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Metodi per lo studio dell’espressione genica su larga scala:  ESTs  SAGE  Microarray MICROARRAY SAGEEST Computational analysis of data by statistical.

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1 Metodi per lo studio dell’espressione genica su larga scala:  ESTs  SAGE  Microarray MICROARRAY SAGEEST Computational analysis of data by statistical methods

2 ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico L’espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare momento dello sviluppo e’ attivo solo un sottoinsieme dei geni

3 REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA Puo’ agire su ciascuno dei livelli che caratterizzano il passare dell’informazione genica dal DNA alle proteine Negli Eucarioti superiori la regolazione dell’espressione genica si svolge principalmente come controllo della trascrizione Principali tipi di regolazione: Controllo epigenetico Controllo trascrizionale Controllo post-trascrizionale

4 “One-gene approach” Il gene di interesse e’ espresso in un tessuto o in un dato momento dello sviluppo ? Quanto e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? Profilo d’espressione del genoma (TRASCRITTOMA) Quali geni sono espressi in un tessuto ed in un dato momento dello sviluppo ? Quanto ciascuno di essi e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? “Large-scale approach” Real Time PCR PCR semiquantitativa Ibridazione DNA genico o cDNA con RNA totale o poly(A)+RNA (Northern blot) Ibridazione in situ

5 METODI PER LO STUDIO SU LARGA SCALA DELL’ESPRESSIONE GENICA Sequenziamento sistematico di ESTs da librerie di cDNA SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) cDNA microarrays

6 mRNA of different genes cDNA LIBRARY EST SEQUENCING EST

7 ESTIMATE OF THE LEVEL OF EXPRESSION OF A GIVEN GENE Sample of ESTs corresponding to 4460 genes/trascripts eg. Rhodopsin: 65 retina ESTs  65 / = 0.503% UniGene Human Release Statistics Total sequences in clusters: Total number of clusters sets: sets contain at least one known gene 94710sets contain at least one EST 20876sets contain both genes and ESTs EST

8 SAGE Serial Analysis of Gene Expression SAGE è un metodo sperimentale ideato per utilizzare i vantaggi del sequenziamento su larga scala per avere informazioni quantitative di espressione genica (Velculescu et al. 1995, Zhang et al, 1997) Con questa tecnica e’ possibile stimare il livello d’espressione di ciascun gene, attraverso la misura del numero di volte in cui la TAG che lo rappresenta compare in un campione abbastanza grande di TAGs sequenziate a partire dal messaggero del tessuto in analisi Tag to Gene mapping  Gene to Tag mapping Consiste nel sequenziamento da messaggeri cellulari di brevi oligonucleotidi, che fungono da etichette di sequenza (TAG) SAGE

9  una sequenza di 9 paia di basi permette di identificare 49 (262144) diversi trascritti (una "tag" viene ottenuta da una posizione specifica di ogni trascritto).  le "tag" possono essere unite insieme in serie, a costituire lunghe molecole di DNA, che vengono clonate e sequenziate.  il numero di volte in cui una singola "tag" viene osservata permette di quantificare l'abbondanza del messaggero identificato nella popolazione dei messaggeri e, indirettamente, il livello di espressione del gene corrispondente. SAGE

10 Esperimenti di Microarray Permettono l’analisi dell’espressione di migliaia di geni simultaneamente MICROARRAY

11

12 GeneChip Affymetrix Ibridizzazione della sonda marcataScansione del GeneChip con scanner laser

13 Analisi dell’immagine Identificazione della posizione degli spot Costruzione di un’area locale intorno ad ogni spot Calcolo dell’intensità di ogni singolo spot Calcolo del background locale MICROARRAY

14 Elaborazione dei dati MICROARRAY

15 SAGEEST

16 Matrice dei risultati con più condizioni sperimentali Cond. 1Cond. 2 … Cond. m Gene 1 x 11 x 12 …x 1m Gene 2 x 21 x 22 …x 2m … ………… Gene n x n1 x n2 …x nm Quali geni sono differenzialmente espressi ? Quali e quanti geni sono coespressi?

17 Obiettivi dell’analisi saranno…  Identificazione geni differenzialmente espressi  Identificazione pattern di espressione comuni  Identificazione di geni co-espressi con geni di funzione nota

18 CLUSTER ANALISI Il CLUSTERING o analisi cluster o analisi di raggruppamento è un insieme di tecniche di analisi multivariata dei dati volte al raggruppamento di elementi omogenei. Un insieme di oggetti grande e disomogeo viene classificato in una serie limitata di gruppi omogeneei, ovvero “vicini” in accordo con una specifica misura di distanza.

19 CLUSTER ANALISI Come si effettua una cluster analisi? Si parte dalla matrice dei dati X di dimensione nxp e la si trasforma in una matrice nxn di dissimilarità o di distanze tra le n coppie di osservazioni (vettori di p elementi). Si sceglie poi un algoritmo che definisca le regole su come raggruppare le unità in sottogruppi sulla base delle loro similarità. Lo scopo e’ di identificare un cero numero di gruppi tali che gli elementi appartenenti ad un gruppo siano – in qualche senso – piu’ simili tra loro che non agli elementi appartenenti ad altri gruppi.

20 DUE STEPS: Misura di similarita’ Diverse misure Standardizzazione dei dati Linking method criterio per stabilire i gruppi Metodi gerarchici e non gerarchici CLUSTER ANALISI

21 Identificazione di gruppi di geni con profili di espressione simili Simili rispetto a cosa ? Definizione di distanza I geni sono punti nello spazio: punti vicini nello spazio sono raggruppati insieme

22 Var. 1Var. 2…Var. m 1x 11 x 12 …x 1m …………… nx n1 x n2 …x nm Ogni riga è un punto in uno spazio di m dimensioni n punti in uno spazio di m dimensioni m = 3 Var 1 Var 2 Var 3

23 Livelli vs. Pattern Ogni profilo può essere inserito in un grafico … Variabili X 1243m 1 2 Var. 1Var. 2…Var. m 1x 11 x 12 …x 1m …………… nx n1 x n2 …x nm

24 Distanza euclidea Correlazione di Pearson

25 1- Data Matrix PROBESET/GEN ECD34 Eritroblas ti Mieloblas tiMKC Monoblas tiMonocitiNeutrofiliEosinofili GC00U921857_at GC00U922066_at GC00U990452_at GC00U990575_at GC00U990668_at GC00U990680_at GC00U990706_at GC01M033561_at GC01M035219_at GC01M035470_at GC01M035671_at GC01M035737_at GC01M035952_at GC01M035958_at GC01M036333_at

26 2- Data representation

27 3-Distance and linking method selection

28 4 - Result

29 Pearson QT clustering Insieme disomogeneo di 40 geni 6 cluster, gruppi omogenei


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