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CeRMiV Absolute quantification of human brain metabolites using QUEST E. Malucelli 1, D.N. Manners 1, C. Testa 1, C. Tonon 1, R. Lodi 1, B. Barbiroli 1,

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1 CeRMiV Absolute quantification of human brain metabolites using QUEST E. Malucelli 1, D.N. Manners 1, C. Testa 1, C. Tonon 1, R. Lodi 1, B. Barbiroli 1, S. Iotti 1 B. Barbiroli 1, S. Iotti 1 1 Dipartimento di Medicina Interna dell’Invecchiamento e delle Malattie Nefrologiche, University of Bologna, Bologna, Italy, Alma Mater Studiorum - University of Bologna Centro di ricerca e diagnostica molecolare in vivo

2 Magnetic Resonance Imaging (MRI) MRI Struttutale Diffusion Tensor Imaging (DTI) Trattografia Functional MRI (fMRI)

3 Introduzione Perchè usare la MRI? Che cos’è la MRI? Come si ricostruisce un’immagine? Cosa rende un’imamgine interessante?

4 Introduzione Perchè usare la MRI? Che cos’è la MRI? Come si ricostruisce un’immagine? Cosa rende un’imamgine interessante?

5 What is MRI used for? Il segnale MRI deriva per la maggiro parte dai protoni dell’acqua Il corpo umano è largamente formato da acqua, specialmente i tessuti molli Il cervello umano è composto per il 78% di acqua Perchè usare la MRI?

6 Non invasiva Nessuna radiazione ionizzante Rilevamento di tessuti molli Alto contrasto e applicabilità Alta risoluzione spaziale CT MRI Perchè usare la MRI?

7 MRI: Applicazioni cliniche A scopi clinici la MRI si utilizza per: –Rilevare tumori e altre anormalità –Rilevare regioni con ictus –Rilevare emorragie celebrali –Pianificare e guidare interventi E molto più……

8 MRI: Apllicazioni scientifiche MRI è utilizzata sia per scopi clinici sia per ricerca –Studi funzionali cerebrali (functional MRI) –Studi strutturali e morfologici cerebrali

9 Perchè usare la MRI? Che cos’è la MRI? Magnetic: origine del segnale Resonance: eccitazione - rilevamento Imaging: convertire il segnale in immagine Come si ricostruisce un’immagine? Cosa rende un’imamgine interessante? MRI: dai protoni all’imamgine

10 Perchè usare la MRI? Che cos’è la MRI? Magnetic: origine del segnale Resonance: eccitazione - rilevamento Imaging: convertire il segnale in immagine Come si ricostruisce un’immagine? Cosa rende un’imamgine interessante? MRI: dai protoni all’imamgine

11 Perchè usare la MRI? Che cos’è la MRI? Magnetic: origine del segnale Resonance: eccitazione - rilevamento Imaging: convertire il segnale in immagine Come si ricostruisce un’immagine? Cosa rende un’imamgine interessante? Il contrasto MRI: dai protoni all’imamgine

12 subject super conducting magnet x gradient coil z gradient coil r.f. transmit/receive gradient coils

13 Boss fMRI13 Gli spin sono polarizzati dal campo magnetico costante, B 0 Magnetizzazione – M||B 0 B0B0 M Magnete a superconduzione Orientazione casuale MRI: dai protoni all’imamgine

14 Coordinate del sistema La direzione del campo magnetico principale (B 0 ) determina le coordinate del sistema Asse longitudinale: parallelo a B 0 (asse z) Piano trasversale: perpendicolara a B 0 (piano x,y) Dopo lo stimoli gli atomi tendono a ritornare alla posizione di equilibrio di M parallelo a B 0 B0B0 x y z M

15 Boss fMRI15 Solo la magnetizzazione trasversale riesce ha essere rilevata e a dare segnale RF 90° Pulse-sequence diagram

16 Tempi di rilassamento: T1 e T2 M xy time MzMz Decadimento del segnale nel piano trasversale in accordo con il T 2 Recupero della magnetizzazione lungo l`asse longitudinale in accordo con il T 1 Impulso RF T 1 >T 2 e -t/T2 1-e -t/T1

17 Tempo di eco (TE) e contrasto T2 TE Ampiezza del segnale Tessuto1 (T 2 lungo) Tessuto 2 (T 2 corto ) Dopo l`eccitazione, il signale decade exponenzialmente in accordo con il T 2.

18 TE Segnale Alto signale TE corto Basso contrasto Echo Time (TE) e contrasto T2

19 TE Segnale Medio contrast Basso signal TE lungo Echo Time (TE) e contrasto T2

20 TE Signal Alto contrasto Signale medio Medio TE Echo Time (TE) e contrasto T2

21 La magnetizzazione si riallinea con il campo principale in un tempo T 1 Il T 1 è diverso per ogni tessuto Ma... non si ha signale lungo M z (solo sul piano M xy ) M z (% of max) Tempo dall`impulso RF (ms) Repetition Time (TR) e contrasto T1 Contrast

22 Short TR Short TE Long TE Long TR T1 T2 PD

23 Ogni immagine possiede una rappresetazione nel corrispondente K spazio Spazio delel frequenze K Spazio Spazio immagine FT

24 K spazio acquisito Trasformata di Fourier

25 T1-Weighted Images Le sequenze per acquisire immagine pesate in T1 sono create e ottimizzate per creare immagini con contrasto tra sostanza grigia, bianca e liquor Tre fette assiali: Risoluzione spaziale di 1 mm3 Tempo d`acquisizione per l`intero cervello 10 minuti

26 Zoom In La sostanza grigia è ben definita –Si può misurare lo spessore della corteccia e provare a correlare il dato con l`età e/o malattia o altri parametri Puntini e linee bianche: artefatti da flusso arterioso E` possibile acquisire a una maggiore risoluzione spaziele –Con un lo svantaggio di aumentare il tempo di acquisizione -26-

27 -27- Tre fette di uno stesso volume Una singola acquisizione genera immagini rumorose L`immagine precedentemente mostrata era la media di 4 acquisizioni (per aumentare SNR) La MRI può essere 2D o 3D

28 Un`immagine di cattiva qualità Il soggetto ha mosso la testa durante l`acquisizione –Artefatti di Ghosting and ringing –Potrebbe essere utile solo per alcuni scopi clinici, ma non a scopi quantitativi di ricerca -28-

29 Le regioni celebrali mostrano diversi patterns di variazione volumetrica durante il corso della vita Questi effetti sono da attribuire principalmente alla diminuzione di densit’ sinaptica e poi alla morte cellulare Variazioni strutturali

30 Diffusione dell`acqua Einstein 1905, 5 articoli sul moto Brownian La diffusione è un movimento casuale (moto Browniano) dovuta all`energia termica La diffusione è strettamente legata all`ambiente in cui si trovano le molecole d`acqua

31 Nei tessuti la diffusività dell`acqua è condizionata dalla composizione dall`ambiente cellulare Se le membrane delle cellule sono disposte con direzionalità coerente la diffusione sarà anisotropica Diffusione dell`acqua

32 Isotropia Anisotropia Fibre sostanza bianca MRI: Diffusione dell`acqua

33 L`anisotropia può essere utilizzata per seguire i fasci di sostanza bianca Acqua Elissoide di diffusione Fibre sostanza bianca MRI: Diffusione dell`acqua

34 Tensore di diffusione Autovalore maggiore Autovettore maggiore:

35 Biomarkers micro-strutturali Mean diffusivity (MD=media{λi=1,3}) ≈ magnitudine diffusione Fractional anisotropy (FA=var{λi=1,3}/magn{D}) ≈ direzionalità FA = 0 diffusione isotropica (CSF) FA = 1 diffusione ad alta anisotropia (sostanza bianca) MD FA La sostanza bianca ha bassa MD ed alta FA La sostanza bianca compromezza strutturalmente ha alta MD e bassa FA

36 -36- Mappe DTI Imamgine non pesata in diffusione Fractional Anisotropy FA colorata perla direzionalità delle fibre: x = Rosso y = Verde z = Blue

37 Mappa a colori dei principali fasci FA: Fractional Anisotropy; : Mean Diffusivity

38 Field of Diffusion Tensor Ellipsoids Mappa a colori Zoom sul corpo calloso che presenta un andamento delle fibre lungo l`asse X

39 Fiber tracking

40 Trattografia

41 Trattografia: Corpo Calloso

42 Trattografia: Fascio Corticospinale

43 -43- Diffusione nell`Ictus La MD diminuisce nel tessuto cerebrale colpito da ictus dopo pochi minuti dal blocco del vaso sanguigno –Il rigonfiamento che inizialmente subiscono le cellule causa una riduzione di spazio extra- cellulare, il quale possiede un alta MD rispetto all`ambiente intra-cellulare I danni causati dall`ictus non sono visibili dalla convenzionali immagini pesate in T1 o in T2 prima di 2-3 giorni dal blocco del vaso Le immagini di diffusione oggi sono comunemente utilizzate per valutare le regioni che hanno subito danni da ictus

44 -44- Diffusione nell`Ictus Acquisizione dopo 4 ore dall`esordio

45 FMRI è una tecnica utilizzata per misurare la variazione di ossigeno durante l`attività neuronale Functional MRI (fMRI) Riposo Attività L`incremento dell`attività neuronale comporta un aumento del segnale MR

46 Paradigma riposo task s ……. 8 blocchi di ripetizioni del task per 20 s In ogni blocco vengono acquisite 10 immagini

47 Andamento del segnale temporale al massimo dell’attivazione durante il task (in rosso il regressore ). Segnale fMRI

48 Fittinf del segnale temporale al massimo dell’attivazione durante il task (blu) e il segnale (rosso). Segnale fMRI

49 fMRI finger tapping

50

51 Paradigma riposo task s ……. 8 blocchi di ripetizioni del task per 20 s In ogni blocco vengono acquisite 10 immagini

52 fMRI scacchiera tremolante

53 Fornisce informazioni anatomiche basate sulla localizzazione spaziale del segnale dell’acqua 1 H Fornisce informazioni biochimiche basate sulla quantificazione di metaboliti intracellulari 1 H 13 C 31 P 23 Na 19 F MRS MRI

54 Significa calcolare la concentrazione molare dei metaboliti: Esterno: una soluzione a concentrazione nota. Il segnale generato confrontato con quello dei metaboliti Interno: Preso come riferimento un metabolita a concentrazione nota (ATP, H2O). Quantificazione assoluta

55 dominio del tempo E’ più facile per l'occhio umano valutare lo spettro nel dominio delle frequenze perché i segnali dei metaboliti sono risolti e rappresentati in “picchi” Il segnale nel dominio delle freqeunze dominio delle frequenze NAA Cr Cho mI Trasf. Fourier

56 Il segnale NMR Dipende dal rapporto giromagnetico , dall’abbondanza naturale del nucleo e dal campo magnetico:    N B 0 Il rapporto segnale/rumore (SNR) Il rivelatore registra non solo il segnale ma anche il rumore durante l’esperimento per questo si definisce il rapporto SNR per valutare uno spettro.

57 Signal Noise Ratio (SNR) Dipende da: Il nucleo che si guarda (g) L’abbondanza naturale Il volume che contribuisce al segnale (Vc) La concentrazione del nucleo all’interno del volume Il campo magnetico (B0) La bobina (B1) Il numero di acquisizioni o medie (n) La sequenza di impulsi

58 S = Area picco massimo Calcolo SNR SNR= Signal/Noise dev. std. (noise) Si utilizza la deviazione standard perché il valor medio del rumore calcolato su un gran numero di campioni è 0

59 Perché acquisire più medie Spettro del muscolo: 32 medie

60 Spettro del muscolo: 8 medie 32 medie 8 medie

61 L’SNR migliora perché diminuisce il rumore ma diminuisce anche S (in misura inferiore) Apodizzazione Manipolazioni dei dati nel dominio del tempo, senza alterare le frequenze, per migliorare SNR.. La gaussiana,va a zero più velocemente rispetto alla lorentziana Filtro Gaussiano Filtro Lorentziano

62 31 P MRS muscolo scheletrico So LG MG coil ATP  PCr Pi PME PDE Aumento SNR tramite somma spettri e apodizzazione

63 PCr Pi ATP   ppm Quantificazione assoluta [PCr], [Pi] ATP standard interno; [ATP] = 8.0 mM e calcolare: pH[Mg 2+ ], pH, [Mg 2+ ], [ADP] pH  Pi Mg 2 +  ATP 

64 Preprocessing Somma Fase Somma

65 Elaborazione spettri ATP    PCr Pi PDE Calcolo dell`area sottesa ad ogni picco dello spettro AMARES è un algoritmo operatore dipendente

66 Risultati elaborazione spettri [PCr] = Ampl(PCr) / Ampl(  -ATP) * 8 mM [ Pi ] = Ampl(Pi) / Ampl(  -ATP) * 8 mM  Pi=Freq(Pi) – Freq(PCr) Pi PCr  -ATP

67 Valutazione elaborazione spettri Valutazione elaborzione: Qualitativamente: l’ampiezza dei residui dei segnali Quantitativamente: 1SNR (dato da PCr/noise) 2CRB: 2* SD/Ampiezza S

68 CRB: 2*SD/Ampiezza SCRB(Pi)  0.079=7.9% Cramer-Rao Bound

69 31 P MRS a diverse condizioni metaboliche serve a valutare: funzionalità respiratoria mitocondriale individuale

70 Esercizio Flessioni plantari isocinetiche di intensità crescente

71

72 ATP + H 2 O ADP + Pi ATPasi miosinica PCr + ADP +H + Cr + ATP Creatina chinasi

73

74 PCr Pi Row AT P    pH rest = 7.06 pH end-ex = 6.65 ATP  Pi )68.5( )9.3( log77.6 Pi pH     

75 1 H MRS Multi-voxel Single-voxel NAA Cr Cho mI

76 Gz RF z z Gx x Gy y z x Segnale Single voxel 1H-MRS

77 ppm Glx Cr Cho s-I Lac Lip NAA, N-acetil aspartato: NAA, N-acetil aspartato: marker neuronale Glx, glutammato+glutammina: neurotrasmettitori Glx, glutammato+glutammina: neurotrasmettitori Cr, creatina+fosfocreatina: marker metabolismo energetico Cr, creatina+fosfocreatina: marker metabolismo energetico Cho, composti colinici: marker gliale Cho, composti colinici: marker gliale mI, mio-inositolo: marker della osmoregolazione mI, mio-inositolo: marker della osmoregolazione sI, scillo-inositolo: marker della funzionalità di membrana sI, scillo-inositolo: marker della funzionalità di membrana Lac, lattato: marker metabolismo glucidico Lac, lattato: marker metabolismo glucidico Lip, lipidi: marker del metabolismo lipidico Lip, lipidi: marker del metabolismo lipidico NAA m-I

78 NAA Cho Cr - OOC - CH- CH 2 - COO - - OOC - CH- CH 2 - COO -NHCO CH 3 H 2 N C N CH 2 COO - CH 3 NH HO CH 2 CH 2 N(CH 3 ) 3

79 H 2 N C N CH 2 COO - CH 3 NH Cr

80 HO CH 2 CH 2 N(CH 3 ) 3

81 H 2 O  55M Metaboliti pochi mM NAA Segnale dell’acqua in 1 H-MRS

82 Soppressione dell’acqua Segnale dell’acqua non soppersso Segnale dell’acqua soppresso

83 Conc [met] Conc [water] S [metab] /S [water] Quantificazione assoluta I  Utilizziamo come riferimento interno il picco dell`acqua Abbondante concentrazione  55 M Ottimo SNR

84 S 0 (met): segnale dei metaboliti estrapolato al tempo 0 S 0 (H 2 O): segnale dell’acqua estrapolato al tempo 0 numAcq(H 2 O): numero di acquisizioni dello spettro dell’acqua numAcq(met): numero di acquisizioni dello spettro dei metaboliti numH(H 2 O): numero protoni che contribuiscono al segnale dell’acqua (2) numH(met): numero protoni che contribuiscono al segnale del metabolita Quantificazione assoluta II

85 T2: Tempo di rilassamento trasversale S tempo più è lungo il T 2 più il segnale decade lentamente

86 Quantificazione assoluta III TE Ampiezza del segnale T2 Metaboliti T2 Acqua Decadimento acqua

87 TE 35 ms TE 70 ms Lipidi, T 2 corto Influenza TE nello spettro

88

89 NAA Cr Cho Myo Glx Passi dell’elaborazione Peak-Peaking con AMARES

90 Risultato Amares A bassi TE non è possibile valutare il segnale delle macromolecole che comporterà un errore nella valutazione dei metaboliti Macromolecole

91 LCModel

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