente identiche dell’organismo di partenza e trova applicazioni nella zootecnia (ad es. per riprodurre animali dalle caratteristiche eccellenti come cavalli da corsa, mucche da latte o tori da riproduzione), ma anche nella conservazione dell’ambiente (per esempio per ripopolare specie animali in via di estinzione che non è possibile fare riprodurre naturalmente in cattività).

28 28 © Zanichelli editore, 2014 Trasferimento nucleare (I) La tecnica più diffusa è quella del trasferimento nucleare: 1.Il nucleo aploide di una cellula uovo ricevente viene sostituito con il nucleo contenente il genoma diploide di una cellula somatica del donatore; 2.Lo pseudo-zigote (cellula uovo resa diploide non per fecondazione con uno spermatozoo) dà origine a un embrione, anche se il suo genoma deriva da una cellula adulta (cioè differenziata);

29 29 © Zanichelli editore, 2014 Trasferimento nucleare (II) 3.L’embrione viene trasferito nell’utero di una femmina della specie donatrice (madre surrogata); 4.La prole avrà il genoma identico (clone) a quello della cellula somatica donatrice.

30 30 © Zanichelli editore, 2014 Trasferimento nucleare (III) Con questa tecnica è stata generata nel 1996 la pecora Dolly, il primo animale a essere clonato da una cellula somatica. La pecora Dolly nacque, clonata, nel 1996 e visse per sette anni, durante i quali diede alla luce diversi cuccioli; ora è conservata in un museo a Edimburgo.

31 Le biotecnologie sono applicazioni tecnologiche di fenomeni naturali Tutte le tecniche esposte finora, dalle più semplici alle più avanzate, hanno una caratteristica comune: sono derivate da processi naturali. Le biotecnologie, infatti, sfruttano le proprietà biologiche delle molecole (DNA, RNA, proteine) e i processi fisiologici corrispondenti (replicazione del DNA, risposta immunitaria, etc.), replicandoli in sistemi in vitro controllati e adattandoli alle particolari esigenze dell’operatore. 31 © Zanichelli editore, 2014


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