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Caratterizzazione di proteine mediante tecniche di MS Delia De Filippo.

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Presentazione sul tema: "Caratterizzazione di proteine mediante tecniche di MS Delia De Filippo."— Transcript della presentazione:

1 Caratterizzazione di proteine mediante tecniche di MS Delia De Filippo

2 Emoglobina Proteina tetramerica di forma sferica Proteina tetramerica di forma sferica MW MW Due componenti: Due componenti: 1. proteica (globine) 2. prostetica (gruppi eme)

3 Struttura 4 catene polipetidiche 4 catene polipetidiche 4 gruppi eme 4 gruppi eme(ferro-protoporfirina9) Ogni catena α formata da 141 amminoacidi Ogni catena β formata da 146 amminoacidi

4 Anomalie nella sintesi della globina possono tradursi in: a)Alterazioni qualitative della sequenza degli amminoacidi (emoglobinopatie) b)Alterazioni quantitative della sintesi di una delle catene della globina (sindromi talassemiche) Sintesi della globina

5 Emoglobinopatie Le cause possono essere: a) Sostituzione di un amminoacido nella sequenza b) Delezione c) Formazione di catene peptidiche costituite da frammenti di due catene normali

6 Anemia falciforme Anemia emolitica cronica, ereditaria e familiare Anemia emolitica cronica, ereditaria e familiare Caratterizzata da una particolare alterazione morfologica delle emazie e dalla presenza di un’emoglobina anomala (HbS) Caratterizzata da una particolare alterazione morfologica delle emazie e dalla presenza di un’emoglobina anomala (HbS) Mutazione avviene in posizione 6 dove il glutammato è sostituito da valina.

7 Altri esempi di mutazioni HbC acido glutammico  lisina HbM istidina  tirosina

8 HPLC (High Pressure-Performance Liquid Cromatography) Tecnica cromatografica che permette di separare due o più composti presenti in una soluzione. Un cromatogramma per essere ritenuto accettabile deve avere una buona risoluzione (parametro che mette in relazione efficienza, selettività e fattore di ritenzione).

9 ES/MS (ElectroSpray/MS) Tecnica adatta all’analisi di macromolecole che variano la propria massa da meno di 100 Da a più di Da. Nello spettro ogni picco rappresenta la molecola intatta della proteina che trasporta un numero differente di protoni. I valori di m/z possono essere espressi cm segue: m/z =(Mw+nH + )/n dove Mw = massa molecolare del campione; n = numero di protoni sugli ioni e H = massa di un protone = Da.

10 MALDI/MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) La differenza di potenziale V all’ estremità della camera di ionizzazione, impartisce agli ioni uscenti dalla camera un’energia cinetica : 1/2mv 2 = eV da cui : v = (2eV/m) dato che v=s/t e quindi t=s/v segue che t(TOF) = (m)s/ (2eV) Poiché il tempo necessario ad una molecola per colpire il rilevatore è proporzionale alla sua massa ciò che otteniamo è un grafico del Mw sull’asse x ed il numero di molecole con un determinato Mw sull’asse y.

11 Da

12 VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGR LLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKV KAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSE LHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGK EFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH

13 Mass (m/z) % Intensity Da VHLTPEE N SAVTALWGK


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