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Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Biochimica e Biologia Molecolare - Principi e tecniche nuova edizione italiana a cura di M.S. Pilone e L. Pollegioni.

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1 Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Biochimica e Biologia Molecolare - Principi e tecniche nuova edizione italiana a cura di M.S. Pilone e L. Pollegioni Anno/Pagine: 2006 pp.778 Euro: 104,00 Fabrizio Loreni Tel Antonella Ragnini Tel

2 Le lezioni si svolgeranno il mercoledì dalle 11 alle 13 in aula 2 (dall’10 marzo). Le esercitazioni si svolgeranno il martedì e il mercoledì dalle 14 alle 18 (dal 16 marzo) nel laboratorio al PP1 secondo due turni: A (martedì) e B (mercoledì) Le esercitazioni sono organizzate in gruppi da 3 persone. Valutazione: 2 test in itinere (il primo sarà il 7/4/10) e relazione del laboratorio (vedi linee guida)

3 DNA endogeno DNA esogeno (transgeni) RNA strutturale mRNA Acidi nucleici come materiale di studio

4 Isolamento DNA da cellule eucariotiche

5 1. lisi cellulare 2. purificazione Isolamento acidi nucleici 2a. deproteinizzazione 2b. concentrazione

6 Metodi di lisi cellulare TecnicaApplicazione Metodi non meccanici Shock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule vegetali Congelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteri Enzimi litici Cellule animali e vegetali Metodi meccanici Pestello e mortaio Tessuti resistenti Sfere di vetro Batteri e funghi Omogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animali Omogenizzatore a mano Tessuti molli delicati Estrusione solida (Hughes press) Materiale vegetale resistente Estrusione liquida (French press) Microorganismi UltrasonicazioneMicroorganismi

7 Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici Precipitazione: cationi + etanolo (Na, NH4) isopropanolo Purificazione acidi nucleici

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10 Isolamento DNA

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12 Protocollo “classico” Colonnine cromatografiche (kit commerciali) Isolamento DNA plasmidico

13 Protocollo classico Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Risospensione in TE

14 Isolamento RNA

15 Purificazione mRNA

16 Spettrofotometro (fotometro) Elettroforesi su gel Analisi acidi nucleici

17 Spettro di assorbimento del DNA lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD 260 =50  g/ml OD 260 /OD 280 =1,8-2,0

18 Clonaggio PCR Amplificazione DNA

19 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

20 Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore (ligasi) Introduzione nella cellula ospite Selezione Minipreparazione di plasmidi per verifica Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi

21 Origine di replicazione Sito di clonaggio Marcatore di selezione Caratteristiche vettori plasmidici

22 Vettori plasmidici

23 strategie controlli Reazione di ligasi

24 Trattamento del vettore con fosfatasi G CTTAAp pAATTC G G AATTC CTTAApG GpAATTC CTTAA G DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI G CTTAA AATTC G fosfatasi GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG

25 Clonaggio con doppia digestione GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA G CTTAA AGCTT A EcoRI AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII AAGCTT TTCGAA HindIII

26 Controllo della reazione di ligasi Reazione (vettore + inserto)Controllo (vettore) ligasi trasformazione ligasi trasformazione Colonie con vettore ricombinante + Colonie con vettore “vuoto” selezione

27 Metodi di trasformazione dei batteri Metodo del cloruro di calcio Elettroporazione

28 Strategie di selezione nel clonaggio

29 Vettori plasmidici

30 Strategie di selezione nel clonaggio

31 Vettori di espressione

32 Vettore di espressione in cellule di mammifero EUCARIOTICO

33 Vettori di espressione inducibili

34 promTag o rep. cDNA term trascrizione traduzione Proteine di fusione

35 Espressione proteine di fusione

36 PCR (polymerase chain reaction)

37 PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

38 PCR da DNA genomico

39 PCR da mRNA (RT-PCR)

40 Uso dei “linkers”

41 Vettori dA:dT 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’

42 PCR da DNA genomico EcoRI BamHI EcoRI

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