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Il locus AB0 presenta 4 alleli: A1, A2, B, 0 Ciò comporta lesistenza di 6 fenotipi e 10 genotipi.

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2 Il locus AB0 presenta 4 alleli: A1, A2, B, 0 Ciò comporta lesistenza di 6 fenotipi e 10 genotipi.

3 LE SPECIFICITÀ ABH SONO LEGATE ALLA COMPONENTE SACCARIDICA E AL TIPO DI LEGAMI CHE QUATTRO ZUCCHERI ASSUMONO SULLA PARTE TERMINALE DI UNA CATENA SACCARIDICA DEFINITA SOSTANZA DI BASE SULLA QUALE SI HA LA BIOSINTESI DEGLI ANTIGENI ABH, MA ANCHE DI ALTRI COME I LEWIS, P, I e i. IMMUNODOMINANT SUGAR GLYCOSYL TRASFERASE D-GalactoseD- GalactosyltransferaseB N- Acetyl- galactoseamine N-Acetyl-galactosaminyl- transferase A L-FucoseL-FucosyltransferaseH GENE

4 Lassenza degli antigeni A e B nel fenotipo O derivano dalla delezione di una singola base nucleotidica nella porzione del DNA codificante le transferasi e responsabile dello spostamento della cornice di lettura con conseguente sintesi di una proteina sprovvista di attività transferasica. Differenze nucleotidiche riscontrate fra gli alleli ABO Legenda G=guanina C=citosina A=adenina CAC793 GAG700 CGC523 DelezioneGG258 Base n° OBAALLELI

5 Gli antigeni eritrocitari o gruppi sanguigni polisaccaridici AB0 Lewis P H I proteici Rh

6 17q12-q DiegoBand 3 4q28-q31N, S, s, UGPB 3q13 85 Non conosciutaIAP 19p LW Proteine accessorie 6p21.1-p11 17,75,174 RhAG 1p36.13-p Ce,CE,ce,cERhCcEe 1p36.13-p DRhD Famiglia delle proteine Rh Localizzazione genicaAntigeniProteine Rh protein family Avent N., Blood 2000

7 Rh protein family Il 40% di omologia indica una relazione ancestrale 12 domini transmembrana con le estremità N-terminale e C-terminale rivolti verso la porzione intracitoplasmatica Avent N., Blood 2000 I primi 41 aminoacidi allestremità N- terminale sono identici RhD differisce da RhCE solo per aa lungo lintera sequenza della proteina. Nonostante questa omologia le proteine RhCcEe non esprimono lantigene D e viceversa

8 Soggetti Rh-negativi Nella popolazione Caucasica i soggetti RhD- hanno la delezione del gene RhD In altre popolazioni come i Giapponesi o gli Africani il fenotipo D- non è legato alla perdita del gene. Avent N., Blood 2000

9 Frequenza nella pop. USA molto raro rh v CdE 2537rhCde <1 rhcdE <1 rhCde <1 Rh z CDE 493Rh 0 cDe 717Rh 2 cDE 841Rh 1 CDe NegriBianchiWeinerFisher-Race Aplotipi Rh e loro frequenze Wright M.

10 Sistema LEWIS Gli Ag sono correlati con quelli AB0; i G.R.acquisiscono il fenotipo adsorbendoli dal plasma; il gene è distinto ma correlato con quello del carattere di secretore Sistema P La maggioranza degli uomini è P1 + ; le reazioni trasfusionali sono rare ma gravi Sistema MN Gli Ag sono glicoforine; gli Ac anti-M o N umani sono rari; se IgG eritroblastosi

11 Sistema KELL e Sistema Duffy Possono causare reazioni trasfusionali gravi, evitabili con la prova crociata maggiore Gli antigeni K e Fy(a) / (b) sono buoni immunogeni ed evocano la produzione di anticorpi di isotipo IgG

12 SISTEMA Kell SISTEMA KELL: Ag Kell presente nel 9% della popolazione Ag k (cellano) presente nel 99,8% della popolazione KK: 0,2% Kk: 8,8% kk: 91% Sia K che k sono molto IMMUNOGENI, secondi solo al D Gli anticorpi anti-D, anti-K o anti-k possono dare la Malattia Emolitica Neonatale (MEN) e reazioni emolitiche trasfusionali immediate e ritardate

13 MNS, LEWIS, DUFFY E KIDD SISTEMA MNS: importante lanti S e anti s perché possono causare MEN e reazione emolitica trasfusionale SISTEMA LEWIS: Le a e Le b. Gli anti- Le a possono dare reazione trasfusionale SISTEMA DUFFY (Fy a e Fy b ) e SISTEMA KIDD (jk a e jk b ) i cui anticorpi sono in grado di dare MEN e reazioni emolitiche trasfusionali

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15 I principali obiettivi del trasfusionista sono due: il primo è prevenire la reazione trasfusionale identificando i pazienti immunizzati e fornendo loro sangue compatibile; il secondo è prevenire la produzione di anticorpi, scegliendo i donatori più simili, come caratteristiche gruppoematiche, al paziente.

16 Le Procedure pretrasfusionali La ricerca di anticorpi è una procedura estremamente importante in campo trasfusionale, in quanto se si trasfondono emazie che portano un antigene corrispondente allanticorpo presente nel siero del paziente si possono verificare gravi complicazioni. 1.Distruzione in vivo dei globuli rossi del donatore 2.Emolisi in vivo 3.Fagocitosi nel fegato o nella milza degli eritrociti sensibilizzati dallanticorpo e dal complemento. Pertanto i gruppi di soggetti da sottoporre a questa indagine sono rappresentati da: 1.Pazienti candidati alla trasfusione a.Di competenza chirurgica e b.Di competenza medica 2.Donne in gravidanza 3.Donatori di sangue

17 COMPATIBILITY TESTING What is Compatibility Testing? Pre Transfusion Protocol to insure the Patients health and the survival of transfused red cells. It includes: –Patient Identification, Labeling, Collection of patient sample, ABO, Rh, Crossmatch search for irregular antibodies.

18 Steps In Compatibility Testing Review available Recipient Records FOR: –PREVIOUS ABO & Rh –Any PRIOR UNEXPECTED Antibodies –Any PRIOR ADVERSE REACTIONS to transfusion Correct identification of Donor Unit by Confirming 1.The unit ID with the ID on the donor units records 2.The units ABO & Rh on the record for consistency with that of the patient

19 Comprendono: lanti-A dei soggetti B, lanti B dei soggetti A e lanti-A, anti-B e anti-AB dei soggetti 0. Oltre questi ricordiamo, gli anticorpi irregolari anti-A1 che si ritrovano nei soggetti con fenotipo A2 e A2B e lanti-H che si può ritrovare in alcuni soggetti A1, A1B, B ed in tutti i soggetti con fenotipo Bombay. Anti-A1: i sieri dei soggetti B e 0 contengono una miscela di anti-A e anti-A1. Lanti-A1 è anche presente nel 2% dei soggetti A2 e nel 25% nei soggetti A2B Anti-H: esistono 3 tipi di anti-H, uno attivo a 37°C che si osserva nei soggetti con fenotipo Bombay, uno freddo con optimum termico a 4°C (nei soggetti A1, A1B o B non secretori di sostanze gruppo specifiche) e uno che viene formato come autoanticorpo.

20 Gli anticorpi verso gli antigeni eritrocitari anticorpi naturali anticorpi irregolari

21 Anticorpi Irregolari Per ricerca di anticorpi, si intende quellinsieme di procedure atte alla evidenziazione della presenza di anticorpi inattesi nel siero di un paziente. Ricerca di anticorpi: 1.Prove di compatibilità 2.Coombs diretto 3.Prova indiretta del gruppo sanguigno

22 Classificazione degli anticorpi Classificazione a seconda del meccanismo di produzione a.Anticorpi naturali, o attesi o regolari. b.Anticorpi immuni. Classificazione degli anticorpi a seconda della loro reazione con gli eritrociti a.Agglutinine b.Emolisine c.Sensibilizzanti Classificazione a seconda della struttura (immunoglobuline). IgG IgM IgA IgD e IgE (queste ultime poco importanti in campi trasfusionale).

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24 Compatibility Testing CROSSMATCH (X-M) Testing RECIPIENT SERUM with DONOR CELLS May include Immediate Spin, 37 o C, & AHG Phases (extended X-M) PURPOSE Detect Recipient Antibodies that can react with DONOR Cells

25 Complete (Extended) Crossmatch is Required for Patients with: 1.Unexpected Antibodies 2.Prior records of unexpected Antibodies 3.Problems with transfusion 4.The Antibody(s) should be identified prior to transfusion, if possible –Some may not be possible to identify, such as some auto-antibodies

26 Test di Coombs Test di emoagglutinazione in vitro utilizzato per evidenziare anticorpi eritrocitari Test diretto Test indiretto

27 ANTIGRAM LANTIGRAM di un pannello eritrocitario ad 11 cellule costituito da aliquote di emazie del gruppo 0 provenienti da singolo donatore selezionate per la loro composizione antigenica ci mostra i più frequenti anticorpi che si possono trovare nel siero di un paziente.

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29 Special Circumstances EXTREME EMERGENCY –No time for even ABO grouping & Rh typing –Initially, the unit of choice is Gr O Rh Neg. –The Attending Physician understands that a sample must be obtained from the patient as quickly as possible & the Physician must wait compatibility testing

30 Special Circumstances Extreme Emergency Continued If Patient is Rh negative but… –has NO evidence of anti-D and is male or beyond child bearing age, then it may be more efficient to give Rh Pos blood –If it is determined that giving Rh Pos units to an Rh negative patient is appropriate, the Attending Physician must be informed of this & consent must be obtained in advance

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32 REAZIONI TRASFUSIONALI ACUTE IMMUNOLOGICHE emolitiche febbrili non emolitiche Allergiche (cutanee e anafil.) edema polmonare non cardiogeno (TRALI) NON IMMUNOLOGICHE contaminazione batterica sovraccarico circolatorio emolisi fisica/chimica danni da conservazione

33 EDEMA POLMONARE NON CARDIOGENO transfusion related acute lung injury (TRALI) Grave sindrome respiratoria, caratterizzata dal classico quadro radiologico e sintomatologico senza insufficienza cardiaca, che interviene durante o entro 6 ore dal termine della trasfusione con una frequenza variabile 1: : eventi trasfusionali (le forme lievi frequentemente non vengono diagnosticate) E causato da una reazione tra leucoagglutinine del donatore e leucociti del ricevente con formazione di aggregati leucocitari che, intrappolati nel microcircolo polmonare, ne alterano la permeabilità vasale

34 REAZIONI TRASFUSIONALI RITARDATE IMMUNOLOGICHE emolitiche ritardate alloimmunizzazione leucociti piastrine porpora post-trasfusionale da HPA1-a NON IMMUNOLOGICHE emosiderosi indotta dalle trasfusioni trasmissione malattie infettive (virali)

35 REAZIONI IMMUNOLOGICHE EMOLITICHE RITARDATE SINTOMI febbre, ittero, ANEMIA inattesa (7-10gg dopo linfusione) puo essere necessaria unaltra trasfusione talvolta asintomatiche EZIOLOGIA anticorpi IgG risposta anamnestica Rh,Kell,Duffy, Kidd, MNS anticorpi siero - eluato

36 virali: epatite B, C HIV1-2 Mononucleosi infettiva CMV HTLV 1 -2 Parvovirus batteriche endogene (dal sangue del donatore) treponema,brucella,rickettsia,yersinia,campylobacter,staph.aureus, strept.viridans esogene (dalla cutedel donatore o dallambiente) staph.epidermidis,micrococcus,sarcina,pseudomonas,flavobacterium bacillus parassiti malaria,tripanosoma,toxoplasma,babesia,leishmania Complicanze infettive

37 Pazienti di competenza chirurgica Abitualmente viene richiesta una quantità di sangue eccedente le reali necessità, con conseguente sequestro delle unità non utilizzate da parte dei reparti per almeno due o tre giorni e conseguente invecchiamento del sangue stesso e quindi a rischio di scadenza. La soluzione a questo problema è lassegnazione a disposizione e la prova rapida di compatibilità. Pazienti di competenza medica Ai pazienti di competenza medica è raccomandata la seguente strategia: 1.Tipizzazione eritrocitaria per il maggior numero di antigeni prima di iniziare le trasfusioni. 2.Prova di compatibilità per ogni unità assegnata. 3.Ricerca di anticorpi irregolari. 4.Controllo autologo. Donne in gravidanza Devono essere sottoposte alle seguenti indagini: 1.Tipizzazione eritrocitaria. 2.Ricerca di allo-anticorpi irregolari. 3.Nel caso di compatibilità A B 0 eventualmente cross-match con le emazie del marito. Donatori di sangue La ricerca di anticorpi irregolari si esegue per i seguenti motivi. Evidenziare la presenza di anticorpi. Nel caso in cui sangue di gruppo 0 venga impiegato per un ricevente di altro gruppo.

38 GLI EMOCOMPONENTI Gli emocomponenti sono i prodotti della separazione degli elementi costituitivi del sangue e vengono ottenuti sia da una donazione tradizionale di sangue intero sia da una donazione mediante aferesi con separatore cellulare. Gli emocomponenti si distinguono in due grandi categorie: USO TRASFUSIONALE USO TOPICO

39 Emocomponenti Peruso Per uso Trasfusionale Concentrati eritrocitari convenzionali o modificati Concentrati piastrinici convenzionali o modificati Plasma fresco congelato Concentrati leucocitari Concentrati di c. staminali da sangue periferico Sangue placentare Per uso Topico Colla di fibrina Gel piastrinico Emocomponenti:Classificazione Emocomponenti: Classificazione

40 Prima centrifugazione (a.T.A.) Prima centrifugazione (a.T.A.) Alta velocità Emocomponenti Caratteristiche Plasma povero di piastrine ml di plasma (contiene la maggior parte del plasma da congelare.) Parte superiore della sacca 50 ml Contenenti: 10% di globuli rossi 70% di leucociti 80% delle piastrine Buffy - coat Strato intermedio tra il plasma e i globuli rossi ml di globuli rossi ml di S.A.G.M (contengono circa il 30% di leucociti ) Globuli Rossi Parte inferiore della sacca Preparazione di C.E. ; P.F.C. ; C.P. (da Buffycoat) Preparazione di C.E. ; P.F.C. ; C.P. (da Buffycoat) Partendo da una donazione di 450 ml di sangue intero in sacca quadrupla Emocomponenti: Uso più frequente

41 Seconda Centrifugazione (a.T.A.) Seconda Centrifugazione (a.T.A.) Bassa velocità Parte superiore della sacca Emocomponenti Caratteristiche Concentrato Piastrinico 1) Da singolo B.C. Da Buffy-coat 2) Da pool di 4-6 B.C 2) Da pool di 4-6 B.C. B.C. povero di piastrine Parte inferiore della sacca 1) 50 ml contenenti: x 10 9 piastrine 2) ml contenenti: 2) ml contenenti: x 10 9 piastrine Contiene circa il 10% di globuli rossi e il 70% di leucociti donati

42 ConcentratiEritrocitari Concentrati Eritrocitari Modificati C. Eritrocitari leucodepleti C. Eritrocitari lavati C. Eritrocitari irradiati C. Eritrocitari congelati C. Eritrocitari per uso pediatrico C. Eritrocitari universali ConcentratiPiastrinici Modificati Concentrati Piastrinici Modificati C. Piastrinici leucodepleti C. Piastrinici lavati C. Piastrinici irradiati C. Piastrinici congelati CONCENTRATI ERITROCITARI E PIASTRINICI MODIFICATI

43 CELLULE STAMINALI DA SANGUE PERIFERICO Vengono raccolti da donatore mediante leucoaferesi dopo mobilizzazione nel torrente circolatorio con fattori di crescita GM-CSF. Per ottenere un numero adeguato di cellule CD 34 è necessario procedere afereticamente da 3 a 4 volte il volume ematico (200 ml/kg di peso). Devono essere trasfuse subito dopo scongelamento a 37 °C. Le cellule staminali da sangue periferico P.B.S.C. (Peripheral Blood Stem Cell) vengono sospesi in una soluzione contenente un crioprotettore (DMSO) e proteine (plasma-albumina) congelati e conservati a -180 °C in fase gassosa di azoto.

44 SANGUE PLACENTARE Contiene i progenitori emopoietici indispensabili ai fini del trapianto di midollo osseo sia autologo che allogenico ed è in grado di determinare un completo ripopolamento cellulare. Prelevato subito dopo la resezione del cordone ombelicale viene congelato nel più breve tempo possibile (in DMSO 10%). Viene conservato in azoto liquido a -140 °C fino a 15 anni. Volume sacca : 60 ml; cellularità totali: >800*10 6 ; determinazioni in citofluorimetria delle cellule CD34 Tipizzazione HLA. Tale volume però non consente nell adulto di somministrare la dose minima cellulare raccomandato (20 milioni di cellule nucleate/kg di peso c o r p o r e o). Per ovviare a questi inconvenienti sono possibili programmi di espansione cellulare con aumenti in due settimane di circa 100 volte il numero di cellule staminali.

45 Quando si trasfonde ? Piastrine Chemioterapia Trapianto Anemia Aplastica Mielodisplasie Insufficienza midollare CID Trombocitopatie Plasma CID HUS-TTP sovradosaggio di: anticoagulanti orali agenti trombolitici Emazie Chemioterapia Trapianto Anemia Aplastica Mielodisplasie Insufficienza midollare

46 La trasfusione di emazie dovrebbe in teoria essere effettuata tanto rapidamente quanto è necessario per correggere il deficit di trasporto di ossigeno nella emorragia acuta una unità di emazie aumenterà il livello di emoglobina di 1 g/dl in una persona di 70 chilogrammi (3-4 ml/kg di emazie concentrate). In caso di emorragia acuta …..

47 TRASFUSIONE DI GLOBULI ROSSI NELLANEMIA CRONICA Lobiettivo della trasfusione di globuli rossi in questi pazienti è di ridurre gli effetti deleteri dellanemia portando il tasso di emoglobina o lematocrito al di sopra del livello stabilito. Sintomi dellanemia insorgono di solito quando il tasso di emoglobina scende al di sotto di g/dL. I sintomi includono tachicardia, dispnea/tachipnea, sensazione di testa vuota, sincope, astenia od intolleranza allo sforzo muscolare, angina, cefalea, claudicatio ed affaticamento. I sintomi possono esordire precocemente (ad esempio con tasso di emoglobina di 7 g/dL) in pazienti con età avanzata e/o con ridotta funzionalità cardiorespiratoria. Pazienti con tasso di emoglobina superiore ad 8 g/dL raramente richiedono trasfusione di globuli rossi.

48 Concentrato eritrocitario Indicato per incrementare lapporto di ossigeno ai tessuti : Hb < 8g/dl o Ht < 24% Hb < 9 g/dl in pazienti in programma per intervento Hb < 10 g/dl in paziente sintomatico per anemia in cardiopatia e/o pneumopatia Neonati con Hb <13g/dl ed exsanguinotrasfusione. Non sono indicati: per espandere il volume ematico in caso di carenza marziale e/o vitaminica in condizioni cliniche stabili

49 Note di buona pratica clinica Per valutare lefficacia della trasfusione occorre valutare le modificazioni dei parametri ematologici e riportarli nella cartella clinica La quantità di CE da trasfondere può essere calcolata con la seguente formula : Corrected Count Increment Q. tà sangue da trasfondere = 251 x peso Pz. in Kg x lincremento di Hb desiderato/Ht medio unità da trasfondere

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51 Trasfusione di Piastrine

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53 Pretransfusion INR Predicts the Effect of FFP

54 Emazie congelate Congelate entro 7 giorni dal prelievo Metodica ad alto gliceroloconservate da –60°C a -80°C Metodica a basso glicerolo conservate in vapori di azoto liquido a temperatura compresa tra -140°C e -150°C Possono essere conservate per 10 anni Scongelate, lavate e ricostituite, sospese in una soluzione fisiologica. Conservate tra +2 e +6 °C per non più di 24 ore CQ: Ht compreso tra 0,65 e 0,75% Hb >36g/unità Leucociti < 1x10 9

55 Plasma per uso clinico Prodotto da sangue intero o da aferesi di donatori periodici e volontari Congelato entro 6 ore dalla donazione Congelato in maniera uniforme, entro 1 ora Conservato per 24 mesi se stoccato a - 40°C Scongelato in bagno con continua agitazione a temperatura tra + 30° e + 37°C Utilizzato nel più breve tempo possibile, non oltre 24 ore se conservato tra 2°- 6°C CQ: Deve contenere almeno il 70% del contenuto originale di Fattore VIII Proteine totali > 50 g/L Assenza di anticorpi irregolari clinicamente significativi Emazie residuo < 6 x10 9 Leucociti residuo <0,1x10 9 Piastrine residuo < 50x10 9 Assenza di precipitati visibili Sterilità

56 Crioprecipitato Costituito dalla frazione crioglobulinica del plasma fresco Scongelato lentamente a 2°- 6°C per 12 ore e concentrato ( per centrifugazione o sifonamento) in un volume finale di ml Contiene fatt.VIII,fatt. di Von Willebrand, fibrinogeno, fatt.XIII e fibronectina CQ : Fatt.VIII 70% del contenuto di partenza

57 Concentrati piastrinici Indicati: Per il trattamento e profilassi delle emorragie dovute a carenza qualitativa o quantitativa delle piastrine Per i pazienti medici stabili e senza complicazioni il valore soglia è / µL Terapia dellemorragia nei pazienti medici con piastrine /µL Per i pazienti chirurgici il valore soglia è / µL Se il conteggio è compreso tra e / µL la trasfusione di piastrine è indicata solo in condizioni particolari (procedure a cielo coperto, neurochirurgia, campi operatori altamente vascolarizzati). CQ: Contenuto in piastrine = x 10 9 Plasma = ml. Leucociti < 1x10 9 Eritrociti<1x10 9 Ph tra 6,4-7,4 Consevate tra 20°-24°C in continua agitazione per 5gg

58 Non indicati: Nelle piastrinopenie da eccessiva distruzione (porpora trombocitopenica idiopatica, porpora trombotica trombocitopenica, sindrome uremica- emolitica, coagulazione intravascolare disseminata) nella circolazione extracorporea e nella trasfusione massiva a scopo profilattico come profilassi se il conteggio è >10.000/microlitro e il paziente è in condizioni stabili

59 Valutazione clinica della risposta alla trasfusione piastrinica Viene effettuata tramite la formula del corretto incremento (Correct Count Increment) CCI = incremento della conta piastrinica (migliaia/µL) x superficie corporea in mq /numero di piastrine trasfuse (x ) La trasfusione viene considerata: efficace CCI >7500 parzialmente efficace CCI inefficace CCI <5000

60 Indicazioni alla raccolta di sangue autologo. Si Trapianto di fegato NoSiGravidanza plurima NoSiPlacenta previa Si Prostatectomia radicale Si Interventi correttivi per scoliosi NoSiProtesi totale di ginocchio Si Protesi totale danca Si Interventi a cuore aperto Si Interventi di chirurgia vascolare maggiore RecuperoPredepositoTipo intervento

61 Emocomponenti per uso non trasfusionale Gel di piastrine azione di stimolo sulla rigenerazione tessutale derivato dallassociazione del concentrato piastrinico ( fonte di fattori di crescita) con il crioprecipitato ( fonte di fibrinogeno, fibronectina e altri fattori procoagulanti) Colla di fibrina azione adesiva ed emostatica derivato da plasma (ricco fibrinogeno, fibronectina ed altre proteine plasmatiche con scarsa presenza di piastrine) Per essere utilizzati clinicamente devono essere attivati, utilizzando cloruro di calcio ( o gluconato di calcio) e trombina autologa o batroxobina Piastrine e plasma rappresentano una fonte autologa o omologa di fattori di crescita e proteine procoagulanti, clinicamente impiegabili (PRP)

62 LAFERESI SEPARATORE A FLUSSO DISCONTINUO FLUSSO CONTINUO

63 LAFERESI Eritrociti Neutrofili Linfociti Monociti Piastrine Plasma Volume µm 3 DiametroDensità g/cm 3

64 LAFERESI AFERESI PRODUTTIVA SINGLE COMPONENT PLTPFC MULTI COMPONENT GR - PLT PFC - PLT DOPPIA PLT GR - PFC DOPPIA GR


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