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Antibiotico-resistenza nei micobatteri Aspetti biotecnologici avanzati della diagnostica microbiologica e virologica Antibiotico-resistenza nei micobatteri.

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Presentazione sul tema: "Antibiotico-resistenza nei micobatteri Aspetti biotecnologici avanzati della diagnostica microbiologica e virologica Antibiotico-resistenza nei micobatteri."— Transcript della presentazione:

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2 Antibiotico-resistenza nei micobatteri Aspetti biotecnologici avanzati della diagnostica microbiologica e virologica Antibiotico-resistenza nei micobatteri Enrico Tortoli

3 I farmaci antitubercolari u ISONIAZIDE: battericida; attiva sui batteri in rapida moltiplicazione; probabilmente inibisce la sintesi degli ac. micolici u STREPTOMICINA: battericida; attiva solo sui batteri extracellulari in rapida moltiplicazione; blocca la sintesi proteica u ETAMBUTOLO: batteriostatico; attivo sui batteri in rapida moltiplicazione; probabilmente inibisce la sintesi della parete u RIFAMPICINA: battericida; attiva sia sui batteri in rapida moltiplicazione che su quelli intracellulari a crescita rallentata; inibisce la sintesi proteica u PIRAZINAMIDE: battericida (in associazione con l’isoniazide), a pH acido, sui batteri intracellulari; meccanismo di azione sconosciuto

4 Le resistenze del M. tuberculosis u sono dovute esclusivamente a mutazioni cromosomiche u mutazioni responsabili di resistenze si verificano spontaneamente con frequenza variabile, a seconda dei farmaci, fra 1/10 6 e 1/10 8 u la resistenza è il risultato della selezione dei mutanti resistenti, a seguito di mono-terapie o per difetto di compliance u l’uso di almeno due farmaci abbassa la probabilità di comparsa di resistenze a livelli inferiori al numero di bacilli normalmente presenti in una singola lesione ( UFC) u una resistenza si definisce primaria quando è già presente nel ceppo responsabile dell’infezione u una resistenza si definisce secondaria quando insorge durante la terapia

5 Mutazioni e resistenze u sono state trovate una o più mutazioni associate alla resistenza nei confronti dei singoli farmaci antitubercolari u per nessun farmaco esiste una mutazione associata al 100% delle resistenze u in molti casi il meccanismo di resistenza rimane oscuro

6 M. tuberculosis multiresistente u si parla di multiresistenza quando un ceppo di M. tuberculosis è resistente almeno ad isoniazide e rifampicina u non esiste una mutazione responsabile della multiresistenza che è invece il risultato della somma di mutazioni singole

7 Isoniazide I u è noto da tempo che, in molti ceppi isoniazide- resistenti, l’attività catalasica è ridotta o assente u tale difetto nella produzione di catalasi è il risultato di delezione o di mutazioni nel gene kat G (gene della catalasi-perossidasi) u circa il 60% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano alterazioni nel gene kat G u è stato ipotizzato che l’attività battericida dell’isoniazide si manifesti soltanto in seguito all’attivazione del farmaco operata dell’enzima catalasi-perossidasi

8 Isoniazide II u circa il 10% dei ceppi isoniazide-resistenti che presentano il gene kat G mutato hanno mutazioni anche nel gene ahp C codificante per una alchil-idroperossido reduttasi u circa il 20% dei ceppi isoniazide-resistenti (ma anche la maggioranza dei ceppi etionamide-resistenti) presentano mutazioni nel gene inh A che codifica per un enzima probabilmente coinvolto nella sintesi degli acidi micolici; il prodotto del gene inh A potrebbe essere il bersaglio dell’isoniazide u altri ipotizzano che il bersaglio dell’isoniazide sia la proteina, codificata dal gene kas A, che regola l’allungamento degli acidi grassi; mutazioni di tale gene sono presenti nel 15% dei ceppi isoniazide-resistenti

9 Streptomicina u alcuni ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rps L che codifica per la proteina ribosomiale S12 u altri ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rrs che codifica per il rRNA 16S u le suddette mutazioni, che si ritrovano complessivamente nel 70% circa dei ceppi resistenti, impediscono il legame dell’antibiotico al 16S rRNA e bloccano quindi il meccanismo con cui la streptomicina inibisce la sintesi proteica u nessuna mutazione risulta per il momento associata al rimanente 30% dei ceppi streptomicina-resistenti

10 Rifampicina u oltre il 97% dei ceppi resistenti alla rifampicina presentano mutazioni missense nel gene rpo B codificante per la subunità  della RNA-polimerasi u le alterazioni nella RNA-polimerasi, conseguenti alle mutazioni, non consentono il legame della rifampicina che non può quindi interferire nella trascrizione del rRNA

11 Etambutolo u il 70% circa dei ceppi resistenti all’etambutolo presentano mutazioni nel gene emb B, uno dei geni del locus emb che codifica per varie arabinosil-transferasi u le arabinosil-transferasi, che consentono la polimerizzazione dell’arabinano nei polisaccaridi della parete, potrebbero costituire il bersaglio dell’etambutolo

12 Pirazinamide u la pirazinamide viene trasformata, dalla pirazinamidasi, in acido pirazinoico che ne costituisce il principio attivo; la maggior parte dei ceppi resistenti alla pirazinamide mancano di pirazinamidasi u oltre l’80% dei ceppi pirazinamide- resistenti presentano mutazioni nel gene pnc A codificante per la pirazinamidasi

13 Metodi genotipici di ricerca delle resistenze u ricerca delle mutazioni associate con le resistenze l sequenziamento genico l Single Strand Conformation Polymorphism l Restriction Fragment Lenght Polymorphism l ibridizzazione in fase solida l formazione di eteroduplex u tutte le tecniche richiedono la preventiva amplificazione delle sequenze in cui si ricercano le mutazioni

14 SSCP u denaturazione termica della sequenza precedentemente amplificata u i filamenti a catena singola si ripiegano spontaneamente assumendo una conformazione (e conseguentemente una mobilità elettroforetica) variabile in conseguenza della presenza di mutazioni u separazione elettroforetica e identificazione delle mutazioni in base alla posizione delle bande u la tecnica è stata messa a punto, anche in automazione, per la ricerca della resistenza alla rifampicina ma è utilizzabile anche per altri farmaci

15 INNO-LiPA Rif-TB u amplificazione del gene rpo B del M. tuberculosis, codificante per la subunità  della RNA polimerasi u ibridizzazione dell'eventuale amplificato con sonde, immobilizzate su una striscia di nitrocellulosa, specifiche per: l il gene rpo B l le 5 subunità, di tale gene, più frequentemente sedi delle mutazioni che determinano la comparsa di resistenze alla rifampicina l 4 subunità presentanti mutazioni, causa di rifampicino-resistenza u rilevamento dell'eventuale ibridizzazione mediante aggiunta di avidina-fosfatasi e substrato cromogeno (i primer utilizzati per l'amplificazione sono marcati con biotina) u riconoscimento del M. tuberculosis dalla presenza della banda corrispondente al gene rpo B u riconoscimento della resistenza alla rifampicina dalla mancanza di una delle bande corrispondenti alle subunità del gene non mutato e/o dalla presenza di una banda corrispondente ad una mutazione

16 RFLP u la comparsa di una mutazione può determinare la perdita (o l’insorgenza) di un sito di restrizione u sottoponendo la sequenza preventivamente amplificata, all’azione di uno specifico enzima di restrizione si ottengono pattern diversi a seconda che in essa siano o meno presenti mutazioni

17 RFLP

18 Formazione di eteroduplex u amplificazione di una sequenza al cui interno si ricercano le mutazioni u combinazione del prodotto di amplificazione con quello ottenuto da un ceppo sensibile u denaturazione termica u formazione spontanea di DNA a doppia elica u separazione elettroforetica u la presenza di più bande è indice di mutazione, infatti gli ibridi formati da filamenti provenienti da un ceppo sensibile ed uno resistente (eteroduplex), hanno mobilità elettroforetica diversa da quella delle doppie eliche omogenee (sensibile-sensibile e resistente-resistente)

19 Conclusioni u i metodi genotipici sono rapidi, permettono infatti di eliminare i passaggi della coltura e del test di sensibilità u la negatività di un test genotipico non permette di escludere la resistenza, sono infatti ancora numerose le resistenze fenotipiche per le quali non è nota l’associazione ad alcuna mutazione; la conferma con il test di sensibilità in vitro è quindi indispensabile u la corrispondenza, ad una singola resistenza fenotipica, di più meccanismi genetici rende estremamente complessa l’esecuzione dei test genotipici u l’esecuzione dei test genetici direttamente sul materiale clinico richiede solitamente una doppia amplificazione (PCR nested )


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