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1 Flusso dellinformazione genetica. 2 Trascrizione dellRNA (1) RNA polimerasi diretta dal DNA La trascrizione è catalizzata dallaRNA polimerasi diretta.

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1 1 Flusso dellinformazione genetica

2 2 Trascrizione dellRNA (1) RNA polimerasi diretta dal DNA La trascrizione è catalizzata dallaRNA polimerasi diretta dal DNA con un meccanismo molto simile alla DNA polimerasi Differenze con la DNA polimerasi: non ha bisogno del primer non ha una efficace attività di proofreading Topoisomerasi

3 3 Trascrizione dellRNA (2) Per convenzione la sequenza di riferimento utilizzata per indicare una gene è quella non-stampo (detta impropriamente codificante). In realtà la catena che codifica per lRNA è quella che va in direzione 53 In alcuni virus (es: adenovirus) entrambe la catene codificano proteine

4 4 Trascrizione dellRNA (3) Il corretto posizionamento dalla RNA polimerasi sulla catena sequenze consenso promotori stampo è guidato da specifiche sequenze consenso denominate promotori Promotori eucariotici Promotori procariotici

5 5 Trascrizione dellRNA nei procarioti (1) Le fasi della trascrizione (E. coli) Fase di inizio Inizio della trascrizione; dopo 8-9 nucleotidi sintetizzati viene rilasciata la subunità sigma (. Prosecuzione della sintesi dellRNA Il sito di inizio della trascrizione è finemente regolato ( vedi lac operon) Fase di legame Interazione RNA polimerasi con il promotore (complesso chiuso) Svolgimento del DNA da -10 a + 3 o +5 (complesso aperto)

6 6 Fase di terminazione Trascrizione dellRNA nei procarioti (2) indipendente ibrido DNA-RNA instabile Formazione nella regione terminale di un ibrido DNA-RNA instabile per la presenza di molte coppie A=U struttura a forcina Formazione di una struttura a forcina per la presenza di nucleotidi complementari che destabilizzano definitivamente librido DNA-RNA con conseguente rilascio dellmRNA trascritto dipendente proteina Presenza di una proteina con attività elicasica che promuove il distacco dell RNA dal DNA

7 7 Trascrizione dellRNA negli eucarioti La trascrizione negli eucarioti è molto complessa e ancora non ben chiarita Tre RNA polimerasi RNA polimerasi I (Pol I): sintesi pre-rRNA RNA polimerasi II (Pol II): sintesi mRNA 12 subunità 6 fattori di inizio 4 fattori di allungamento RNA polimerasi III (Pol III): sintesi tRNA, rRNA 5S

8 8 Inibitori della trascrizione antibiotici Lactinomicina D e lacridinasono due antibiotici che agiscono sia nei batteri che negli eucarioti. La parte colorata planare si lega tra due successivi appaiamenti GC del DNA provocando una deformazione che non permette dalla RNA polimerasi di trascrivere. L -amanitina, presente nel fungo Amanita phalloides, inibisce fortemente la Pol II causando la morte degli organismi animali. La rinfamicina si lega alla RNA polimerasi batterica impedendo la trascrizione(antibatterico)

9 9 Trascrizione procarioti & eucarioti (1)

10 10 Trascrizione procarioti & eucarioti (2) mRNA procariotico mRNA eucariotico Prevalentemente policistronico Prevalentemente monocistronico

11 11 Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (1)

12 12 Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (2) Incappucciamento dellmRNA

13 13 Poliadenilazione (inserimento della coda) AAUAAA Formazione del legame tra la sequenza segnale ( AAUAAA ) e il complesso enzimatico Scissione in una posizione tra 11 a 30 nucleotidi da AAUAAA Sintesi della coda poli(A) lunga da 80 a 250 nucleotidi Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (3)

14 14 Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (4)

15 15 Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (5)

16 16 Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (6)

17 17 Modificazioni post-trascrizionali del rRNA

18 18 Modificazioni post-trascrizionali del tRNA

19 19 Attività catalitica dellRNA (Ribozimi) Lesistenza di RNA catalitici e linterconversione di RNA a DNA (vedi retrovirus con trascrittasi inversa) hanno portato allipotesi che la prima fase dellevoluzione biologica sia stata la comparsa dellRNA (o di un polimero equivalente) in grado di catalizzare la sua stessa replicazione Bibliografia: Bittker,J.A., et. al. Curr. Opin.Chem.Biol. 6, (2002) Johston, W.K, et al. Science, 292, (2001) Joyce, G. E. Nature, 418, (2002) Wilson, D.S. et al. Annu.Rev.Biochem. 68, (1999) Yarus, M. Ann. Rev. Genet, 36, (2002)

20 20 Sintesi RNA e DNA, dipendente dallRNA Espansione del dogma centrale della biologia per includere la sintesi RNA- dipendente di RNA e DNA

21 21 Retrovirus & trascrittasi inversa (1) I retrovirus hanno una DNA polimerasi dipendente dallRNA (trascrittasi inversa) che produce DNA a partire dal loro RNA RNA virale Ibrido RNA-DNA cDNA (DNA complementare) trascrittasi inversa Integrazione nel DNA della cellula ospite integrasi

22 Le trascrittasi inverse sono diventate importanti nel clonaggio molecolare in quanto rendono possibile la sintesi in laboratorio a partire dallRNA (DNA complementare, cDNA) 22 Retrovirus & trascrittasi inversa (2) Le trascrittasi inverse non hanno attività esonucleasica 35 con funzione proofreading Ciò comporta una frequenza di errore di 1 ogni nucleotidi aggiunti con conseguente continua mutazione del virus

23 23 Retrovirus & cancro Genoma del sarcoma di Rous (o aviario) oncogeni In seguito a ricombinazione con il genoma di un retrovirus e successive mutazioni, si possono generare degli oncogeni (evento raro) codificanti per proteine che provocano una incontrollata riproduzione cellulare (tumore)

24 24 Retrovirus & AIDS Genoma dellHIV geni sovrapposti Piccolo genoma (9,7x10 -6 nucleotidi) che grazie a meccanismi di splicing alternativo causano la produzione di molte proteine diverse

25 Analogo Chemioterapia con analoghi purinici e pirimidinici Lanalogo viene somministrato come base libera o nucleoside pro-farmaco (pro-farmaco) perche il nucleotide farmacologicamente attivo essendo carico non riesce ad attraversare la membrana biologica

26 RNA DNA CTP dUDP dCTP CMPUMP UDP UTP dCMP dCDP dUTP dUMP dTMP dAZTMP dTDP dAZTDP dTTP dAZTTP CDP CRURCdRUdR TdR AZTdR U T Membrana cellulare H2OH2ONH 3 H2OH2O de novo AZT AZT 3-azido-2,3-dideossi-timidina (AZT) Azione farmacologica dellAZT O HO-CH 2 H H H H H Timina N=N=N


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