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Metodi di Indagine Strutturale di Biomolecole Prof. Mario Piccioli Centro Risonanze Magnetiche (stanza 41) Polo Scientifico Via L. Sacconi 6, Tel: 055-4574265.

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1 Metodi di Indagine Strutturale di Biomolecole Prof. Mario Piccioli Centro Risonanze Magnetiche (stanza 41) Polo Scientifico Via L. Sacconi 6, Tel:

2 Outline Spettroscopia NMR Cristallografia Raggi X Spettrometria di Massa …..che cosa sono? …..perché dovrei sapere qualcosa di queste tecniche? …in che occasione potrebbero servirmi? ….dove potrei andare per utilizzarle? …

3 Perché conoscere i metodi strutturali?

4 The model

5 Nobel laureates 1962 Wilkins, Perutz, Crick, Steinbeck, Watson, Kendrew

6 Perutz (Haemoglobin), Kendrew (Myoglobin)

7 ....acccaa gaagtcagaa tcctcgaagc tgaagcctga ctgtaagctc tgcctcctac aactagacaa gtcacaatgc aacccctttg ctccagagga aaaggagtaa gcacagaggg cttctgagtc cggcaatgct ccatttcctg acaggagcat tttacagact tgcgtctgcc cctctgaggg... From: Prof. Anna Tramontano From genome to structure. From structure to function

8 Biomolecular Structures

9 New folds per year

10 NMR vs XRay

11 Molecule type Protein Protein-DNA complexes DNA RNA

12 Structural Tools Strumenti per la Biologia strutturale

13 SPETTROSCOPIA di RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE Che si puo’ fare con NMR? -Strutture di proteine di peso molecolare fino a Interazioni proteina-proteina oppure proteina-legante, oppure enzima-substrato -Dinamica di proteine -Relazione struttura-funzione -Fenomeni cinetici. Reazioni. Scambio chimico -Protein folding -Reattività

14 Di che cosa abbiamo bisogno? Un Nucleo NMR-attivo Un campo magnetico statico B 0 Un trasmettitore di radiofrequenza PRINCIPI DI BASE

15 Ripasso. Struttura dell’atomo Gli atomi sono costituiti da un nucleo positivo e da elettroni negativi. Il nucleo ha un raggio di Å. Il raggio di un atomo è dell'ordine di 1 Å.

16 Ripasso.Nuclidi Un nuclide è un atomo caratterizzato dal numero atomico Z (numero di protoni) e dal numero di massa A (numero di neutroni e di protoni). Il nuclide neutro ha un numero di elettroni uguale a quello di protoni. Il numero Z caratterizza la specie atomica. X A Z C 12 6 H 1 1 O 16 8

17 Isotopi C 12 6 C 14 6 Nuclidi con lo stesso Z ma differente A possono esistere e si chiamano isotopi. Una stessa specie atomica ha, di norma, diversi isotopi: si parla di miscela isotopica naturale. C 13 6

18 Isotopi naturali di alcuni elementi NuclideMassa relativa% di nuclidi 1H1H 1, ,985 2H2H 2, ,015 3 He 3, ~ He 4, ~ Li 6, ,42 7 Li 7, ,58 9 Be 9, ~ Be 10, tracce 10 B 10, ,6 11 B 11, ,4 11 C 11, tracce 12 C 12, 98,89 13 C 13, ,11 14 C 14, tracce

19 Proprietà magnetiche delle particelle subatomiche Ogni protone ed ogni neutrone possiede un numero quantico di spin I= +-1/2, in analogia alla situazione che voi già conoscete per gli elettroni. Tutti gli isotopi con un numero dispari di PROTONI O DI NEUTRONI nucleoni hanno un numero quantico di spin I≠0. Ad ogni nucleo sarà associato un numero quantico di spin nucleare che è la somma di tutti i numeri di spin dei nucleoni. Analogamente agli elettroni, i nucleoni tendono ad “appaiare” lo spin. Per i nucleoni piu’ pesanti, la regola di “massimo appaiamento” non è sempre verificata, per cui alcuni isotopi hanno numero quantico di spin >1/2. Alcuni nucleoni con numero di massa pari possiede I=1,2,3.. Mentre alcuni isotopi con numero di nucleoni dispari possiede I=3/2, 5/2, 7/2..

20 Nuclei NMR-attivi Tutti i nuclidi con un numero quantico di spin nucleare I diverso da zero sono NMR attivi, Ovvero possono essere studiati via NMR Per i piu’ comuni studi NMR vengono utilizati solo quei nuclidi con spin nucleare I=1/2

21 Spin nucelare e nuclidi ProtoniNeutroniI paripari0 disparidispari1,2,3 paridispari½,3/2, 5/2, 7/2 disparipari½,3/2, 5/2, 7/2

22 NMR e tabella periodica Su questa base, quasi tutti gli elementi avranno almeno 1 isotopo NMR attivo C 12 6 C 14 6 C ,9 %1,11 %tracce

23 Esercizio

24 NMR-active nuclei with different spin numbers I=0 I=1/2, 3/2, 5/2 I=1,2,3

25 NMR-active nuclei with different spin numbers 1 1 H, 2 1 H, 4 2 He, 12 6 C, 13 6 C, 14 7 N, 15 7 N, 16 8 O, 17 8 O, 19 9 F, Na, Al P, Cl, Fe

26 NMR-active nuclei with different spin numbers I=0 I=1/2, 3/2, 5/2 I=1,2,3 4 2 He, 12 6 C, 16 8 O, Fe 1 1 H, 13 6 C, 15 7 N, 17 8 O, 19 9 F, Na, Al P, Cl, 2 1 H, 14 7 N,

27 NMR-active nuclei with different spin numbers I=1/2 1 1 H, 13 6 C, P, 19 9 F, 15 7 N I=3/ Na Cl I=5/ O Al

28 Di che cosa abbiamo bisogno? Un Nucleo NMR-attivo Un campo magnetico statico B 0 Un trasmettitore di radiofrequenza PRINCIPI DI BASE

29 Momento Magnetico =I=I Ad un numero quantico di spin I è sempre associato un momento magnetico di spin  Un momento magnetico può essere considerato come una piccola calamita. Come tale, se immersa in un campo magnetico, essa puo’ orientarsi in modo parallelo o antiparallelo al campo magnetico applicato esterno.   B0B0

30 Momento Magnetico =I=I Ad un numero quantico di spin I è sempre associato un momento magnetico di spin  Il rapporto giromagnetico  è una costante di proporzionalità tra il numero quantico di spin ed il momento magnetico. In pratica, due nuclidi con stesso valore di I (es: 1 1 H e 13 6 C) hanno un diverso momento magnetico perché ogni nuclide ha un proprio valore di .   B0B0

31 Momento Magnetico I= spin quantum numberm= Magnetic quantum number (-I…+I) Più esattamente, ad ogni numero quantico di spin I è associato un numero quantico magnetico m, che puo’ assumere valori da +I a –I I= ½ I= 1 m= - ½, + ½, m= -1, 0,+1 m=+1/2 B0B0 m=-1/2 m=+1 B0B0 m=-1 m=0

32 L’energia della transizione NMR B0B0 E m=+1/2 m=-1/2 I due livelli energetici sono degeneri se B 0 =0 Il campo magnetico B 0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli

33 L’energia della transizione NMR B0B0 E m=+1/2 m=-1/2 I due livelli energetici sono degeneri se B 0 =0 Il campo magnetico B 0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli

34 Magnetizzazione osservabile B0B0

35 B0B0

36 B0B0

37 B0B0

38 Momento Magnetico Il momento magnetico non è un oggetto statico, ma puo’ essere descritto come una trottola, che possiede una certa velocità angolare, tipica di ogni spin

39 Momento Magnetico L’energia di ogni spin è data, in termini fisici, dal prodotto scalare tra il campo magnetico applicato B 0 ed il momento magnetico della particella  E=-  B 0

40 Momento Magnetico Questo prodotto scalare dipende dall’orientazione del momento magnetico rispetto a B0. Per effetto delle regole di quantizzazione dell’energia, esso dipende dal numero quantico di spin nucleare m, che puo’ essere +1/2 oppure -1/2 E=-mħ  B

41 Momento Magnetico Questo prodotto scalare dipende dall’orientazione del momento magnetico rispetto a B0. Per effetto delle regole di quantizzazione dell’energia, esso dipende dal numero quantico di spin nucleare m, che puo’ essere +1/2 oppure -1/2 E=-mħ  B

42 Momento Magnetico m=+1/2 m=-1/2 E=+1/2ħ  B E=-1/2ħ  B

43 Momento Magnetico m=+1/2 m=-1/2 E=+1/2ħ  B E=-1/2ħ  B Stato fondamentale Più popolato Stato eccitato Meno popolato

44 B0B0 E =  B 0 E =   mB 0  :m = +½    +½   E   ½   B 0  :m =  ½    ½   E   ½   B 0 Ogni momento magnetico precede intorno al campo magnetico statico B 0 Spin equivalenti precedono tutti con la stessa velocità  0 anche se ciascuno con una fase diversa equivalenti significa nuclidi di atomi identici CH3CH2OHCH3CH2OH La frequenza di precessione di Larmor

45 B0B0 M0M0 E =  B 0 E =   mB 0  :m = +½    +½   E   ½   B 0  :m =  ½    ½   E   ½   B 0 M 0 =  = M z M x = M y = 0 La frequenza di precessione di Larmor Poiche il numero dei momenti magnetici allineati con il campo magnetico é leggermente maggiore di quelli anti allineati la risultante é un vettore magnetizzazione M allineato lungo l’asse z La differenza tra le due popolazioni é tanto maggiore quanto piu’ elevata e la differenza di energia tra i due livelli

46 B0B0 E =  B 0 E =   mB 0  :m = +½    +½   E   ½   B 0  :m =  ½    ½   E   ½   B 0  E =   B 0 =     h  La differenza di energia,(E  -E  ), dipende dal tipo di nucleo (ogni nuclide a un diverso valore di g) e dal campo magnetico applicato La differenza di energia é anche legata alla frequenza di precessione, ovvero alla velocità angolare con cui tutti I nuclidi equivalenti ruotano intorno a B0 La frequenza di precessione di Larmor

47 Il rapporto giromagnetico  E=  (h/2  )B 0  z =  I z =  (h/2  )m z Non tutti gli isotopi con I=1/2 hanno le stesse proprietà magnetiche Il momento magnetico è diverso per ogni isotopo e dipende dalla costante  Tanto maggiore è , tanto piu’ alta sarà la differenza di energia tra i 2 livelli della transizione NMR. Ovvero tanto maggiore sarà la sensibilità dell’esperimento

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49 Magnetizzazione osservabile Mo

50 La risonanza magnetica nucleare A parità di campo magnetico, la differenza di energia varia al variare del nuclide, pertanto nuclei come 1 H e 13 C hanno diverse energie di transizione e, di consequenza, diverse FREQUENZE DI RISONANZA La frequenza di risonanza di ciascun nuclide é chiamata Frequenza di Larmor

51 La risonanza magnetica nucleare Per poter fare un esperimento NMR si dovrà irradiare il campione da studiare con una radiazione elettromagnetica di energia corrispondente alla FREQUENZA DI RISONANZA Questo farà si che i nuclidi siano eccitati L’effetto della eccitazione ed I fenomeni che seguono negli istanti successivi, danno luogo ad una emissione di frequenze da parte del campione in esame

52 L’energia della transizione NMR B0B0 E m=+1/2 m=-1/2  E=h 0 Larmor Frequency I due livelli energetici sono degeneri se B 0 =0  E=  (h/2  )B 0 E= - B 0 Il campo magnetico B 0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli

53 Il campo magnetico B 0 serve a generare la differenza di popolazione tra i 2 livelli di spin nucleare. La consequenza di questa differenza di energia é l’esistenza di una magnetizzazione risultante che, in condizioni di equilibrio, é orientata lungo la direzione del campo magnetico B 0 Tanto piu’ il campo magnetico B0 è intenso, tanto piu’ è intensa la magnetizzazione risultante, tanto maggiore è la sensibilità dell’eseprimento NMR. Riassumendo A che serve il campo magnetico B 0 ?

54 Il campo magnetico Magnete a 400 MHz Magnete a 900 MHz Costo commerciale di uno spettrometro as 900 MHz: ca. 5 M€ n. Di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10

55 The Magnet A “cutted” magnet History First magnets were built using ferromagnetic material= permanent magnet Then Electromagnets: i.e. field was generated by wiring of conducting material Now: cyomagnets: i.e. electromagnets made of superconducting wire.

56 IMPORTANTE Cosa è, per esempio, uno spettrometro a 500 MHz? E’ uno strumento che, per creare la differenza di energia tra i due livelli di spin nucleare, utilizza un campo magnetico B 0 tale per cui la differenza di energia, calcolata per lo spin 1 H, tra il livello fondamentale e quello eccitato  E=h è pari a 500X10 6 Hz

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58 Esercizio Calcolare la frequenza di un segnale NMR

59 Esercizio  E=  (h/2  )B 0 If B 0 is 11,75 T the investigated nucleus is 1 H 2,675*10 8 *11,75=34,43*10 8 s -1 rad  =2,675 x10 8 rad s -1 T -1  E=h 0 0 (2  ) =  B 0 34,43*10 8 s -1 rad /2  =500,28*10 6 s -1 =500 MHz

60 Di che cosa abbiamo bisogno? Un Nucleo NMR-attivo Un campo magnetico statico B 0 Un trasmettitore di radiofrequenza PRINCIPI DI BASE

61 Prodotto vettoriale

62 Esperimento NMR Per descrivere gli esperimenti NMR, il metodo piu’ comune è quello di vedere l’insieme degli spin descritto fino ad adesso come la magnetizzazione somma, ovvero come un singolo vettore magnetizzazione (ogni atomo chimicamente diverso avrà il suo proprio vettore). Se immerso in un campo magnetico B0, il vettore è allineato lungo l’asse z. x y z B0B0

63 Esperimento NMR Per perturbare il sistema si irradia il campione con una radiofrequenza la cui frequenza è esattamente corrispondente alla frequenza di Larmor. Per descrivere l’esperimento in modo piu’ semplice, si utilizza, al posto del sistema di riferimento di laboratorio, un sistema di riferimento ruotante (rotating frame) la cui frequenza è proprio quello della frequenza di Larmor. Il vantaggio è che, in tale sistema di riferimento la frequenza di irradiazione puo’ essere vista come un campo magnetic statico (diverso dal campo magnetico stazionario B 0 ) che chiameremo B 1. x y z B0B0

64 x y time +0+0 –0–0 M x y z B0B0 LAB. 2  0 (neglected) x’ y’ M z’ = z 00 ROTATING

65 Sistema ruotante A pulse!

66 Sistema di laboratorio jam Fly A (Laboratory Frame) Fly B The movement of Fly B as seen by Fly A Sistema ruotante Fly B jam The movement of Fly B as seen by Fly A Fly A (Rotating frame)

67 Esperimento NMR Nel sistema ruotante il vettore magnetizzazione del campione, orientato lungo l’asse z, viene perturbato da una campo magnetico B1 che, nel rotating farme, risulta nel piano x y allineato lungo un asse. L’effetto di questa radiazione B1 è quella di ruotare il vettore magnetizazione, sulla base del prodotto vettoriale. x y z B0B0 x y z B0B0 B1B1 d  /dt=  (t)^B 1 (t) Prodotto vettoriale

68 Esperimento NMR L’effetto è che, quando si applica B1, la magnetizzazione ruota secondo le regole del prodotto vettoriale (regola della mano destra) allontanandosi da z e ruotando verso l’asse -y (se il vettore B1 è applicato lungo x). x y z B0B0 x y z B0B0 B1B1 d  /dt=  (t)^B 1 (t) Prodotto vettoriale

69 Esperimento NMR Lo stato del sistema all’equilibrio Ovvero: campione nel campo magnetico, prima di fare l’esperimento Consideriamo solo un singolo spin. Per esempio un campione contenente solo H 2 O

70 Esperimento NMR L’effetto di un IMPULSO è di portare il sistema fuori dall’equilibrio La magnetizzazione di H 2 O è ruotata. Tanto piu’ lungo è l’impulso applicato tanto maggiore sarà la rotazione

71 Importante Il segnale osservato nell’esperimento NMR è il segnale che si trova sul piano xy

72 Esperimento NMR IMPULSO a 90° IMPULSO a 180°

73 The NMR Experiment After the pulse is switched off, the magnetization precesses in the xy plane and relaxes to equilibrium The current induced in a coil by the magnetization precessing in the xy plane is recorded. It is called FID. zy xzy xzy x M B1B1B1B1 90°t IIII I t To have a spin transition, a magnetic field B 1, oscillating in the range of radiofrequencies and perpendicular to z, is applied (perturbing pulse) The B 1 field creates coherence among the spins (they all have the same phase) and net magnetization in the x,y plane is created

74 Segnale ricevuto Se la radiofrequenza applicata è esattamente la frequenza di Larmor, si osserva nel tempo un segnale che tende a decadere (vedi dopo). Questo segnale è confrontato con la frequenza del rotating frame e la frequenza di risonanza del segnale è proprio quella del rotanting frame Il fatto che il segnale deacde dipende da un meccanismo, chiamato rilassamento, che saraà discusso in seguito My=exp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation Frequency ( ) =0

75 Segnale ricevuto Se invece la magnetizzazione che studiamo ha una frequenza di risonanza diversa da quella dell’impulso di eccitazione, si osserverà un segnale alla frequenza obs=( 1- 0) My=cos( obs )texp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation Frequency ( ) My=cos( obs )texp(t/T2) =0 = obs

76 Sensibilità dell’Esperimento NMR S/N  N  5/2 B 0 3/2 N = Numero di spins che contribuiscono al segnale  rapporto giromagnetico del nuclide studiato  Camp magnetico utlizizzato

77 Alcuni dati da ricordare Tutti i nuclidi con I diverso da =0 possono essere studiati attraverso spettroscopia NMR I piu’ importanti, per lo studio di molecole d interesse biologico sono 1 H, 13 C, 15 N, 31 P Abbondanza naturale e la frequenza di risonanza sono importanti per determinare la sensibilità di un esperimento NMR 1 H è il nucleo piu’ studiato via NMR. PERCHE’: i) la sua abbondanza isotopica è vicina al 100% ii) E’ il nucleo con la frequenza piu’ alta 13 C è il secondo nucleo piu’ studiato via NMR. PERCHE’: i) la sua abbondanza isotopica è circa 1% ii) E’ un nucleo con la frequenza relativamente alta, (1/4 rispetto ad 1 H)

78 Alcuni dati da ricordare Esperimento NMR: Il campo magnetico statico B 0 serve per generare la transizione energetica Il campo magnetico B 1 serve per emettere una radiazione che stimola la transizione. Senza la radiazione del campo B 1 il sistema è in condizioni di equilibrio e quindi non vi è nessun fenomeno spettroscopico. Solo la eccitazione del sistema permette di effettuare misure spettroscopiche

79 Alcuni dati da ricordare Il campo magnetico B 0 è espresso in Tesla. Esso è determinato dal magnete a disposizione e si mantiene costante nel tempo La energia della transizione NMR è espressa in s -1. L’ordine di grandezza è quello delle onde radio ( MHZ) Un trasmettitore di radiofrequenze genera il campo magnetico B 1 che permette la transizione NMR. Quindi il campo magnetico B1 rimane acceso solo per effettuare la transizione. Il campo magnetico B 1 genera IMPULSI.

80 Domanda Quale è la energia della transizione 13C rispetto a quella di 1H? Se in un campo magnetico la frequenza di Larmor di 1H è 500 MHz, quale sarà la frequenza di 13C? E di 15N? Se la sensibilità di un esperimento è il prodotto della Concentrazione X la energia della transizione Quale è la sensibilità relativa di uno spettro di 13C rispetto ad uno spettro 1H?

81 Segue….. Tu che sei un biotecnologo, cosa potresti fare per migliorare la Sensibilità di questo esperimento?


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