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By NA 1 Fibrosi Cistica I Lezione 7. By NA 2 FACIES  ECCESSIVA PRODUZIONE DI SECREZIONI DENSE. * Malassorbimento cronico che comporta incapacita’ di.

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1 By NA 1 Fibrosi Cistica I Lezione 7

2 By NA 2 FACIES  ECCESSIVA PRODUZIONE DI SECREZIONI DENSE. * Malassorbimento cronico che comporta incapacita’ di crescere normalmente(deficit della secrezione degli enzimi pancreatici e quindi insufficiente digestione delle proteine e grassi). * Frequenti infezioni del tratto respiratorio da semplici raffreddori a polmoniti (ostruzione delle vie respiratorie minori da parte di un muco denso e loro colonizzazione da parte di batteri). * SECREZIONE DI NaCl NEL SUDORE(TEST DIAGNOSTICO)  LA CF E’ SOGGETTA AD EFFETTO DEL FONDATORE (e’ presente in molte razze, ma e’ piu’ frequente nella popolazione del Nord-Europa) 1 affetto/ portatore/25 H-W q 2 = 1/2500  q=1/50  p=1-q=49/50   2pq=2x49/50x1/50= 1/25 Cos’e’ la Fibrosi cistica

3 By NA 3 Aa aa aa A-  I portatori di CF sono molto frequenti anche per effetto del VANTAGGIO DELL’ETEROZIGOTE: gli eterozigoti hanno un vantaggio riproduttivo rispetto agli omozigoti (potrebbe essere dovuto al fatto che sono maggiormente resistenti alla salmonella tiphi, un batterio che richiede Cl per crescere e riprodursi e la CF e’ causata da un difetto del canale del Cl).  GENITORI PORTATORI HANNO IL 25% DI PROBABILITA’ DI AVERE UN FIGLIO AFFETTO E INDIVIDUI SANI CON UN FRATELLO O SORELLA AFFETTO HANNO 2/3 DI PROBABILITA’ DI ESSERE PORTATORI. Eredita’ autosomica recessiva

4 By NA 4  1985: Analisi di linkage : il gene della fibrosi cistica (CF) viene associato ad un polimorfismo proteico (enzima paraossonasi) di cui si ignora la localizzazione. Fibrosi Cistica un po’ di storia Perche’ il linkage?  Perche’ non si hanno informazioni sulla natura del prodotto del gene: si sa solo che da qualche parte del genoma c’e’ un locus la cui sequenza, quando mutata, provoca la Fibrosi cistica. Si applica il clonaggio posizionale

5 By NA 5 Ripuntualizziamo la definizione di gene * il “gene” mendeliano e’ un entita’ astratta identificata dalla modalita’ di segregazione e dalla mappatura in un locus * il “gene” molecolare e’ una sequenza codificante con una organizzazione definita: 5’UTR, esoni,introni, 3’UTR.... corrispondente ad una sequenza amminoacidica o piu’genericamente ad un trascritto * il locus e’ una regione genomica la cui espressione porta ad un fenotipo: per cui e’ piu’ giusto parlare di locus-malattia che di gene- malattia. Il locus puo’ essere piu’ grande del gene molecolare. Il linkage si fa fra locus, non fra geni molecolari

6 By NA 6 Come fare il linkage * Testando tutte le famiglie in cui e’ presente almeno un affetto con polimorfismi del DNA di cui si conosce la localizzazione. Quando si trova il linkage ho mappato fisicamente il locus Non ho trovato il gene corrispondente al mio carattere : adesso so dove andarlo a cercare Ho trovato il gene?!  NO!!! Torniamo a Mendel

7 By NA 7 Durante la formazione dei gameti la segregazione di una coppia di alleli di un locus e’ indipendente dalla segregazione degli alleli di un’altro locus 2 a legge di Mendel

8 By NA 8 Risultati possibili * Rapporto fenotipico diverso dovuto alla formazione di 4 tipi di gameti che si originano tutti con la stessa probabilita’ e diano tutte le possibili combinazioni RY 1/4 Ry 1/4 ry 1/4 rY 1/4 RY 1/4 RRYY 1/16 RRYy 1/16 RrYy 1/16 RrYY 1/16 Ry 1/4 RRYy 1/16 RRyy 1/16 Rryy 1/16 RrYy 1/16 ry 1/4 RrYy 1/16 Rryy 1/16 rryy 1/16 rrYy 1/16 rY 1/4 RrYY 1/16 RrYy 1/16 rrYy 1/16 rrYY 1/16 Gameti 1  9 : 3 :

9 By NA 9 Rapporto mendeliano nell’assortimento indipendente X P F1F1 F2F2 Meiosi 4 tipi di gameti in rapporti uguali X gamete A 1 /A 1 B 1 /B 1 A 1 /A 1 ;B 1 /B 1 1A 1 B 1 A 1 B 1 A 2 B 2 1 A 1 /A 1 ;B 1 /B 1 : A 1 B 1 A 1 B 1 A 1 B 2 A 2 B 1 A 2 B 2 A 1 B 1 1A 1 B 2 1A 2 B 1 1A 2 B 2 A 1 A 2 B 1 B 2 1 A 1 /A 1 ;B 1 /B 2 : A 1 B 2 B 1 1 A 1 /A 2 ;B 1 /B 1 : A 2 A 1 B 1 A 2 /A 2 ;B 2 /B 2 A 1 /A 2 ;B 1 /B 2 1 A 1 /A 2 ;B 1 /B 2 A 2 A 1 B 2 B 1

10 By NA 10 Rapporto genotipico nell’associazione completa F2F2 meiosi 2 tipi di gameti in rapporti uguali A1A1 B1B1 1 gamete A 2 ;B 2 X A 1 /A 1 ;B 1 /B 1 X P F1F1 A 2 /A 2 ;B 2 /B 2 A1A1 B1B1 A1A1 B1B1 A2A2 B2B2 A2A2 B2B2 A1A1 B1B1 A2A2 B2B2 A 1 /A 2 ;B 1 /B 2 A2A2 B2B2 1 A2A2 B2B2 A1A1 B1B1 A2A2 B2B2 A2A2 B2B2 A2A2 B2B2 A 2 /A 2 ;B 2 /B 2

11 By NA 11 A2A2 B1B1 Rapporto genotipico nella associazione parziale 4 tipi di gameti in rapporti non uguali 80% parentali20% ricombinanti gamete A 1 ;B 1 X F2F2 :: : A 1 /A 1 ;B 1 /B 1 X P F1F1 A 2 /A 2 ;B 2 /B 2 A1A1 B1B1 A1A1 B1B1 A2A2 B2B2 A2A2 B2B2 A1A1 B1B1 A2A2 B2B2 A 1 /A 2 ;B 1 /B 2 A1A1 B1B1 A2A2 B2B2 A1A1 B2B2 A1A1 B1B1 A1A1 B1B1 A1A1 B1B1 4 A 1 /A 1 ;B 1 /B 1 A2A2 B2B2 A1A1 B1B1 4 A 1 /A 2 ;B 1 /B 2 A1A1 B2B2 A1A1 B1B1 1 A 1 /A 1 ;B 1 /B 2 A2A2 B1B1 A1A1 B1B1 1 A 1 /A 2 ;B 1 /B 1

12 By NA 12 Ricordiamo l’incrocio a 3 punti A BC abcabc tutti i possibili gameti A B C a b c parentali 1 2 crossing over #1 A b c a B C crossing over #2 A B c a b C crossing over 1+2 A b C a B c  Ma questo incrocio ha “l’aplotipo” noto!

13 By NA 13 Ancora terminologia / Aplotipo: genotipo del gamete. Se prendo in considerazione 3 locus ognuno presente nella popolazione con 2 alleli i genotipi possibili nei gameti sono: A1,B1,C1; A2,B1,C1; A1,B2,C2; A1,B1,C2; ETC.... a priori non so chi sta con chi. Nelle popolazioni naturali solo l’analisi della progenie mi dice quale era l’aplotipo dei parentali e solo nei grandi numeri. Le cose si complicano ulteriormente quando non disponendo di “fenotipi codominanti” come i polimorfismi posso seguire i loci solo con caratteri soggetti alla dominanza e recessivita’.  In alternativa al termine aplotipo si usa spesso il termine fase Ricordate fase cis e trans? Accoppiamento e repulsione? Sono sinonimi di aplotipo sopratutto quando si parla di locus corrispondenti a caratteri dominanti e recessivi

14 By NA 14 SE I LOCI NON SONO ASSOCIATI LA PROBABILITA’ E’ 1/2 X 1/2 X 1/2 X1/2 = 1/16= ABAB ABAB abab abab ABAB abab abab abab abab abab abab abab ABAB abab AbAb abab NON RICOMBINANTI RICOMBINANTE SE LA FREQUENZA DI RICOMBINAZIONE E’ 10% LA P DI 3 NR E 1R= 0.1X0.9X0.9X0.9=0.073=7.3% Non ho la possibilita’ di scegliere fra le due ipotesi: solo un gran numero di osservazioni mi potrebbe permettere di riconoscere quale e’ la situazione piu’ probabile NON ESISTE NULLA CHE POSSA SOSTITUIRE I GRANDI NUMERI….COME POSSIAMO OTTENERE GRANDI NUMERI NELL’UOMO??? Probabilita’ di trovare ricombinanti SE I LOCI SONO ASSOCIATI LA PROBABILITA DIPENDE DA QUANTO SONO DISTANTI NB non si conosce la loro posizione reciproca quindi ci sono due possibilita’

15 By NA 15  ATTENZIONE ALLA RICOSTRUZIONE DELLA FASE * Fase : combinazione degli alleli di una regione che deriva da ciascun genitore. Se la fase non e’ nota bisogna sommare il lod score che si ottengono ipotizzando le possibili fasi. * Meiosi informative: sono quelle che danno informazioni sulla ricombinazione. a1a1 a2a2 a1a2 a1a2 a1a2 a1a2 a3a4 a1a2 a1a2 a1a1 a1a4 non infor. infor. Linkage:fase

16 By NA 16 2 Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle famiglie. E’ necessario risalire alla fase e identificare i ricombinanti Linkage:fase di piu locus  Possedere un particolare polimorfismo non vuol dire avere la malattia, lo studio di linkage e’ a livello di popolazione, serve ad individuare una regione non la mutazione patologica(tutti hanno il locus alcuni hanno l’allele mutato in patologico) ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF Ricomb ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF ABCDEFABCDEF

17 By NA 17  Ci possono essere inconvenienti che complicano la possibilita’ di assegnare un locus malattia a una regione definita da marcatori: Linkage possibili inconvenienti  Errori umani: errata lettura dei dati, scambio di campioni, paternita’……  Errori diagnostici: un falso ricombinante.Se i marcatori sono molti e vicini la presenza di un doppio ricombinante fa sospettare un errore  Eterogeneita’ genetica: famiglie con fenotipo simile vengono accorpate e non si riesce a trovare il linkage. Sclerosi tuberosa: due loci distinti Nelle recessive il problema e’ la necessita’ di utilizzare solo le famiglie piccole.  E’ importante disporre di numerosi siti polimorfici

18 By NA 18 I polimorfismi Oggi si dispone di una serie di nuovi polimorfismi del DNA che permettono di aumentare l’informativita’ degli incroci

19 By NA 19  Polimorfismo RFLP esempio Lunghezza dei frammenti Alleli identificati dall’ibridazione su Southern Possibile interpretazione dei risultati I II III I1 I2I3 I4II1II2 III1 III2 III3 III4 III5 III6 III7 III8

20 By NA 20 RFLP e Paternita’ A B C D E F G F e’ la madre di G A, B, C, D,E sono indiziati di stupro chi e’ il padre del bambino? E

21 By NA 21 due individui, tre enzimi Gel Filtro corrispondente B=BamHI E= EcoRI H=HindIII Evidentemente c’e’ un sito B polimorfico perche’ un soggetto e’ omozigote per 2.8 e l’altro per 13. La lunghezza dei frammenti mi permette di costruire una mappa di restrizione e di mappare la sonda rispetto ai siti. La differente quantita’ di DNA fra i due campioni e’ evidente dalle diverse dimensioni del segnale H E B B*E H B 10KB 13KB 3.7KB 2.8 E’ quindi presente un polimorfismo, probabilmente frequente nella popolazione: infatti se prendendo due individui a caso nella popolazione trovo due omozigoti e’probabile che gli eterozigoti siano frequenti. Per gli altri due siti non si puo’ dire se siano polimorfici o no: due individui sono troppo pochi per escluderlo.

22 By NA 22  Mini e micro satelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con PCR  Polimorfismo PCR

23 By NA 23 VARIAZIONI ANCHE DI 1 SOLA BASE PROVOCANO UNA DIFFERENZA NELLA CORSA SU GEL Caricamento su gel SSCP : Single Strand Conformational Polymorphism Omozigote Wild-typeOmozigoteMutante PCR Eterozigote Omo WTOmo mutetero Questo test si utilizza per identificare la variazione di una base senza dover ricorrere al sequenziamento. Si possono identificare il 70%-95% delle mutazioni di singola base in frammenti di lunghezza inferiore alle 200pb. Denaturazione Reverse Forward Reverse Forward C G C G C G A T A T A T C G C G C G A T A T A T C G A T

24 By NA 24 SNPs L’allele X T e X C sono distinguibili dopo digestione con TaqI. L’amplificato e’ di 1241 bp dopo digestione se e’ presente la sostituzione si hanno 2 bande La sostituzione di una base puo’ provocare la perdita o l’insorgenza di un sito di restrizione, utilizzando PCR e digestione dell’amplificato si puo’ rapidamente evidenziare l’avvenuto cambiamento senza utilizzare il southern, il radioattivo etc.. Gene qualunque: non e’ importante chi e’ e’ il concetto che conta 1241bp 750bp 491bp X C X C X C X T X C X C X C X C

25 By NA 25 SNPs L’allele X T e X G sono distinguibili dopo digestione con PvuII. L’amplificato e’ di 1392 bp dopo digestione se e’ presente la sostituzione si hanno 2 bande: 1163 e 229 Gene qualunque: non e’ importante chi e’ e’ il concetto che conta 1392bp 1163bp La banda di 229 non si vede 1, 2, 4, 7, 8 sono eterozigoti X T X G 3,9, 12 sono omozigoti X T X T 5,6,10, 11 sono omozigoti X G X G

26 By NA 26 SNPs L’allele Y T e Y C sono distinguibili dopo digestione con HgaI. Y T non si digerisce e rimane di 220 bp, Y C origina due bande 180bp e 40bp (che non si vede) Gene qualunque: non e’ importante chi e’ e’ il concetto che conta 220bp 180bp C C 0 controllo senza DNA :il bianco e’ importante nella PCR come il marker 3 omozigote Y T Y T - 1, 4, 6, 7, omozigoti Y C Y C - 2, 5 eterozigoti Y C Y T

27 By NA 27 Gli STS: Sequence Target Site L’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (300pb) clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui. Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche che fisiche e permettono di legarle fra loro DNA genomico Clonaggio Sequenziamento GACTTAG CATAGCA ~300bp STS A,B,C.. scelta dei primers x A,B,C.. screening library con PCR A+,B-,C+.. A-,B+,C+.. B+,D+,G+ H+,F+,T-..F+,T-,Q+.. H F* Q A* C B* D G* mappa fisica:contiguo 1 2 A C B D G H F Q mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e’ F-A-G A C B D GH F Q I due contigui sono sullo stesso cromosoma e via cosi....

28 By NA 28 Come fare il linkage  Il calcolo del linkage e’ quindi statistico: occorre una progenie numerosa e bisogna conoscere la fase (aplotipo) dei parentali. Si ricorre al lod score  come si fa visto che le famiglie umane sono di solito piccole?

29 By NA 29 * Il linkage e’ una relazione di vicinanza fra due loci ed e’ funzione della loro distanza. La definizione di un linkage fra due loci si basa su calcoli statistici che permettono di quantizzare la probabilta’ che i risultati ottenuti non siano dovuti al caso. Nel caso dell’uomo l’analisi della progenie di una singola famiglia raramente fornisce informazioni sia per lo scarso numero di meiosi sia per la difficolta’ di risalire alla fase. Bisogna mettere insieme i dati provenienti da piu’ famiglie. Linkage-lod score Odds ratio= P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti Lod score: logaritmo in base 10 dei singoli rapporti di ogni famiglia, si possono cosi sommare. Un valore di 3 indica linkage. ( 1-    n  r (1/2) n+r


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