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Immunologia dei trapianti Per trapianto si intende il trasferimento di cellule, tessuti, organi, da un individuo detto donatore a uno detto ricevente.

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Presentazione sul tema: "Immunologia dei trapianti Per trapianto si intende il trasferimento di cellule, tessuti, organi, da un individuo detto donatore a uno detto ricevente."— Transcript della presentazione:

1 Immunologia dei trapianti Per trapianto si intende il trasferimento di cellule, tessuti, organi, da un individuo detto donatore a uno detto ricevente. Il fallimento di tale trasferimento è detto rigetto: questo è causato da una risposta immunitaria specifica.

2 autologo: da un individuo allo stesso individuo singenico: tra due individui geneticamente identici allogenico: tra individui della stessa specie ma geneticamente differenti xenogenico: tra individui di specie differenti Le molecole riconosciute come estranee nel trapianto allogenico sono dette alloantigeni I linfociti (e gli ab) che reagiscono contro tali molecole sono detti alloreattivi

3 Riconoscimento degli alloantigeni Le molecole MHC sono le responsabili della maggior parte delle reazioni di rigetto. Esse vengono presentate per il riconoscimento ai linfociti T in due modi differenti: diretto, quando sono esposte sulle APC del donatore e riconosciute dai linfociti T del ricevente indiretto, quando le APC del ricevente le processa come proteine antigeniche (del donatore), e vengono riconosciute dai linfociti T del ricevente. riconoscono" significa sempre "riconoscono come estraneo": quindi qualsiasi cosa sia non-self è riconosciuta, compreso un MHC non self.

4 Attivazione dei linfociti alloreattivi Abbiamo visto come sia la via diretta che indiretta vadano ad attivare i linfociti T alloreattivi Il punto fondamentale è l’esistenza di APC che presentano gli antigeni allogenici Attivati, i linfociti alloreattivi migrano nel nel sito di trapianto e ne causano il rigetto.

5 CD4: danno il contributo maggiore al rigetto, una volta differenziati in effettori, secernono citochine che danneggiano l’organo trapiantato CD8: attivati dalla via diretta da APC del donatore si differenziano in CTL che eliminano le cells che esprimono MHC I allogenici Queste risposte vengono studiate in vitro mediante la MLR (reazione linfocitaria mista). Tale processo è usato come predittivo nel rigetto in un trapianto e si basa sull’incontro delle popolazioni linfocitarie dei due individui e nell’osservazione di assenza o presenza di proliferazione.

6 Alloriconoscimento  principale causa del rigetto di trapianti solidi;  principale causa del GVHD (Graft Versus Host Desease) in trapianti di midollo. Mixed Lymphocyte Reaction: MLR

7 L’MLR (mixed lymphocyte reaction) può essere usata per determinare l’istoincompatibilità

8 MLR: BALB/c MHC APLOTYPE d C57BL/6 MHC APLOTYPE b Purificaz MHC-d T cell Purificaz MHC-d splenociti Purificaz MHC-b T cell Purificaz MHC-b splenociti

9 PURIFICAZIONE: Utilizzo di Ab diretti contro T cells (anti-CD4 e anti-CD8) coniugati con MICROBEADS di metallo Y CD4+ T cell CD4 Y CD8+ T cell CD8

10 Y T cell Y Y Y Y Y Y DC Sospensione unicellulare da milza: MAC B cell APC T cell Y APC Y T cell Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y

11 MAGNETE Sospensione cellulare + Anticorpi Y T cell Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y APC

12 Selezione positiva Selezione negativa

13 Mix: MHC-d T cell MHC-b splenociti MHC-d splenociti MHC-b T cell MHC-b T cell MHC-b splenociti MHC-d T cell MHC-d splenociti Balb T cells react with C57 splenocytes C57 T cells react with Balb splenocytes Balb T cells don’t react with Balb splenocytes C57 T cells don’t react with C57 splenocytes

14 READ OUT: IL2 production (Sandwich ELISA) IL2 production Balb T cells react with C57 splenocytes C57 T cells react with Balb splenocytes Balb T cells don’t react with Balb splenocytes C57 T cells don’t react with C57 splenocytes

15 Mixed Lymphocyte Reaction (MLR) milza di topo C57 (splenociti C57, T cells C57); milza di topo BALB (splenociti BALB, T cells BALB) Preparazione della milza per MLR Trasferire la milza dalla falcon nel setaccio contenuto nella Petri Omogenare la milza con il pistone di una siringa da 5 ml premendo contro il fondo del setaccio con movimenti circolari Eliminare il setaccio, raccogliere le cells di milza, metterle in un tubo da 50ml Lavare la piastra con 3 ml di terreno e aggiungerli alla falcon da 50 ml Filtrare su cell streiner da 0.45 in un nuovo tubo da 50 ml Centrifugare 5 minuti a 1200 rpm Scartare il surnatante Risospendere le cellule in 3 ml di RBC Lysis Buffer Lasciare in ghiaccio per 5 minuti Centrifugare 5 minuti a 1200 rpm Eliminare il surnatante Risopendere le cellule in 5 ml di PBS Contare le cellule diluite 1:10 Utilizzare per i passaggi successivi un n. max di 40x10 6 cellule

16 Purificazione delle cellule T su colonna Centrifugare le cellule a 1200 rpm per 5 minuti Risosp. il pellet, dopo aver eliminato il surnat. in 360  l di PBS Aggiungere 80  l di CD4/CD8 MicroBeads Miscelare bene Incubare per 15 minuti a 4 ー C Lavare le cellule con 4 ml di PBS Centrifugare a 1300 rpm per 5 minuti Risospendere il pellet in 500  l di PBS Equilibrare una MS column con 500  l di PBS Sostituire il tubo di raccolta sotto il magnete Caricare la sospensione cellulare sulla colonna Lavare con 1 ml di PBS per 3 X (raccogliere nello stesso tubo) Conservare la frazione negativa (splenociti) Staccare la colonna dal magnete Fluxare con 1 ml di PBS in un nuovo tubo Conservare la frazione positiva (T cells)

17 MLR: Contare gli splenociti (cellule della frazione negativa) Contare le cellule T (cellule della frazione positiva) Portare le cells alla conc. di 1x10 6 /ml con terreno completo In piastra da 48 wells piastrare 4 x 10 5 splenociti e 2 x 10 5 cellule T nelle seguenti combinazioni: a) splenociti BALB con T cells C57 b) splenociti BALB con T cells BALB c) splenociti C57 con T cells BALB d) splenociti C57 con T cells C57


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