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Elettrofisiologia cellulare Proprietà delle membrane e meccanismi di trasporto.

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Presentazione sul tema: "Elettrofisiologia cellulare Proprietà delle membrane e meccanismi di trasporto."— Transcript della presentazione:

1 Elettrofisiologia cellulare Proprietà delle membrane e meccanismi di trasporto

2 Struttura e funzioni della membrana cellulare La membrana cellulare ha diverse funzioni: racchiude la cellula e la delimita definendone i confini racchiude la cellula e la delimita definendone i confini mantiene la separazione fra citosol e ambiente extracellulare mantiene la separazione fra citosol e ambiente extracellulare media e seleziona il trasporto di determinate sostanze impedendo ingresso e uscita di altre media e seleziona il trasporto di determinate sostanze impedendo ingresso e uscita di altre

3 Le membrane hanno struttura simile a doppio strato con due costituenti principali che sono: Proteine: intriseche ed estrinseche Lipidi: i più abbondanti sono i fosfolipidi che sono molecole anfipatiche con una porzione idrofilica (testa) ed una porzione idrofobica (coda). Altri lipidi abbondanti in membrana sono: glicolipidi e colesterolo

4 Struttura della membrana cellulare con fosfolipidi (in viola) e proteine intrinseche (in azzurro) ed estrinseche (in verde) Struttura di un fosfolipide

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6 La membrana cellulare è in grado di permettere il passaggio di sostanze in modo selettivo grazie a meccanismi di trasporto. Ricordiamo che il doppio strato lipidico costituisce una barriera al passaggio di tutte le molecole polari cariche, mentre permette il passaggio di piccole molecole polari prive di carica. Le sostanze idrofobiche passano invece bene il doppio strato senza causare problemi (O 2, CO 2, N 2 ).

7 Esistono meccanismi di trasporto che avvengono senza attraversamento della membrana cellulare come: Fagocitosi (materiale particolato; vedi macrofagi) Pinocitosi (molecole solubili; endocitosi costitutiva) Endocitosi (materiale inglobato in seguito ad interazione con recettori; per assunzione di ormoni, fattori di crescita) Esocitosi (verso lesterno. Secrezione di neurotrasmettitori, zimogeni pancreatici etc.)

8 fagocitosi endocitosi pinocitosi esocitosi

9 Esistono meccanismi di trasporto che prevedono attraversamento della membrana cellulare. Fra questi ricordiamo: Diffusione semplice: Diffusione semplice: regolata dalla legge di Fick J=-DA dc/dx Diffusione facilitata Diffusione facilitata (elevata specificità chimica delle proteine trasportatrici) Trasporto attivo Trasporto attivo (primario e secondario)

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11 Avviene lungo un gradiente di concentrazione e non richiede energia. È un processo che continua fino a quando esiste una differenza di concentrazione. Un altro tipo di diffusione passiva è il trasporto facilitato. Esso avviene sempre lungo un gradiente di concentrazione, ma necessita di proteine carrier a cui le sostanze trasportate si legano.

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14 La differenza principale è che, mentre la diffusione passiva continua fino a quando esiste un gradiente, il trasporto facilitato ha una saturazione che dipende dal numero di trasportatori utilizzato

15 Il trasporto attivo entra in gioco tutte le volte che le sostanze sono mosse contro un gradiente di concentrazione. Questo tipo di trasporto implica un dispendio energetico che viene fornito dal consumo di ATP. Per questo tipo di trasporto vale lequazione di Michaelis- Menten: V=V max · [S] / (K m + [S])

16 Un esempio tipico di trasporto attivo è la pompa Na-K ATPasi che sposta 3 ioni Na + verso lesterno e 2 ioni K + verso linterno contribuendo alla negatività della membrana cellulare (pompa elettrogenica). È fosforilata durante il suo ciclo di attività e quindi è indicata come ATPasi di tipo P. È inibita dallouabaina che compete per il sito del potassio. Risulta costituita da due subunità: Subunità α detta catalitica di circa 100 kDa Subunità β glicoproteica di circa 50kDa.

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19 Caratteristiche generali degli equilibri ionici

20 Na + out in Na + out in Solo gradiente chimico Gradiente chimico e gradiente elettrico +- La grandezza che tiene conto di entrambi i gradienti è il potenziale di equilibrio elettrochimico definito come:

21 μ = μ 0 + RTlnC + zFE Dove: μ 0 = potenziale elettrochimico standard C= concentrazione dello ione z= valenza dello ione F= costante di Faraday E= potenziale elettrico Il flusso netto dello ione è diretto dalla zona a potenziale chimico maggiore alla zona a potenziale chimico minore. Quindi vale: Δμ x = μ A (x) – μ B (x) XAXA XBXB

22 Quindi se: Δμ > 0 lo ione X si muove dal compartimento A a quello B Δμ < 0 lo ione X si muove dal compartimento B a quello A Δμ = 0 non cè flusso netto dello ione X. Da questo assunto si ricava la legge di Nernst valida per una qualunque specie ionica in equilibrio fra ambiente extra- ed ambiente intra-cellulare. In equilibrio vale Δμ = 0 e quindi se μ A = μ B si ha: RT ln X A / X B + zF (E A – E B ) = 0 ΔE = RT / ZF Log (X B / X A )

23 Potenziale di Nernst per Na + e K +

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25 Alla fine del 19esimo secolo si sapeva che il citoplasma cellulare è ricco di ioni K + e che il Na + è poco concentrato e che questa situazione è opposta nellambiente extracellulare. La prima assunzione fatta è stata quella di considerare la membrana permeabile al potassio, ma non al sodio e calcolare quindi il potenziale di riposo trans-membrana come un potenziale di Nernst per il potassio. In realtà la membrana è permeabile al Cl - tanto quanto al potassio e questi due ioni sono fra loro in equilibrio secondo un equilibrio di Donnan che afferma: [K + ] out · [Cl - ] out = [K + ] in · [Cl - ] in Ogni volta che due ioni possono attraversare la membrana cellulare, il prodotto delle loro concentrazioni extracellulari è uguale al prodotto delle concentrazioni intracellulari

26 Una differenza di carica elettrica fra interno ed esterno della superficie della membrana è detta potenziale elettrico. Tutte le cellule animali e vegetali sono caratterizzate da un potenziale di membrana di riposo (resting potential) che dipende dal movimento di tutti gli ioni permeabili attraverso la membrana cellulare. Il valore del potenziale di riposo è variabile fra cellula e cellula, ma approssima il potenziale di Nernst dello ione potassio. Vediamo perché. Quando una o più specie ioniche si distribuiscono sui due lati della membrana cellulare, ciascuna tenderà a spostare il valore del potenziale al valore del suo potenziale di equilibrio elettrochimico.

27 Tanto più la membrana è permeabile ad una specie ionica, tanto maggiore sarà la forza che tale specie ionica eserciterà nello spostare il valore del potenziale. In una membrana permeabile a più ioni il potenziale trans- membrana dipende da: I.Carica elettrica di ciascuno ione II.Permeabilità della membrana a ciascuno ione III.Concentrazione interna ed esterna della specie ionica

28 La formula che meglio descrive il potenziale di riposo di una membrana cellulare è lequazione di Goldman che considera non soltanto le concentrazioni ioniche delle specie in gioco, ma anche la permeabilità della membrana.

29 Poiché variazioni delle concentrazioni di cloro non modificano in maniera significativa il potenziale di membrana, il fattore cloro può essere escluso dallequazione di Goldman. Lequazione finale considera quindi soltanto le specie ioniche Na + e K +. In questo modo si ottiene un valore teorico che è molto simile al valore che può essere sperimentalmente misurato. Inoltre, essendo la permeabilità al sodio molto inferiore a quella del potassio (circa 1:100), il potenziale di riposo di un membrana cellulare è molto simile al potenziale di equilibrio elettrochimico per lo ione potassio.

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31 Il fatto che, anche se in piccola percentuale, la membrana a riposo sia permeabile anche al Na +, fa sì che il potenziale di riposo non sia esattamente il potenziale di Nernst del potassio, ma sia un po meno negativo. Questo dipende dal fatto che il Na + tende a spostare il potenziale verso il suo potenziale di equilibrio elettrochimico (potenziale di Nernst). V resting =-70 / -80mV E K =-90mV

32 The membrane potential of a cell can be measured in millivolts (mV) with the use of a microelectrode and an oscilloscope. (a) Both recording (needle) and reference (block) electrodes are outside of the cell, and no electrical potential (0 mV) is recorded. (b) The recording electrode is inside the cell, the reference electrode is outside, and an electrical potential difference of about 85 mV is recorded, with the inside of the plasma membrane negative with respect to the outside of the plasma membrane.

33 Consideriamo adesso i fatti visti. Affinché il potenziale di riposo si mantenga dobbiamo mantenere le differenze di concentrazione fra le specie ioniche considerate fra ambiente intra- e extra- cellulare. Per fare questo dobbiamo quindi mantenere i gradienti di concentrazione controbilanciando il movimento passivo degli ioni Na + verso linterno della cellula e degli ioni K + verso lesterno della cellula. Questo è fatto dalla pompa Na-K ATPasi che mantiene i gradienti ionici spostando ioni sodio e ioni potassio con dispendio di energia. In questo modo il potenziale di riposo può essere mantenuto.

34 mV E Na + +61mV 0mV -90mV -80mV EK+EK+ V resting

35 Risposte elettriche delle membrane cellulari

36 Tutte le cellule viventi, animali e vegetali sono caratterizzate da variazioni del potenziale di riposo se opportunamente stimolate. Esistono due tipi di risposta: Risposta elettrica passiva o potenziale elettrotonico Risposta elettrica passiva o potenziale elettrotonico: si produce TUTTE le volte che si fa passare corrente attraverso una membrana cellulare. Questo accade perché la membrana cellulare è caratterizzata da proprietà elettriche di cui adesso parleremo e che sono: capacità resistenza

37 Risposta attiva o potenziale dazione o spike: Risposta attiva o potenziale dazione o spike: è presente nelle cosiddette cellule eccitabili, vale a dire neuroni, cellule muscolari e cellule secretorie (ad esempio le cromaffini del surrene). Utilizza strutture particolari e cioè canali di membrana e in particolare canali del Na + e canali del K +. Questa risposta può esserci o non esserci e vedremo quali sono le condizioni. N.B. La risposta elettrotonica compare sempre, indipendentemente dallattivazione di canali

38 Potenziale elettrotonico

39 La membrana cellulare è formata da un doppio strato lipidico in cui sono inserite proteine che hanno la funzione di trasportare materiale attraverso la membrana. Il doppio strato lipidico, dal punto di vista elettrico si comporta come un condensatore, cioè ha la capacità di separare le cariche sui due lati della membrana. Le due piastre conduttrici sono rappresentate dal mezzo intracellulare e da quello extracellulare. Il dielettrico isolante è rappresentato dal doppio strato lipidico.

40 Si definisce capacità la seguente grandezza: C= ε A / d dove ε è la costante dielettrica del mezzo, A è larea della membrana e d è la distanza fra le piastre cioè lo spessore della membrana. Per le membrane cellulari si preferisce parlare di capacità specifica in modo da evitare il fattore area. Questa si definisce come C m = C /A da cui si ottiene: C m = ε / d Per le membrane cellulari dove A=25Å si ha un valore di C m =1μF/cm 2

41 Nella membrana cellulare si trovano anche proteine canale che permettono il passaggio di ioni. Queste strutture sono responsabili della seconda caratteristica della membrana cellulare, cioè della conduttanza (1/R). Questa grandezza è la seconda componente del circuito elettrico equivalente della membrana cellulare.

42 A questo punto dobbiamo includere nellequivalente elettrico della membrana il potenziale di membrana. Questo esiste sempre grazie alla ridistribuzione degli ioni determinata dai gradienti elettrici e chimici. A riposo questo potenziale è detto resting potential e si rappresenta come una batteria.

43 Sulla base di questo possiamo vedere come risponde una membrana cellulare opportunamente stimolata e perché la risposta passiva compare sempre.

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45 Il circuito equivalente deve tenere conto di tutte le conduttanze ioniche presenti e quindi di tutte le batterie dei diversi sistemi ionici e del corrispondente potenziale di inversione. Il risultato è il seguente.

46 IonTypical Internal Concentration (mM) Typical External Concentration (mM) Nernst Potential (mV) Na K+K Ca Cl INSIDE OUTSIDE

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48 Quindi una membrana con queste caratteristiche se viene stimolata in modo opportuno, come per esempio da un passaggio di corrente risponde con una variazione del potenziale in modo proporzionale al valore di resistenza e capacità. Questa variazione di potenziale prende il nome di potenziale elettrotonico. Quando la corrente è iniettata essa comincia a fluire attraverso la capacità che tende a caricarsi. La fase di crescita del potenziale è data da: V= iR (1-e –t/τ ) dove τ=RC. Quando t=RC allora V t =63%V 0.

49 RC si definisce costante tempo della membrana. Quando sono trascorse diverse costanti tempo, il potenziale approssima un asintoto e tutta la corrente fluisce attraverso la resistenza (I c =0 perché I c =dQ/dt=CdV/dt) con un valore che sarà proporzionale alla legge di Ohm V=I r R.

50 Le caratteristiche del potenziale elettrotonico sono: È sempre presente, in tutti i tipi cellulari se interviene uno stimolo sulla membrana cellulare Dipende dalle caratteristiche passive della membrana cellulare, cioè resistenza e capacità Non coinvolge attività di canali È proporzionale allintensità dello stimolo che lo genera, è cioè un segnale di tipo analogico Decade nel tempo e nello spazio con una costante di spazio che dipende dalle caratteristiche della fibra

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52 Il potenziale decade nello spazio secondo lequazione: V x =V 0 · e -x/λ dove λ è detta costante di spazio della fibra e fornisce informazioni su quanto si può propagare a distanza il potenziale. Si ha che: λ=SQR (r m / (r i + r e )) con r e praticamente trascurabile rispetto a r i e quindi: λ=SQR (r m / r i ) La propagazione di un potenziale lungo una fibra è maggiore se r m aumenta, mentre diminuisce se aumenta r i. Vedremo limportanza di questo fatto per la propagazione del potenziale dazione.

53 Neuroni e potenziale dazione

54 Prima di procedere alla descrizione del potenziale dazione facciamo unintroduzione sui neuroni. Il neurone è la cellula base del sistema nervoso: si stima che nel sistema nervoso ci siano circa 100 miliardi di neuroni!! Un tipico neurone è costituito da parti caratteristiche : Soma o corpo cellulare: Soma o corpo cellulare: contiene il nucleo allinterno del quale si trova il materiale genetico. Dendriti: Dendriti: presenti in grande numero, rappresentano linput del neurone. Si ramificano dal corpo cellulare e ricevono informazioni da altri neuroni.

55 Assone o neurite: Assone o neurite: si diparte dal soma. È unico e rappresenta loutput della cellula. Da qui si dipartono segnali elettro-chimici per altri neuroni. Talvolta (come nei motoneuroni) può essere molto lungo. I neuriti più lunghi e che necessitano di elevate velocità di connessione sono ricoperti da mielina, uno strato isolante che può portare la velocità di propagazione del segnale fino a 120 m/s. Terminale sinaptico: Terminale sinaptico: a questo livello il segnale elettrico che si è propagato lungo lassone è convertito in segnale chimico che veicola linformazione al neurone successivo.

56 Tra il terminale sinaptico di un neurone e il dendrite del neurone successivo si trova uno spazio molto ridotto che prende il nome di spazio sinaptico di cui parleremo facendo la sinapsi. Per ogni neurone ci sono dalle alle sinapsi!

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58 Una sinapsi neurone-neurone può essere: Asso-assonica Asso-somatica Asso-dendritica

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61 Passiamo ora a vedere il potenziale dazione

62 Cenni storici del potenziale dazione 1902Overton scopre che Na + è importante per la genesi di AP 1902Overton scopre che Na + è importante per la genesi di AP 1939Cole e Curtis e Hodgkin e Huxley scoprono che AP si manifesta con uninversione della polarità della membrana e non si porta semplicemente a 0mV 1939Cole e Curtis e Hodgkin e Huxley scoprono che AP si manifesta con uninversione della polarità della membrana e non si porta semplicemente a 0mV 1949 Hodgkin e Huxley scoprono che alterazioni di [Na + ] extracell influenzano lampiezza dello spike 1949 Hodgkin e Huxley scoprono che alterazioni di [Na + ] extracell influenzano lampiezza dello spike 1952Hodgkin e Huxley propongono lipotesi del sodio. 1952Hodgkin e Huxley propongono lipotesi del sodio.

63 Abbiamo detto che il potenziale dazione è un tipo di risposta elettrica che si manifesta solo nelle cellule cosiddette eccitabili: neuroni, fibrocellule e cellule secretorie. Tradizionalmente la trattazione del potenziale dazione è fatta su potenziali neuronali, anche se concettualmente i meccanismi sono simili se non identici anche negli altri tipi cellulari.

64 Condizione necessaria e sufficiente affinché un potenziale dazione possa innescarsi è che la depolarizzazione della membrana cellulare, opportunamente stimolata, raggiunga un livello di potenziale soglia (threshold)

65 Le caratteristiche più salienti del potenziale dazione sono: Una forma particolare (spike) che presenta uninversione transitoria della polarità della membrana (OVERSHOOT) Propagazione senza decremento per lintera lunghezza della fibra Ruolo attivo dei canali di membrana del Na + e del K + dipendenti dal potenziale Segnale modulato in frequenza: lintensità dello stimolo è codificata in base al numero di spikes per unità di tempo

66 Che cosa si intende per canali dipendenti dal potenziale? Abbiamo già detto che i canali ionici non sono altro che proteine trans-membrana aventi la funzione di veicolare attraverso la membrana cellulare ioni carichi. Questi canali possono essere grossolanamente suddivisi in: Canali dipendenti dal potenziale (come quelli implicati nel potenziale dazione e molti canali Ca 2+ ) Canali ligando-dipendenti: canali che sono attivati dal legame di una molecola ad un recettore (ad esempio il recettore-canale di tipo nicotinico, recettore GABA A )

67 Canali attivati meccanicamente: sono canali attivati da stimoli meccanici di distensione o stiramento (ad esempio il canale del Na + del corpuscolo del Pacini o i canali del K + delle cellule cigliate).

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70 +60 Il potenziale dazione +60

71 1. Depolarizzazione elettrotonica 2. Raggiungimento della soglia e avvio del ciclo di Hodgkin 3. Fase depolarizzante rapida ascendente e overshoot 4. Picco 5. Ripolarizzzione 6. Iperpolarizzazione 7. Resting potential

72 1. Per quanto riguarda la depolarizzazione elettrotonica, questa non è altro che una comune risposta passiva che si manifesta per le proprietà passive della membrana. Se questa depolarizzazione non è sufficiente per arrivare alla soglia, la risposta della membrana si esaurisce in un potenziale elettrotonico.

73 2.-3. Il ciclo di Hodgkin è un esempio di feed-back positivo nella fase ascendente dello spike: laumento della conduttanza al sodio determina unulteriore depolarizzazione che aumenta maggiormente la conduttanza.

74 Dipendenza della conduttanza g Na + dal potenziale di membrana

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76 4. Il raggiungimento del valore di picco dell AP è determinato da due fattori: I. Raggiungimento del potenziale di Nernst per lo ione Na + (circa +65mV). Vicino a questo valore la forza elettromotrice sullo ione diminuisce (f.e.m.=V m – E Na + ) e quindi la corrente tende a zero perché I Na + =g Na + · f.e.m. e se la corrente si azzera significa che cessa il flusso ionico e quindi il potenziale non varia più.

77 I. Inoltre, in maniera ritardata rispetto ai canali del Na +, si attivano i canali del K + di tipo ritardato- rettificante. Al valore del picco la f.e.m. sullo ione potassio è massima e vale: f.e.m. K + = V m – E K + = +65mV – (-90mV)=+155mV Lo ione potassio ha quindi un gradiente elettrico e chimico molto favorevole per uscire dalla cellula.

78 N.B. Osservare lo sfasamento tra corrente del Na + e corrente del K +

79 5. – 6. La fase di ripolarizzazione è dovuta allapertura dei canali del potassio e al flusso di ioni K + dallinterno allesterno della cellula lungo il gradiente elettrochimico.

80 Luscita di potassio dalla cellula tende a continuare fino al raggiungimento del potenziale di Nernst per lo ione K +. Questo significa che il potassio tira il potenziale di membrana a valori più negativi del valore di resting e da questo fatto dipende liperpolarizzazione postuma della fase 6. che può pesantemente condizionare leccitabilità di una cellula (caso tipico è la modulazione colinergica sulle cellule pacemaker cardiache).

81 7. Infine la pompa Na-K ATPasi entra in gioco per riportare le concentrazioni di sodio e di potassio ai loro valori corretti, anche se va detto che durante il potenziale dazione la quantità di ioni che si muove è di gran lunga inferiore al bulk che determina la concentrazione.

82 Quindi la risposta attiva evocata da uno stimolo depolarizzante comporta: Una componente rapida inward di ioni Na + Una componente ritardata e rettificante dovuta alluscita di ioni K +

83 Quindi il potenziale dazione si instaura perché i flussi di Na + e K + cambiano la carica sulla membrana cellulare e non perché cambiano le concentrazioni ioniche del citoplasma.

84 Periodo refrattario assoluto e relativo Comportamento dei canali del sodio

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88 PRA ca 1ms PRR ca 2ms

89 Propagazione del potenziale dazione Nei neuroni il potenziale dazione origina in una zona particolare detta monticolo assonico che corrisponde al punto di emergenza del neurite dal soma cellulare. In questa zona, non a caso, si trova unelevatissima percentuale di canali Na +. Il meccanismo di propagazione dellAP si avvale della capacità di invertire la polarità della membrana in zone adiacenti allAP, generando nuovi AP.

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91 Il potenziale dazione si propaga per circuiti locali. Lovershoot determina uninversione della polarità della membrana che genera flussi locali di corrente di intensità sufficiente da depolarizzare a soglia le zone limitrofe. La direzione di propagazione, benché teoricamente possa avvenire nelle due direzioni, avviene solo verso valle del neurite, perché la zona a monte si trova nello stato refrattario e quindi non è eccitabile.

92 Propagazione per circuiti locali di corrente

93 La frequenza massima raggiungibile è limitata dalla durata del periodo refrattario assoluto (circa 1ms) a circa 1000 impulsi al secondo per le grosse fibre nervose.

94 Conduzione saltatoria

95 Abbiamo visto che la propagazione di un segnale lungo una fibra è strettamente influenzato da r m (resistenza specifica di membrana) e da r in (resistenza longitudinale interna). La distanza a cui un potenziale si propaga dipende dalla costante spazio definita come: λ=SQR (r m / r in ) Esistono quindi due modi per aumentare la costante spazio: Aumentare il diametro della fibra secondo il seguente criterio r=ρ l/S e quindi diminuire r in per aumento della sezione

96 Creare un miglior isolamento elettrico della fibra aumentando r m e quindi diminuire le correnti di fuga La prima situazione è quella che si verifica per esempio nellassone gigante di calamaro che ha un diametro di circa 1mm. Il secondo caso è quello delle fibre mieliniche. Questo è un avvolgimento di materiale lipidico, e quindi da un punto di vista elettrico isolante, che forma 100 o più strati sul neurite, con interruzioni ogni 1-2mm note con il nome di nodi di Ranvier.

97 Lavvolgimento è determinato da oligodendrociti nel SNC e dalle cellule di Schwann nel SNP.

98 Lavvolgimento di questi strati fa sì che la resistenza equivalente sia R totale =r m 1 + r m 2 + r m 3 +…..+ r m n e quindi risulti molto aumentata facendo aumentare λ. Dal punto di vista capacitivo la capacità totale diminuisce perché si ha, per capacità in serie, 1/C m =Σ i 1/C i. Essendo C=Q/V vale che la membrana si carica meglio per una diminuzione della capacità. Il potenziale dazione si propaga da un nodo di Ranvier allaltro per conduzione saltatoria.

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100 I circuiti locali si chiudono da un nodo allaltro, dove la corrente può fluire tra interno ed esterno e dove la concentrazione dei canali del sodio è molto elevata. La membrana internodale non è in grado di generare potenziali dazione. Il potenziale salta quindi per punti discreti aumentando moltissimo la velocità di conduzione delle fibre che può arrivare a 120m/s

101 La trasmissione sinaptica

102 Lencefalo umano contiene circa 100 miliardi di neuroni, ciascuno capace di influenzare molte altre cellule. Pertanto è necessario un meccanismo dotato di grande efficienza per rendere possibile la comunicazione fra questo numero enorme di elementi. Questa comunicazione è resa possibile dalle sinapsi, i contatti funzionali fra i neuroni. La prima distinzione fondamentale è fra Sinapsi elettriche: flusso passivo di corrente elettrica fra un neurone e laltro Sinapsi chimiche: comunicazione possibile grazie alla secrezione di neurotrasmettitori

103 Si definisce elemento pre-sinaptico lelemento cellulare a monte della sinapsi e che riceve un segnale da trasmettere. Si definisce elemento post-sinaptico lelemento cellulare a valle della sinapsi che riceve linformazione

104 Sono in minoranza rispetto alle sinapsi chimiche, ma presenti ovunque, specialmente dove sia necessario sincronizzare lattività di un gruppo di cellule in maniera rapida ed efficiente. Le due membrane sono molto vicine fra loro unite da una giunzione comunicante (gap junction). Queste strutture sono costituite da canali esattamente allineati fra loro sulle due membrane (pre- e post-sinaptica) che formano un poro di diametro molto maggiore del poro dei canali ionici visti per il potenziale dazione

105 Questi pori consentono il passaggio anche di molecole di relative grosse dimensioni come ATP e alcuni secondi messaggeri. Gli ioni fluiscono dal neurone pre- sinaptico al neurone post-sinaptico veicolando corrente.

106 Questa struttura implica diverse conseguenze che differenziano profondamente la sinapsi elettrica dalla sinapsi chimica. Una sinapsi elettrica: È bidirezionale È bidirezionale: il flusso ionico può avvenire nelle due direzioni Non mostra ritardo sinaptico: Non mostra ritardo sinaptico: è un flusso ionico estremamente veloce Mostra continuità citoplasmatica Mostra continuità citoplasmatica fra i due elementi Distanza fra elemento pre- e post-sinaptico di 3.5nm Distanza fra elemento pre- e post-sinaptico di 3.5nm contro i nm della sinapsi chimica.

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108 La gap junction è formata da una struttura detta connessone costituita da 6 sub-unità dette connessine che delimitano un poro attraverso cui passano gli ioni.

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110 Le sinapsi elettriche sono diffuse in tutti i tessuti in cui si ha bisogno di ottenere unazione sincrona con trasmissione rapida dellinformazione. Questo avviene per esempio a livello del miocardio, dove si ha bisogno di una contrazione muscolare contemporanea di tutte le fibrocellule atriali e ventricolari. Avviene in alcune aree del SNC (ipotalamo per il controllo della secrezione ormonale), a livello di epatociti, fibrocellule lisce dellintestino, cellule epiteliali del cristallino.

111 Nelle sinapsi chimiche lelemento pre- e post-sinaptico sono separati fra loro da uno spazio di circa 50nm detto spazio sinaptico (synaptic cleft). Da un punto di vista microscopico le sinapsi chimiche sono caratterizzate da vescicole sinaptiche nella terminazione pre-sinaptica. Queste vescicole contengono il trasmettitore chimico diverso a seconda della sinapsi considerata. La sinapsi chimica più studiata è la giunzione neuro- muscolare.

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113 La trasmissione sinaptica in una sinapsi chimica segue una complessa catena di eventi che si innesca quando un potenziale dazione invade la terminazione del neurone pre-sinaptico. Vediamo qualè la sequenza di eventi.

114 Elementi di una giunzione neuromuscolare

115 Il potenziale dazione causa una variazione del potenziale della membrana pre-sinaptica in senso depolarizzante determinando lapertura di canali del calcio dipendenti dal potenziale. Il potenziale dazione causa una variazione del potenziale della membrana pre-sinaptica in senso depolarizzante determinando lapertura di canali del calcio dipendenti dal potenziale. Questo, a seguito del fortissimo gradiente chimico esistente (2mM allesterno e circa M allinterno), determina un rapido influsso di ioni Ca 2+ allinterno del terminale pre-sinaptico. Questo, a seguito del fortissimo gradiente chimico esistente (2mM allesterno e circa M allinterno), determina un rapido influsso di ioni Ca 2+ allinterno del terminale pre-sinaptico. Laumento del calcio innesca esocitosi delle vescicole contenenti il neurotrasmettitore Laumento del calcio innesca esocitosi delle vescicole contenenti il neurotrasmettitore Le molecole di neurotrasmettitore diffondono nello spazio sinaptico e si legano a specifici recettori presenti sulla membrana post-sinaptica. Le molecole di neurotrasmettitore diffondono nello spazio sinaptico e si legano a specifici recettori presenti sulla membrana post-sinaptica.

116 Il legame del neurotrasmettitore al suo recettore determina una risposta elettrica da parte dellelemento post-sinaptico. Nel caso della giunzione neuromuscolare si verificano depolarizzazioni che prendono il nome di potenziali di placca (EPP). In genere in questo tipo di sinapsi la depolarizzazione indotta è sufficiente ad arrivare a soglia e determinare linstaurarsi di un potenziale dazione a livello muscolare con conseguente contrazione della fibra muscolare. Il legame del neurotrasmettitore al suo recettore determina una risposta elettrica da parte dellelemento post-sinaptico. Nel caso della giunzione neuromuscolare si verificano depolarizzazioni che prendono il nome di potenziali di placca (EPP). In genere in questo tipo di sinapsi la depolarizzazione indotta è sufficiente ad arrivare a soglia e determinare linstaurarsi di un potenziale dazione a livello muscolare con conseguente contrazione della fibra muscolare.

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118 Pre Post

119 Nella giunzione neuromuscolare sono stati fatti gli studi principali per la comprensione del funzionamento delle sinapsi chimiche. Una delle scoperte più interessanti è stata che la membrana muscolare mostra piccole modificazioni del potenziale di membrana (circa 0.4mV) anche in assenza della stimolazione del motoneurone pre-sinaptico. Questi fenomeni spontanei vanno sotto il nome di potenziali di placca in miniatura (MEPP). Da unanalisi statistica risulta che ogni EPP deriva dalla somma di più MEPPs.

120 Quindi un singolo MEPP corrisponde al rilascio di una singola vescicola contenente neurotrasmettitore dal terminale pre-sinaptico. Un EPP deriva dallaumentata probabilità di questo evento e quindi dalla somma di più MEPPs. Tale aumentata probabilità deriva dalla stimolazione elettrica del terminale pre-sinaptico che induce un rilascio Ca 2+ -mediato delle vescicole. Si dice quindi che a livello sinaptico il rilascio di neurotrasmettitore è di tipo quantico, cioè avviene per pacchetti discreti di neurotrasmettitore.

121 Distribuzione dei MEPPs Distribuzione quantica delle ampiezze degli EPPs

122 Nei motoneuroni che, a livello di giunzione neuromuscolare, utilizzano acetilcolina (ACh) come neurotrasmettitore, le vescicole contengono una concentrazione di ACh di circa 100mM che corrisponde a circa molecole di neurotrasmettitore per vescicola.

123 Abbiamo detto che il rilascio di vescicole è Ca 2+ - dipendente e dipende da un aumento del calcio citoplasmatico dovuto allingresso degli ioni attraverso canali del cacio dipendenti dal potenziale. Nel processo di esocitosi delle vescicole sono coinvolte numerose proteine fra cui la sinaptotagmina che funziona come sensore per laumento del calcio intracellulare e innesca quindi il meccanismo di fusione delle vescicole.

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125 Neurotrasmettitori Il ciclo di attività di tutti i neurotrasmettitori è simile. Sono sintetizzati e immagazzinati nelle vescicole della cellula pre-sinaptica Sono sintetizzati e immagazzinati nelle vescicole della cellula pre-sinaptica Sono liberati in seguito ad esocitosi delle vescicole ed interagiscono con recettori specifici di una o più cellule post-sinaptiche Sono liberati in seguito ad esocitosi delle vescicole ed interagiscono con recettori specifici di una o più cellule post-sinaptiche Sono rapidamente rimossi o degradati nello spazio sinaptico. Sono rapidamente rimossi o degradati nello spazio sinaptico.

126 I neurotrasmettitori sono in genere suddivisibili in due grandi categorie: Piccole molecole: Piccole molecole: in genere mediano reazioni rapide (Ach, NE, Glutammato, GABA, Gly, Dopamina, etc..) Neuropeptidi: Neuropeptidi: tendono a modulare funzioni cerebrali più lente e continue (L-ENK, M-ENK, sostanza P, neurotensina, etc…) Entrambi si legano comunque a recettori e tendono a modificare le proprietà elettriche dellelemento post- sinaptico.

127 In base a quali criteri si identifica un neurotrasmettitore? La sostanza deve essere presente nel neurone pre-sinaptico (e anche tutti gli enzimi per produrla) La sostanza deve essere presente nel neurone pre-sinaptico (e anche tutti gli enzimi per produrla) Il rilascio della sostanza deve avvenire in risposta ad una depolarizzazione pre- sinaptica che deve essere Ca 2+ -dipendente Il rilascio della sostanza deve avvenire in risposta ad una depolarizzazione pre- sinaptica che deve essere Ca 2+ -dipendente La membrana dellelemento post-sinaptico deve portare i recettori per quella sostanza. La membrana dellelemento post-sinaptico deve portare i recettori per quella sostanza.

128 Sostanza presente Evento Ca 2+ - dipendente Recettori presenti

129 Attualmente sono noti numerosissimi neurotrasmettitori e fra questi anche alcuni ormoni che possono in alcuni distretti cerebrali avere una funzione in sinapsi (ad esempio ossitocina e vasopressina). Inoltre si sa che i neuroni possono liberare anche più di un tipo di neurotrasmettitore: si parla di co- trasmettitori. Vediamo qualcosa, in modo schematico, sulla sintesi dei neurotrasmettitori.

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131 I neurotrasmettitori a piccole molecole sono sintetizzati nelle terminazioni pre-sinaptiche. Gli enzimi necessari sono trasportati con trasporto assonico lento ad una velocità di 0.5-5mm/die. Le molecole precursore utilizzate sono trasportate da proteine trasportatrici.

132 I neurotrasmettitori peptidici sono prodotti per trascrizione genica sotto forma di precursori che subiscono modificazioni nel REG e poi nel Golgi. Le vescicole sono poi trasportate alla terminazione lungo lassone con trasporto assonico rapido (fino a 400mm/die) lungo i microubuli.

133 Dopo che il trasmettitore ha svolto la sua azione legandosi al suo recettore specifico, deve essere rapidamente rimosso per estinguere leffetto. Questo può avvenire per retro-trasporto allinterno del terminale pre-sinaptico (NE) o per degradazione ad opera di enzimi specifici (ACh) o per la combinazine di entrambi i processi. Vediamo un esempio.

134 Diffusione al di fuori dello spazio sinaptico Degradazione enzimatica Re-uptake

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136 Recettori dei neurotrasmettitori I neurotrasmettitori generano risposte elettriche negli elementi post-sinaptici legandosi a proteine di membrana dette recettori. Questi, a loro volta determinano in modo diretto o indiretto apertura o chiusura di canali ionici della membrana post-sinaptica. Il tipo di canale determinerà se leffetto del trasmettitore è eccitatorio oppure inibitorio.

137 I recettori si dividono in due classi principali: Recettori a gating diretto: sono recettori che, oltre a portare il sito di legame per il trasmettitore sono anche canali. Ad esempio i recettore colinergico nicotinico, il recettore GABAergico A, il recettore NMDA per il glutammato, recettore AMPA-kainato, recettore serotoninergico 5-HT3. Recettori a gating indiretto: sono accoppiati ad un canale attraverso un G-proteina ed eventualmente un sistema di secondi messaggeri. Ad esempio i recettori α- e β- adrenergici, i recettori colinergici muscarinici (M1-M5), GABA B e i recettori per tutti i neuropeptidi.

138 Recettore a gating diretto: recettore nicotinico

139 Recettore a gating indiretto: recettore muscarinico M2

140 La risposta elettrica dellelemento post-sinaptico in seguito a rilascio di neurotrasmettitore è stato studiato ancora una volta sulla giunzione neuromuscolare, che risulta essere particolarmente accessibile a misure elettrofisiologiche. ACh rilasciata nello spazio sinaptico si lega al recettore nicotinico e in particolare alle due sub-unità α determinando lattivazione di un canale cationico che permette lingresso di Na + e Ca 2+ e luscita di K +. La risultante corrente prende il nome di corrente di placca e determina a sua volta una variazione del potenziale in senso depolarizzante (eccitatorio) di membrana noto con il nome di EPP.

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142 Spazio sinaptico Muscolo

143 Risulta formato da 5 sub-unità: 2 sub-unità α: presentano il sito di legame per ACh e per neurotossine 1 sub-unità β 1 sub-unità γ (ε nel feto): insieme alle α e δ forma il sito per ACh 1 sub-unità δ I recettori nicotinici di una giunzione neuromuscolare sono circa 10 7 /10 8 con una densità di 20000/µm 2, clusterizzati intorno alla zona di contatto sinaptico.

144 Il potenziale di inversione del recettore nicotinico, cioè quel valore di potenziale a cui la corrente netta attraverso il canale è zero, vale circa -10mV. Questo, attraverso considerazioni di vario tipo, porta a stabilire che le correnti che passano attraverso il recettore-canale siano: Una corrente al Na + in ingresso Una corrente al K + in uscita Questo significa in effetti che più o meno vale: V EPP = (E Na + + E K + )/2 = (+60mV – 90mV)/2 = -17mV

145 Quindi, questo significa che ogni volta che 2 molecole di ACh si legano alle sub-unità α del recettore nicotinico sulla membrana muscolare, inizia a passare una corrente mista Na-K attraverso il canale del recettore. Questa corrente di placca determina una depolarizzazione locale (EPP) della membrana e questo flusso di corrente continua in senso depolarizzante fino a quando il potenziale di membrana approssima i - 17mV, cioè il potenziale di inversione dellEPP.

146 Rivediamo la sequenza completa degli eventi

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149 Quando più EPPs si sommano fra loro, il livello di depolarizzazione è sufficiente ad attivare il ciclo di Hodgkin dei canali del Na + e quindi ad evocare il potenziale dazione per dare inizio alla contrazione muscolare.

150 Sinapsi eccitatorie e sinapsi inibitorie

151 I potenziali post-sinaptici modificano la probabilità che si produca un potenziale dazione nella cellula post- sinaptica. Se la probabilità di uno spike aumenta si parla di potenziali post-sinaptici eccitatori EPSP (vedi placca motrice). Se la probabilità di uno spike diminuisce si parla di potenziali post-sinaptici inibitori IPSP (vedi sinapsi GABAergiche).

152 Quello che distingue fondamentalmente un EPSP da un IPSP è il valore del potenziale di inversione rispetto al potenziale soglia necessario per evocare uno spike. In una sinapsi eccitatoria il potenziale post-sinaptico sposta il potenziale di membrana verso il valore soglia, mentre in una sinapsi di tipo inibitorio il potenziale post-sinaptico sposta il valore della membrana lontano dal valore soglia, talvolta addirittura iperpolarizzando la membrana. Le sinapsi inibitorie più diffuse sono le sinapsi GABAergiche (PNS) e glicinergiche (CNS) che attivano una conduttanza al Cl -.

153 EPSP

154 Si può parlare di inibizione pre-sinaptica pre-sinaptica: lazione inibitoria è sul neurone pre- sinaptico, cioè modula lazione eccitatoria dellelemento pre-sinaptico. post-sinaptica post-sinaptica: lazione inibitoria è sullelemento post- sinaptico, riducendone leccitabilità

155 azione inibitoria Pre- Post-

156 Pre- Post- Inhibitory synapse

157 Inibizione pre-sinaptica Inibizione post-sinaptica

158 Sommazione dei potenziali sinaptici In generale, soprattutto a livello di CNS, ogni neurone riceve in input il segnale proveniente da decine a migliaia di sinapsi. La cellula post-sinaptica è in grado di integrare tutti questi segnali grazie a fenomeni che vanno sotto il nome di sommazione spaziale e sommazione temporale.

159 Sommazione spaziale= è la somma delleffetto di input sinaptici multipli in punti diversi del soma e dei dendriti della cellula. Due stimoli eccitatori sotto- soglia possono, se sommati, dare una depolarizzazione che arriva a soglia. Sommazione temporale= è laccumulo di deplarizzazioni successive dovute allattività ripetitiva. Ciascun potenziale si somma al precedente sulla fase di discesa.

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