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LA DIAGNOSTICA MOLECOLARE IN ALLERGOMETRIA Dott.ssa Lisa Pecorari Università degli Studi di Ferrara SIAIP Bologna, 28/02/2015.

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1 LA DIAGNOSTICA MOLECOLARE IN ALLERGOMETRIA Dott.ssa Lisa Pecorari Università degli Studi di Ferrara SIAIP Bologna, 28/02/2015

2 Diagnosi Sintomo Il percorso diagnostico in allergologia

3 L’Iter diagnostico si fonda su: Anamnesi Esame obiettivo Indagini allergologiche Anamnesi Esame obiettivo Indagini allergologiche

4 Test in vivo Prick test Intradermoreazioni Patch test Test di provocazione Test in vitro Dosaggio IgE sieriche Indagini Allergologiche :

5 Definizioni … FONTE ALLERGENICA Indica il contenitore materiale degli allergeni, ad es. : la parietaria, l’uovo, sono fonti allergeniche, non allergeni, come spesso siamo soliti far riferimento ESTRATTO ALLERGENICO Gli estratti allergenici comunemente impiegati per la diagnostica in vivo (Prick test) e in vitro (RAST, ELISA ecc.) provengono da fonti allergeniche (polline di graminacee,parietaria,uovo ecc.) ALLERGENE Proteina o glicoproteina che ha PM tra 5 e 150 kDa e un punto isoelettrico tra 4 e 9. Ogni allergene può presentare un numero elevato di determinanti antigenici o epitopi EPITOPO Sequenza amminoacidica riconosciuta da uno specifico anticorpo (IgE, IgG, ecc)

6 Caratteristiche degli epitopi Gli epitopi possono essere “lineari” (amminoacidi in sequenza, contigui e presenti sulla struttura primaria dell’antigene) solitamente termo- e gastro-resistenti “conformazionali” (amminoacidi non in sequenza, distanti tra loro ma che a causa del ripiegamento della catena proteica possono diventare contigui, quindi la loro formazione dipende dalla struttura tridimensionale dell’allergene) solitamente termo- e gastro-labili Gli epitopi possono essere “lineari” (amminoacidi in sequenza, contigui e presenti sulla struttura primaria dell’antigene) solitamente termo- e gastro-resistenti “conformazionali” (amminoacidi non in sequenza, distanti tra loro ma che a causa del ripiegamento della catena proteica possono diventare contigui, quindi la loro formazione dipende dalla struttura tridimensionale dell’allergene) solitamente termo- e gastro-labili

7 Conformazione sterica molecolare MOLECOLE ALLERGENICHE GASTRO E TERMORESISTENTI raggiungono l’intestino in forma pressochè immodificata MOLECOLE ALLERGENICHE GASTRO E TERMOLABILI REAZIONI SISTEMICHE SINDROME ORALE ALLERGICA

8 ALLERGENI ALIMENTARI DI CLASSE 1 Proteine resistenti alla digestione e al calore, in grado di comportarsi da allergeni sensibilizzanti a livello gastrointestinale (ad es. le maggiori proteine allergeniche del latte, dell’uovo, del pesce, dei crostacei e di alcuni vegetali) ALLERGENI ALIMENTARI DI CLASSE 2 Proteine non resistenti alla digestione e al calore, incapaci di provocare sintomi sistemici (presenti nei vegetali ma anche in alimenti di derivazione animale come preteine tremolabili del latte, della carne, dell’uovo) Causano per lo più sintomi localizzati al cavo orale (come la sindrome orale allergica)

9 CROSS REATTIVITA’ TRA ALLERGENI ALIMENTARI DI CLASSE 2 ED ALLERGENI OMOLOGHI Alcuni pazienti possono presentare reazioni allergiche assumendo alimenti allergizzanti mai assunti prima Questo succede perchè i pazienti in precedenza si sono sensibilizzati con allergeni omologhi contenuti nei pollini CROSS REATTIVITA’ TRA ALLERGENI ALIMENTARI DI CLASSE 2 ED ALLERGENI OMOLOGHI Alcuni pazienti possono presentare reazioni allergiche assumendo alimenti allergizzanti mai assunti prima Questo succede perchè i pazienti in precedenza si sono sensibilizzati con allergeni omologhi contenuti nei pollini

10 CLASSIFICAZIONE DELLE MOLECOLE ALLERGENICHE Le molecole allergeniche si possono ulteriormente classificare in: - “GENUINE”, vere marcatrici di una determinata fonte (es. Ole e 1 è la proteina marcatrice dell’allergia al polline dell’olivo e delle altre Oleaceae) - “PANALLERGENI”, proteine condivise da fonti allergeniche anche tassonomicamente tra loro non correlate, responsabili di apparenti polisensibilizzazioni ai test eseguiti con estratti

11 COSA E’ L’ALLERGOLOGIA MOLECOLARE? Uso allergeni naturali purificati o prodotti con tecniche di DNA ricombinante Possibile la determinazione quantitativa degli anticorpi IgE per i singoli componenti allergenici che permette di valutare:  Il rischio di reazioni allergiche severe  Le reazioni crociate  La risposta all’immunoterapia specifica

12 “Devono essere evitati alcuni cibi?” “Possono essere reintrodotti nella dieta dopo che sono stati eliminati?” “Il mio bambino guarirà dall’allergia?” “C’è il rischio di reazioni severe?” NELLA PRATICA CLINICA…. Rende più agevole la risposta a domande frequenti

13 Bet v 1 Genere Specie Numero progressivo di isolamento Nomenclatura IUIS - OMS International Union of Immunological Societes, (Sottocomitato WHO per la Nomenclatura degli allergeni)

14 Components for resolving cross-reaction

15 STIMA DEL RISCHIO

16 Components for resolving cross-reaction

17 ALLERGIA MOLECOLARE PR-10 Pathogenesis-related proteins ALLERGIA MOLECOLARE PR-10 Pathogenesis-related proteins Altamente conservate (numerosi omologhi) proteine difensive prodotte in risposta a stimoli infettivi e abiotici (ormonali, traumatici e climatici) Generalmente molto labili (sensibili al calore e alla digestione) Sensibilizzazione primaria da inalanti (generalmente Fagales) Le PR-10 delle Rosacee causano in genere soltanto Sindrome Orale Allergica (SOA) Le PR-10 di soia, sedano, nocciola, carota e arachide, sono invece più stabili (protette da fosfolipidi) e possono causare SOA di insolita gravità o severe reazioni sistemiche

18 Bet v1betulla Mal d1mela Pru p1pesca Gly m4soia Ara h8arachide Cor a1nocciola Api g1.01 sedano Cuc m3melone Pru ar1albicocca Fra a1fragola Bet v1betulla Mal d1mela Pru p1pesca Gly m4soia Ara h8arachide Cor a1nocciola Api g1.01 sedano Cuc m3melone Pru ar1albicocca Fra a1fragola PR-10 RELATED PLANT FOOD ALLERGY

19 Sospetto allergia alla soia. C’è rischio di reazione severa? IgE specifiche per Soia + Gly m4 Soia Negativa Gly m4 Negativo Basso rischio di allergia alla soia Soia Pos\Neg Gly m4 Positivo La sensibilizzazione alla soia c’è e probabilmente è la causa dei sintomi clinici. Il risultato positivo al Gly m4 indica la relazione fra polline di betulla e allergia alla soia. C’ è rischio di reazione grave e\o sistemica Soia Positiva Gly m4 Negativo La sensibilizzazione alla soia c’è e probabilmente è la causa dei sintomi clinici. ulteriori approfondimenti: Il risultato positivo per la soia potrebbe essere dovuto a cross- reazioni, si raccomandano arachide, profilina

20 Common clinical practice Patient At 4 years Anamnesis SPT to soy SPT to birch Diagnosis Advice Anna Eczema, Wheeze+3 Soy and birch allergy Avoid soy Oliver Eczema, Wheeze+3 Soy and birch allergy Avoid soy

21 Using components in clinical practice Improved diagnoses and altered advice Patient At 4 years Anamnesis SPT to soy SPT to birch At 8 years sIgE to soy Gly m 4 Gly m 5 Gly m 6 sIgE to birch Diagnosis Advice Anna Eczema, Wheeze kU A /l 15 < Pollen-associated soy allergy Birch pollen allergy No need for total avoidance Avoid large amounts of unprocessed soy Oliver Eczema, Wheeze+3 24 kU A /l Genuine soy allergy Birch pollen allergy Strict soy avoidance

22 Components for resolving cross-reaction

23 Profiline Proteine citoplasmatiche presenti in quasi tutte le cellule eucariotiche Altamente conservate tra le varie specie di vegetali e alimenti: elevata cross-reattività non sempre clinicamente significativa Sindrome pollini-alimenti Allergeni labili (sensibili al calore e alla digestione), sensibilizzazione primaria per via inalatoria Causano in genere SOA

24 Bet v2 betulla Bet v2 betulla Mal d4 mela Mal d4 mela Pru p4 pesca Pru p4 pesca Ara h5 arachide Ara h5 arachide Hev b8 lattice Hev b8 lattice Api g4 sedano Api g4 sedano Cuc m2 melone Cuc m2 melone Fra a4 fragola Fra a4 fragola Bet v2 betulla Bet v2 betulla Mal d4 mela Mal d4 mela Pru p4 pesca Pru p4 pesca Ara h5 arachide Ara h5 arachide Hev b8 lattice Hev b8 lattice Api g4 sedano Api g4 sedano Cuc m2 melone Cuc m2 melone Fra a4 fragola Fra a4 fragola PROFILIN-RELATED PLANT FOOD ALLERGY

25 Components for resolving cross-reaction

26 LTP- Lipid Tranfer Protein Sono resistenti alla pepsina e al calore Possono causare reazioni sistemiche Nelle Rosacee presenti prevalentemente nella buccia. I pazienti sensibilizzati in genere hanno buona tolleranza per la frutta sbucciata

27 LTP Peculiarity PR-14 protein PR-14 protein Pepsin resistance Pepsin resistance Heat stability Heat stability Unpeeled fruits Unpeeled fruits Rosaceae Rosaceae Walnut, hazelnut Walnut, hazelnut OAS OAS Systemic reactions Systemic reactions –Asthma, urticaria, anaphylaxis Southern Europe Southern Europe

28 LTP Frutta fresca e nuts Rosaceae Rosaceae –Pera –Mela –Pesca –Ciliegia –Albicocca –Mandorla –Zucca Noci Noci Nocciole Nocciole Mais Mais Semi di sesamo Semi di sesamo Semi di girasole Semi di girasole Birra (da LTP dell’orzo, resistente alla fermentazione) Birra (da LTP dell’orzo, resistente alla fermentazione) Uva Uva Arachidi Arachidi Senape Senape Pru p 3 Cor a 8

29 Pru p3 pesca Pru p3 pesca Mal d3 mela Mal d3 mela Fra a3 fragola Fra a3 fragola Ara h9 arachide Ara h9 arachide Cor a 8 nocciola Cor a 8 nocciola Pru p3 pesca Pru p3 pesca Mal d3 mela Mal d3 mela Fra a3 fragola Fra a3 fragola Ara h9 arachide Ara h9 arachide Cor a 8 nocciola Cor a 8 nocciola LTP –RELATED PLANT FOOD ALLERGY

30 Fruit: neg Pru p 3: neg Very low risk for severe reactions to fruit Low risk for severe reactions to fruit Recommendations for further testing Risk grading: Pru p 1 (f419) Pru p 4 (f421) Fruit: pos Pru p 3: neg Fruit: pos Pru p 3: pos Risk for severe reactions to fruit Frutto specifico+ Pru p 3 (f420) Test with ImmunoCAP ® Allergen Sospetto di allergia alla frutta

31 Frutta fresca Sintomi: vomito, diarrea, sindrome orale allergica, orticaria, angioedema, anafilassi Allergeni termo- gastro stabili Allergeni termo- gastro labili Pru p 3 Pru p 1 Mal d 1 Mal d 3 Pru p 4 Pesca Mela Alimento sbucciato o valutare l’eliminazionedell’alimento Valutare l’assunzione dell’alimento cotto e in quantità limitate LTP rischio di reazioni gravi alla frutta Profilina ampia cross-reattività pollini-alimenti vegetali PR-10 rischio di reazioni locali alimento cotto spesso ben tollerato

32 Hazelnut: neg Cor a 8: neg Very low risk for severe reactions to hazelnut Risk for severe reactions to hazelnut Hazelnut: pos Cor a 8: pos High risk for severe reactions to hazelnut Recommendations for further testing: Risk grading: Cor a 1 (f428) CCD (Ro214) Hazelnut: pos Cor a 8: neg Sospetto di allergia alla nocciola Nocciola (f17) + Cor a 8 (f425) Test with ImmunoCAP ® Allergen

33 Frutta secca-Nocciola Sintomi: vomito, diarrea, sindrome orale allergica, orticaria, angioedema, anafilassi Allergeni termo- gastro stabili Allergeni termo- gastro labili Cor a 9 Cor a 14 Cor a 1 Cor a 8 Pru p 4 Rischio di anafilassi Valutare l’eliminazione dell’alimento Consigli dietetici e comportamentali LTPProfilina PR-10 Bet v 1 omologo rischio di reazioni locali Proteine di Deposito

34 Recommendations for further testing: Risk grading: Ara h 1 (f422) Ara h 3 (f424) Ara h 9 (f427) Ara h 8 (f352) Peanut: pos Ara h 2: neg Risk for severe reactions to peanut Peanut: neg Ara h 2: neg Recommendations for further testing: In geographical areas where birch is common, test for: Ara h 8 Low risk for severe reactions to peanut Peanut: pos Ara h 2: pos High risk for severe reactions to peanut Arachide (f13) + Ara h 2 (f423) Test with ImmunoCAP ® Allergen Sospetto di allergia alla arachide

35 Frutta secca-Arachidi Sintomi: vomito, diarrea, sindrome orale allergica, orticaria, angioedema, anafilassi Allergeni termo- gastro stabili Allergeni termo- gastro labili Ara h 9 Ara h 8 Ara h 2 Ara h 1 Ara h 3 Pru p 4 Rischio di anafilassi Valutare l’eliminazione dell’alimento Consigli dietetici e comportamentali LTP Profilina PR-10 Proteine di Deposito

36 Common clinical practice Patient At 6 years Anamnesis SPT to birch At 16 years Anamnesis SPT to peanut sIgE to peanut Diagnosis Advice Caroline, 16 years Rhinitis and conjunctivitis +4 Local reactions to peanuts kU A /l Peanut allergy Avoid peanuts Emma, 16 years Rhinitis and conjunctivitis +4 Local reactions to peanuts kU A /l Peanut allergy Avoid peanuts

37 Using components in clinical practice Patient Anamnesis Component testing Ara h 1 Ara h 2 Ara h 3 Ara h 8 Ara h 9 Diagnosis Advice Caroline, 16 years Local reaction to peanuts Pollen and peanut allergies kU A /l < < 0.1 Pollen-associated peanut allergy Suitable for re-introduction Emergency medication unnecessary Emma, 16 years Local reaction to peanuts Pollen and peanut allergies kU A /l < 0.1 Genuine peanut allergy Strict peanut avoidance Emergency medication necessary Improved diagnoses and altered advice

38 Uovo Ovoalbumina, Gal d2 Ovotransferrina (Conalbumina), Gal d3 Lisozima, Gal d4 –Allergene nascosto. Costituisce il 3,5% delle componenti dell'albume. Frequentemente utilizzato nelle preparazioni alimentari come conservante e additivo (formaggi a pasta dura), per prevenire la formazione di colonie batteriche. Il lisozima, rappresenta un rischio per i pazienti non essendo, di norma, segnalato adeguatamente tra gli ingredienti. Ovomucoide, Gal d1 –Gastro e termoresistente

39  L’ assenza di anticorpi IgE per l’ ovomucoide indica tolleranza all’ assunzione di uovo cotto  La presenza di anticorpi IgE per ovomucoide indica un aumentato rischio per persistente allergia all’uovo  L’ assenza di anticorpi IgE per l’ ovomucoide indica tolleranza all’ assunzione di uovo cotto  La presenza di anticorpi IgE per ovomucoide indica un aumentato rischio per persistente allergia all’uovo Ando H et al. Utility of ovomucoid-specific IgE concentrations in predicting symptomatic egg allergy J Allergy Clin Immunol 2008: 122;583-8

40 Sospetto di allergia all’ uovo IgE specifiche per Albume + Ovomucoide IgE specifiche per Albume e ovomucoide Negative Rischio basso di reazione all’ uovo IgE specifiche per albume = positive Ovomucoide = negativo Rischio di reazione all’ uovo L’ assenza di IgE per ovomucoide indica tolleranza all’ ingestione di uova cotte IgE specifiche per albume = positive Ovomucoide = positivo Aumentato rischio di persistente allergia all’ uovo

41 NOME: Marco ETA': 9 mesi “Deve essere evitato l'alimento?” Caso 3

42 Comparsa di orticaria dopo introduzione dell'uovo Uovo rimosso dalla dieta All’ImmunoCAP per il bianco d'uovo -> Albume 7 kU / l Marco dovrà iniziare l’asilo nido ed i genitori vorrebbero sapere se sarà a rischio di gravi reazioni nel caso venisse a contatto anche con piccole quantità di uovo È stata effettuata una valutazione del rischio di reazione allergica all'uovo Caso 3

43 ImmunoCAP ® Allergens and Allergen Components used Antibody level (kU/l) f1, Egg white3.2 f233, nGal d 1 Ovomucoid, Egg Ngal d 2 Ovoalbumin, Egg < Caso 3

44 Livello di anticorpi IgE al bianco d'uovo è sceso da 7 kU / l a 3 kU / l La rapida diminuizione indica che Marco ha una buona prognosi di sviluppare tolleranza all'uovo Assenza di anticorpi specifici per ovomucoide indica che Marco ha un basso rischio di avere reazione allergiche dopo l'assunzione accidentale di prodotti da forno (contenenti uovo cotto) E’ consigliato effettuare TPO per uovo cotto (pavesini, uovo sodo) e solo successivamente con uovo crudo o frittata Caso 3

45 % sensitization on milk-allergic patient Heat stability Bos d 4 α- lactalbumi n > 50% NoHide Bos d 5 β- lactoglobuli n 33%No Yes to Pasteurization Hide Bos d 8 CaseinYES Partially also to high Pasteurization (120° 20’) CheeseHide Milk

46

47 PROTEINE DI DEPOSITO Allergeni altamente stabili Allergeni altamente stabili Sensibilizzazione sia per via gastrointestinale Sensibilizzazione sia per via gastrointestinale che per via respiratoria che per via respiratoria Resistenti alla digestione e al calore Resistenti alla digestione e al calore (Ara h 1 22 volte > nell’arachide cotta) (Ara h 1 22 volte > nell’arachide cotta) Spesso associate a reazioni sistemiche Spesso associate a reazioni sistemiche 2S Albumine, Cupine (Vicilin-like e legumin-like proteins)

48

49 Dermatophagoides Invertebrati Crostacei, Mitili, Molluschi, Lumache, Anisakis Dermatophagoides Der p 1, Der p 2 Der p 10 TROPOMIOSINA Aragosta, granchio, gamberetto, scarafaggio, lumache, molluschi

50 Sospetto di allergia agli acari della polvere IgE specifiche per Der p1 Der p2 + Der p10 Der p1 Der p2 Der p10 Negativi Nessun rischio di allergia al Dermatophagoides pteronyssinus Der p1 Der p2 Positivi Der p10 Negativo Rischio di allergia con sintomi respiratori e cutanei Paziente monosensibile specie-specifico all’acaro indagato, rispondenza all’ immunoterapia Der p1 Der p2 Positivi Der p10 Positivo Rischio di allergia con sintomi non solo respiratori e cutanei, ma anche gastrointestinali, paziente potenzialmente polisensibile verso altri allergeni, efficacia dell’ immunoterapia compromessa Accertamenti consigliati: Pen a1, Lumaca, Blatella, Anisakis, Chironomus

51 Caso 4 NOME: Francesco ETA': 14 “Può essere sottoposto ad immunoterapia specifica?”

52 Rinite e congiuntivite lieve da 11 aa Negli ultimi anni peggioramento dei sintomi I sintomi sono più evidenti durante la tarda primavera e l'estate I sintomatici non hanno contribuito ad alleviare i sintomi Gli Skin Prick test (SPT) hanno rivelato risultati positivi per graminacee, olivo e parietaria Caso 4

53 ImmunoCAP ® Allergen Components used Antibody level (kU/l) g213, rPhl p 1, rPhl p 5b, Timothy12.5 g210, rPhl p 7, Timothy1.1 g212, rPhl p 12 Profilin, Timothy1.8 t224, nOle e 1, Olive<0.1 w211, rPar j 2 LTP, Wall pellitory17.4

54 Confermata positività per graminacee e parietaria Risultato negativo per Ole e 1 Questi risultati, in combinazione con la storia clinica, suggeriscono che la immunoterapia specifica per graminacee e parietaria sarebbe indicata Caso 4

55 Phl p 1 Phl p 5 Phl p 7 Phl p si Skin prick test positivo per estratti di graminacee e sintomi nel periodo di fioritura Singole componenti allergeniche Indicazione per ITS no

56 Bet v 1 Bet v 2 Bet v si Skin prick test positivo per estratti di betulacee/corilacee e sintomi nel periodo di fioritura Singole componenti allergeniche Indicazione per ITS no

57 ALLERGENI MOLECOLARI: A CHI, PERCHE’ E QUALE VANTAGGIO A CHI? Pazienti con estratto allergenico completo positivo Pazienti con estratto allergenico completo positivo Pazienti poli-sensibili (alimenti/inalanti) Pazienti poli-sensibili (alimenti/inalanti) Pazienti con pattern e sintomi non chiari Pazienti con pattern e sintomi non chiari Pazienti da sottoporre a challenge Pazienti da sottoporre a challenge Pazienti in follow-up prima della reintroduzione Pazienti in follow-up prima della reintroduzionedell’alimento PERCHE’? Fare una diagnosi differenziale Fare una diagnosi differenziale Definire il reale profilo di sensibilizzazione del paziente Definire il reale profilo di sensibilizzazione del paziente Evitare numerosi challenge orali Evitare numerosi challenge orali Formulare prognosi sulla severità della reazione Formulare prognosi sulla severità della reazione Migliore gestione del paziente Migliore gestione del paziente QUALEVANTAGGIO? Definizione della ITS Definizione della ITS Dare chiare indicazioni dietetiche Dare chiare indicazioni dietetiche Evitare inutili restrizioni alimentari Evitare inutili restrizioni alimentari Fornire indicazioni prognostiche Fornire indicazioni prognostiche Controllo farmacologico Controllo farmacologico

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