Analisi isotopica. Tecniche isotopiche Le tecniche isotopiche sono state sviluppate allinizio degli anni 80 in Francia (Università di Nantes) e hanno.

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1 Analisi isotopica

2 Tecniche isotopiche Le tecniche isotopiche sono state sviluppate allinizio degli anni 80 in Francia (Università di Nantes) e hanno avuto grande applicazione in tutti i campi della ricerca scientifica. Attualmente sono in grande espansione grazie allintroduzione di strumentazioni molto sofisticate

3 Isotopo ( + ) = stesso posto La quantificazione del rapporto da due isotopi dello stesso elemento ha potenzialità notevoli nello stabilire se due oggetti chimicamente simili hanno provenienza diversa, in relazione alla differenza delle materie prime. Fenomeni di vario tipo influenzano la distribuzione isotopica degli elementi nelle materie prime, determinando differenze nei prodotti finali che possono essere rivelate dalle tecniche di analisi isotopica Sono di particolare interesse gli isotopi stabili, cioè non artificiali. La tecnica che li determina si chiama Stable Isotope Ratio Analysis (SIRA)

4 Applicazioni dellanalisi isotopica Misura della temperatura nel passatoMisura della temperatura nel passato Determinazione dellorigine di acqua, roccie e materia organicaDeterminazione dellorigine di acqua, roccie e materia organica Determinazione dellorigine di droghe, esplosivi o altri materiali di interesse forenseDeterminazione dellorigine di droghe, esplosivi o altri materiali di interesse forense Studi di processoStudi di processo Determinazione dellorigine di prodotti alimentariDeterminazione dellorigine di prodotti alimentari

5 Applicazioni in campo alimentare Lanalisi degli isotopi stabili è molto importante soprattutto negli studi di autenticità degli alimenti. Essa, sulla base dei differenti rapporto isotopici, permette di riconoscere molecole, presenti in alimenti, aventi la stessa struttura chimica ma provenienti da materie prime diverse o elaborate con processi diversi, per esempio per sintesi biologica o industriale Si possono distinguere: gli aromi naturali (es. vanillina) da quelli di sintesi gli aromi naturali (es. vanillina) da quelli di sintesi lacido acetico proveniente dalla fermentazione acetica da quello ottenuto industrialmente lacido acetico proveniente dalla fermentazione acetica da quello ottenuto industrialmente i salmoni selvatici da quelli di allevamento (in base ad un lipide caratteristico) i salmoni selvatici da quelli di allevamento (in base ad un lipide caratteristico) laggiunta di zuccheri diversi da quelli presenti naturalmente laggiunta di zuccheri diversi da quelli presenti naturalmente lannacquamento del latte lannacquamento del latte la provenienza geografica di alimenti la provenienza geografica di alimenti

6 Discriminazione di prodotti di differente origine biosintetica e geografica biosintetica e geografica Controllo di frodi alimentari Applicazioni già regolamentate per vino, aceti, succhi di frutta e miele vino, aceti, succhi di frutta e miele Studi per nuove applicazioni in olio, vanillina, caffeina, vegetali, carne, latte e formaggio Tipicizzazione di alimenti di origine controllata (es.DOP, IGP, certificazioni di tipo biologico) certificazioni di tipo biologico) Controllo della composizione Controllo della composizione della dieta animale Aggiunta di zucchero esogeno Annacquamento Grado di utilizzo di mangime nellalimentazione

7 Isotopi di uno stesso elemento hanno uguale numero di protoni (e quindi di elettroni) ma diverso numero di neutroni hanno lo stesso numero atomico (Z) ma un diverso numero di massa (A) massa differente Gli isotopi di uno stesso elemento hanno quindi proprietà chimiche simili, in ragione dello stesso numero di protoni, ma proprietà fisiche diverse, in ragione della massa differente. Tutti gli elementi (tranne 12) esistono in almeno due forme isotopiche Gli isotopi

8 Esempio: lidrogeno Idrogeno o protio 1 elettrone (rosso) 1 protone (verde) Deuterio 1 elettrone (rosso) 1 protone (verde) 1 neutrone (blu) Tritio 1 elettrone (rosso) 1 protone (verde) 2 neutroni (blu) Il Tritio è artificiale e quindi non di interesse in questa tecnica che si basa sui soli isotopi stabili

9 Distribuzioni isotopiche La distribuzione isotopica stabile (non considerando, cioè, gli isotopi artificiali) degli elementi dipende strettamente dallorigine e dallevoluzione biogeochimica dei composti di cui fanno parte. Quindi due composti aventi la stessa formula possono avere differente composizione isotopica se la loro origine e/o la loro storia sono diverse Le proporzioni degli isotopi stabili nei vari composti sono approssimativamente quelle medie esistenti sulla terra, tuttavia le piccole deviazioni dalla media sono la chiave per differenziare un campione dallaltro Nellelenco seguente sono indicate le distribuzioni medie di alcuni elementi; le cifre indicate in rosso sono quelle che contengono linformazione discriminante 1 H:99.984% 2 H o D: 0.01557% 1 H:99.984% 2 H o D: 0.01557% 12 C:98.89 % 13 C: 1.11140% 12 C:98.89 % 13 C: 1.11140% 14 N:99.64% 15 N: 0.36630% 14 N:99.64% 15 N: 0.36630% 16 O:99.76% 17 O: 0.04% 18 O: 0.20004% 16 O:99.76% 17 O: 0.04% 18 O: 0.20004% 32 S:95.02% 33 S: 0.75% 34 S: 4.21500% 36 S:0.02% 32 S:95.02% 33 S: 0.75% 34 S: 4.21500% 36 S:0.02%

10 Per poter mettere in risalto le infinitesime differenze tra le distribuzioni isotopiche di un elemento in due campioni diversi è necessaria una tecnica analitica in grado di misurare masse atomiche e molecolari con grandissima accuratezza e precisione. Attualmente due tecniche sono in grado di soddisfare questi requisiti: La maggior parte delle analisi isotopiche è effettuata mediante spettrometria di massa la spettrometria di massa, utilizzata per qualsiasi elemento la spettrometria di massa, utilizzata per qualsiasi elemento la risonanza magnetica nucleare, utilizzata soprattutto per la determinazione degli isotopi dellidrogeno (misura del rapporto 2 H/ 1 H) la risonanza magnetica nucleare, utilizzata soprattutto per la determinazione degli isotopi dellidrogeno (misura del rapporto 2 H/ 1 H)

11 Rapporti isotopici Il parametro su cui si basa lanalisi isotopica è il rapporto isotopico, cioè labbondanza relativa di due isotopi dello stesso elemento. Per convenzione, il rapporto isotopico si indica sempre ponendo a numeratore un isotopo più pesante e a denominatore un isotopo più leggero 2 H/ 1 H 13 C/ 12 C 15 N/ 14 N 18 O/ 16 O 18 O/ 17 O 17 O/ 16 O 34 S/ 32 S 34 S/ 33 S 36 S/ 34 S ecc. ecc. I rapporti isotopici più importanti in campo diagnostico

12 I rapporti isotopici sono usualmente espressi in termini di valori () che esprimono le deviazioni, in parti per mille, da un materiale standard di riferimento: o lespressione equivalente: dove R = rapporto massa isotopo pesante/massa isotopo leggero (es. 18 O/ 16 O) Espressione dei risultati X > 0 indica un arricchimento dellisotopo pesante nel campione rispetto allo standard X > 0 indica un arricchimento dellisotopo pesante nel campione rispetto allo standard X < 0 indica un impoverimento dellisotopo pesante o un arricchimento dellisotopo leggero rispetto allo standard X < 0 indica un impoverimento dellisotopo pesante o un arricchimento dellisotopo leggero rispetto allo standard

13 1.04 1.06 1.08 1.1 1.12 1.14 1.16 1.18 -50-40-30-20-1001020304050 13 C 13 C Atomi 13 C (%) 0.1 = 0.00011% Relazione C - % atomi 13 C

14 Relazione N - % atomi 15 N 0.34 0.35 0.36 0.37 0.38 0.39 -50-40-30-20-1001020304050 N N Atomi 15 N (%) 0.1 = 0.00004%

15 Elemento Isotopi stabili Abbondanza naturale media (%) Valori dei rapporti standard Standard di riferimento internazionale Idrogeno 1H2H1H2H1H2H1H2H 99.985 0.015 2 H/ 1 H = 0.000316 SMOW (Standard Mean Ocean Water) Carbonio 12 C 13 C 98.892 1.108 13 C/ 12 C = 0.0112372 PDB (Pee Dee Belemnite) Carbonato di calcio fossile Azoto 14 N 15 N 99.6337 0.3663 15 N/ 14 N = 0.007353 AIR (Azoto dellaria) Ossigeno 16 O 18 O 99.7587 0.2039 18 O/ 16 O = 0.0039948 SMOW (Standard Mean Ocean Water) Zolfo 32 S 34 S 95.02 4.22 34 S/ 32 S = 0.0450045 CDT (Canyon Diablo Troilite) Standard di riferimento N.B. la distribuzione isotopica nei materiali standard di riferimento è differente da quella naturale media!

16 La possibilità di differenziare due campioni in base allanalisi isotopica è legata al fenomeno di frazionamento isotopico che avviene nelle materie prime, ovvero nella deviazione dalla distribuzione isotopica naturale degli elementi in conseguenza a fenomeni biogeochimici naturali o artificiali Si noti che le variazioni sono misurate rispetto ad un materiale standard con distribuzione diversa da quella naturale La variazione naturale di abbondanza isotopica è conseguenza delle diverse proprietà chimico-fisiche degli isotopi di uno stesso elemento Frazionamento isotopico EFFETTO CINETICO Differente velocità di reazione EFFETTO TERMODINAMICO Differente energia libera Massadifferente

17 Un esempio: il vino Per valutare le cause e levoluzione del frazionamento in relazione al ciclo produttivo degli alimenti, prendiamo in considerazione un caso particolarmente significativo: il vino. In esso sono presenti in grande quantità gli elementi di maggior interesse nei processi biosintetici: idrogeno, carbonio e ossigeno. Questi elementi formano due molecole fondamentali nella vita delle piante: acqua e anidride carbonica H, C, O H 2 O, CO 2

18 Frazionamento nellacqua Lacqua tende per natura ad evaporare con una reazione di equilibrio regolata dalla temperatura: H 2 18 O (g) + H 2 16 O (l) H 2 16 O (g) + H 2 18 O (l) Allequilibrio, lacqua in fase vapore si è arricchita in 16 O ( 18 O 0) La costante di equlibrio tra fase liquida e fase vapore per l'ossigeno sarà espressa come segue:

19 Ciclo dellacqua Durante i fenomeni di evaporazione e precipitazione si verifica frazionamento isotopico dellossigeno Lentità del frazionamento dipende dalla temperatura, la quantità di umidità rimossa, il tipo di condensazione (conversione in acqua o in ghiaccio) e altri fattori climatici e geografici

20 Effetto della temperatura Essendo il frazionamento dipendente dalla temperatura, dal punto di vista geografico il valore di 18 O diminuisce: allaumentare della latitudine allaumentare della latitudine allaumentare dellaltitudine allaumentare dellaltitudine

21 Frazionamento nei vegetali Nel ciclo vegetativo delle piante, lassorbimento di acqua dal terreno e il processo di traspirazione, caratteristico di ciascuna specie, causano anchessi un arricchimento di isotopi pesanti ( 2 H e 18 O), in dipendenza dalla specie vegetale e dalle condizioni climatiche (climi freddi, piovosi o caldo- aridi) Quindi, in dipendenza di questi parametri, le piante hanno a disposizione acqua "isotopicamente" diversa, da utilizzare nella fotosintesi

22 Esempi di frazionamento 18 O/ 16 O

23 Ciclo della CO 2 L'anidride carbonica, essendo allo stato gassoso, subisce il processo di frazionamento per transizione di fase in modo molto meno sensibile, anche se dai dati acquisiti nel corso degli anni si è potuto osservare che un lieve frazionamento è dovuto alla latitudine, probabilmente per fattori climatici quali la temperatura Nella tabella sono riportati i valori dei rapporti isotopici di idrogeno, carbonio e ossigeno misurati in vini provenienti dalle regioni italiane per lannata 1994 D/H e 13 C/ 12 C misurati nelletanoloD/H e 13 C/ 12 C misurati nelletanolo 18 O/ 16 O misurato nellacqua 18 O/ 16 O misurato nellacqua

24 Frazionamento biosintetico Il ciclo della fotosintesi con la produzione di glucosio determina ancora una modifica isotopica per quanto riguarda il contenuto in deuterio dell'acqua, ma diventa estremamente selettivo per quanto riguarda l'anidride carbonica e quindi il rapporto isotopico 13 C/ 12 C. Il cammino fotosintetico per la fissazione della CO 2 ne è infatti la principale fonte di variazione. Le piante incorporano CO 2 secondo tre meccanismi biosintetici: Il meccanismo C3 provoca un frazionamento del carbonio molto più elevato rispetto agli altri due meccanismi. Gli isotopi più pesanti, in questo caso il 13 C, sono cineticamente meno favoriti e quindi più lenti a reagire, per cui, maggiore è il numero dei passaggi di reazione e tanto più sarà selettivo il processo il ciclo di Calvin o C3 (es. vite e barbabietola)il ciclo di Calvin o C3 (es. vite e barbabietola) il ciclo di Hatch-Slack o C4 (es. canna e mais)il ciclo di Hatch-Slack o C4 (es. canna e mais) il ciclo noto come Crassulean Acid Methabolism o CAM, meno comuneil ciclo noto come Crassulean Acid Methabolism o CAM, meno comune

25 Frazionamento di 12 C e 13 C

26 Al termine del ciclo sintetico si producono molecole di glucosio che hanno un contenuto isotopico correlato a quello dell'acqua e dell'anidride carbonica impiegate, nonché del ciclo fotosintetico seguito La successiva fermentazione alcolica che trasforma il glucosio ad alcol etilico modifica solo in parte i rapporti isotopici (maggiormente per D/H), per cui essi si ritrovano nelle molecole di alcol etilico prodotte

27 Parametri D/H nei vegetali PARAMETRI CHE INFLUENZANO IL RAPPORTO D/H NEI COMPOSTI VEGETALI Composizione isotopica dell'acqua di falda effetto latitudine effetto latitudine ciclo planetario dell'acqua effetto geografico - continentale effetto geografico - continentale effetto altitudine effetto altitudine Evapotraspirazione fogliare effetto climatico (temperatura - umidità relativa) effetto climatico (temperatura - umidità relativa) bietola, fragola (91-93 ppm) piante a ciclo C 3 ( 96 ÷ 108 ppm ) mele, pere, ciliegie ( 95 ÷ 101 ppm ) Provenienza vegetale dellalcol vite ( 98 ÷ 108 ppm ) piante a ciclo C 4 (canna da zucchero, mais) (110-115 ppm) piante a ciclo C 4 (canna da zucchero, mais) (110-115 ppm)

28 Esempi di frazionamento 2 D/ 1 H

29 (N 2, NO x ) (N 2, NO x ) Denitrificazione Residui organici (+10/+30 ) Ammonio (NH 4 + ) Materiale organico (R-NH 2 ) Nitrati (NO 3 - ) Consumo da parte della pianta Minerali Lisciviamento Precipitazioni Fissazione N 2 atmosferico (0) -3/+1 -0,5 ±1 Nitrificazione -12/-29 Ciclo dellazoto nei composti vegetali

30 Spettrometria di massa La spettrometria di massa è una tecnica utilizzata per separare molecole cariche, cioè ioni, in base alla loro massa o, più correttamente, in base al rapporto massa/carica. Quindi è una tecnica in grado di distinguere isotopi dello stesso elemento e di calcolarne i rapporti isotopici I rapporti isotopici degli elementi leggeri (H, O, C, N, S) sono misurati con la tecnica Isotope Ratio Mass Spectrometry (IRMS) mediante trasformazione in gas puri Per gli elementi pesanti (Pb, Sr) sono invece utilizzate la tecnica Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry (ICP-MS) e la tecnica Thermal Ionization Mass Spectrometry (TIMS) nelle quali il campione è trasformato in atomi e ioni

31 Isotope Ratio Mass Spectrometry Nella tecnica Isotope Ratio Mass Spectrometer (IRMS) si utilizza uno spettrometro di massa avente sensibilità minore ma capacità di risoluzione e precisione assai più elevata rispetto agli spettrometri convenzionali Lo spettrometro IRMS comprende tre parti fondamentali: una sorgente di ioni, un analizzatore di massa e un contatore di ioni La sorgente di ioni ha lo scopo di ionizzare le molecole del campione (generalmente introdotto in forma gassosa) per interazione con un fascio di elettroni che causa la formazione di ioni positivi dai composti del campione La sorgente di ioni ha lo scopo di ionizzare le molecole del campione (generalmente introdotto in forma gassosa) per interazione con un fascio di elettroni che causa la formazione di ioni positivi dai composti del campione Gli ioni positivi sono poi accelerati e condotti allinterno dellanalizzatore di massa, ovvero un campo elettromagnetico dove gli ioni sono separati a seconda del loro rapporto massa/carica (m/z) Gli ioni positivi sono poi accelerati e condotti allinterno dellanalizzatore di massa, ovvero un campo elettromagnetico dove gli ioni sono separati a seconda del loro rapporto massa/carica (m/z) Infine gli ioni sono raccolti e contati da un rivelatore Infine gli ioni sono raccolti e contati da un rivelatore

32 Principio di funzionamento Sorgente ionica Magnete m/z 2 (H 2 ) m/z 3 (HD) m/z 4 (D 2 )

33 Preparazione del campione Per effettuare la misura con la IRMS è necessario convertire lelemento di interesse nel campione in forma gassosa Esempio: determinazione del rapporto 13 C/ 12 C nel vino (alcol etilico) Estrazione e purificazione del composto di interesse Trasformazione del composto di interesse in gas Separazione e quantificazione con spettrometria di massa Estrazione alcol etilico dal vino Ossidazione e trasformazione dellalcol in CO 2 Quantificazione del rapporto 13 CO 2 / 12 CO 2

34 Cosa si misura effettivamente? Idrogeno H 2 : masse 2, 3 Idrogeno H 2 : masse 2, 3 2 = 1 H 1 H 2 = 1 H 1 H 3 = 1 H 2 D 3 = 1 H 2 D Carbonio ossidazione con O 2 CO 2 : masse 44, 45, 46 Carbonio ossidazione con O 2 CO 2 : masse 44, 45, 46 44 = 12 C 16 O 16 O 44 = 12 C 16 O 16 O 45 = 13 C 16 O 16 O e 12 C 16 O 17 O 45 = 13 C 16 O 16 O e 12 C 16 O 17 O 46 = 13 C 16 O 17 O e 12 C 17 O 17 O 46 = 13 C 16 O 17 O e 12 C 17 O 17 O Azoto N 2: masse 28, 29, 30 Azoto N 2: masse 28, 29, 30 28 = 14 N 14 N 28 = 14 N 14 N 29 = 14 N 15 N 29 = 14 N 15 N 30 = 15 N 15 N 30 = 15 N 15 N Zolfo ossidazione con O 2 SO 2: masse 64, 66 Zolfo ossidazione con O 2 SO 2: masse 64, 66 64 = 32 S 16 O 16 O 64 = 32 S 16 O 16 O 66 = 34 S 16 O 16 O 66 = 34 S 16 O 16 O

35 Specie misurate

36 Il dispositivo Dual Inlet permette di avere un confronto in tempo reale tra il campione analizzato e un materiale di riferimento Il gas formato dal trattamento del campione è immesso nellIRMS in alternanza ad un gas standard avente distribuzione isotopica ben definita; dal confronto è possibile misurare con accuratezza i rapporti isotopici nel campione Dual Inlet

37

38 Nel metodo Continuous Flow la preparazione del campione e la successiva analisi avvengono in un flusso continuo di gas elio. I passaggi sono automatizzati e prevedono combustione, riduzione e pirolisi in presenza di catalizzatori Tecnica Continuous Flow Dual Inlet

39 Lutilizzo di un gascromatografo permette di avere la separazione dei composti contenenti lelemento di interesse preliminare allanalisi di massa Interfacciamento con GC

40 La separazione gascromatografica fornisce lidentificazione delle sostanze (What?), mentre lanalisi IRMS fornisce informazioni sulla loro origine (Where? Where from?)

41 Nelle figure sono riportati due esempi di spettrometri di massa per analisi IRMS. Si tratta generalmente di strumenti di costo elevato, accessibile soltanto a laboratori di analisi molto avanzati Esempi di strumenti Molti spettrometri per analisi IRMS sono dotati anche di un gascromatografo per la separazione di specie organiche preliminare allanalisi degli isotopi

42 La ricerca di sofisticazioni in enologia si può effettuare con le tecniche isotopiche: Inoltre si può stabilire con discreta approssimazione la zona di provenienza di un vino Per chiarire limportanza dellintroduzione di queste tecniche va considerato che prima del loro avvento, i metodi esistenti per scoprire le sofisticazioni erano abbastanza inefficaci. Laddizione di saccarosio ai mosti genera rapidamente per idrolisi fruttosio e glucosio, zuccheri già presenti nelluva e quindi indistinguibili: Le molecole di fruttosio e glucosio introdotte fraudolentemente hanno però una traccia della loro origine, nascosta nella distribuzione isotopica degli elementi che li costituiscono (carbonio, idrogeno e ossigeno). Questa distribuzione è diversa a seconda dellorigine del saccarosio o del trattamento cui è stato sottoposto Lanalisi isotopica in enologia sofisticazione del vino per aggiunta di zuccheri diversi da quelli presenti nelluva (bietola, canna, mais), una pratica illecita in Italia sofisticazione del vino per aggiunta di zuccheri diversi da quelli presenti nelluva (bietola, canna, mais), una pratica illecita in Italia annacquamento del vino annacquamento del vino OCH2OHH OH HOH H HO HH O HOH OHH CH 2 OH HOCH 2 H O O CH 2 OH H OH HOH H HO HH OH O HOH OHH CH 2 OH H HOCH 2 OH +

43 In definitiva, i fenomeni naturali che si succedono durante il ciclo degli elementi C, H e O sono tali da permettere una differenziazione del prodotto finale. In base al tipo di rapporto isotopico in considerazione, si possono avere le informazioni descritte nella tabella Informazioni fornite dai r.i.

44 Antisofisticazioni La contraffazione dovuta alladdizione di zuccheri di canna o bietola è relativamente semplice da identificare, in base al rapporto isotopico D/H. Il valore dovuto allo zucchero presente naturalmente nel vino è 98- 102 ppm; valori superiori indicano addizione di zucchero di canna e mais, mentre valori inferiori indicano addizione di zucchero di bietola. La misura è effettuata normalmente con la tecnica di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) L'aggiunta di una miscela equivalente di zuccheri di canna e bietola non modifica il rapporto isotopico del deuterio, ma è comunque evidenziabile dall'aumentare del rapporto isotopico 13 C/ 12 C Lannacquamento del vino è rivelabile in base al rapporto 18 O/ 16 O: infatti lacqua esterna ha un contenuto in 18 O minore dell'acqua del vino e farà diminuire di conseguenza il valore del rapporto isotopico misurato. La misura è effettuata normalmente con una tecnica di Spettrometria di Massa

45 Le potenzialità dellanalisi isotopica sono tali che nel corso degli ultimi anni alcuni metodi di analisi sono diventati ufficiali al livello nazionale ed europeo Metodi ufficiali di analisi Il Regolamento CEE 2676/90 (determinazione dei metodi comunitari di analisi da utilizzare nel settore del vino) prevede la rivelazione dellaumento del titolo alcolimetrico di mosti e vini, ottenuto con addizione fraudolenta di saccarosio, mediante analisi NMR del rapporto D/H Il Regolamento CEE 2676/90 (determinazione dei metodi comunitari di analisi da utilizzare nel settore del vino) prevede la rivelazione dellaumento del titolo alcolimetrico di mosti e vini, ottenuto con addizione fraudolenta di saccarosio, mediante analisi NMR del rapporto D/H Il Regolamento CEE 822/97 (modifica del Regolamento precedente) prevede la determinazione del rapporto isotopico 18 O/ 16 O dellacqua contenuta nei vini per identificare il possibile fraudolento annacquamento di un vino Il Regolamento CEE 822/97 (modifica del Regolamento precedente) prevede la determinazione del rapporto isotopico 18 O/ 16 O dellacqua contenuta nei vini per identificare il possibile fraudolento annacquamento di un vino Il Decreto Ministeriale 16-02-93 prevede la determinazione del rapporto isotopico 13 C/ 12 C dellalcol in mosti e vini mediante tecnica IRMS per identificare laddizione fraudolenta di miscele di saccarosio da bietola e canna Il Decreto Ministeriale 16-02-93 prevede la determinazione del rapporto isotopico 13 C/ 12 C dellalcol in mosti e vini mediante tecnica IRMS per identificare laddizione fraudolenta di miscele di saccarosio da bietola e canna

46 Analisi isotopica 13 C/ 12 C e D/H su vini sloveni. Dal confronto con vini non adulterati è possibile definire tre aree: una per le adulterazioni con zucchero di canna, una per le adulterazioni con zucchero di bietola e una per le adulterazioni con miscele Qualche esempio

47 Analisi di whisky La determinazione del rapporto D/H può fornire indicazioni sullautenticità di liquori pregiati come il whisky, permettendo di differenziare il whisky da grano o bourbon (il grano è una pianta con cammino biosintetico del tipo C4), il whisky single malt da orzo (pianta C3) e il whisky blended, in cui letanolo deriva da una miscela grano-orzo

48 Lestrema facilità della distribuzione isotopica degli elementi leggeri (H, C, O, N ed S) a variare in conseguenza di fenomeni vari, è causata dal fatto che il parametro m/m, legato alla differenza di massa, per gli isotopi di questi elementi è elevato e quindi gli effetti di frazionamento di massa influenzano pesantemente i valori finali negli alimenti che li contengono. Tutte le reazioni che dipendono dalla massa provocheranno infatti un frazionamento Esempi di m/m idrogeno: D/H (2-1)/2 0.5 carbonio: 13 C/ 12 C (13-12)/13 0.0769 13 CO 2 / 12 CO 2 (45-44)/45 0.0222 ossigeno: 18 O/ 16 O (18-16)/18 0.111 H 2 18 O/H 2 16 O (20-18)/20 0.1

49 La facilità di frazionamento, dovuta alla significativa differenza di massa tra isotopi, è insieme il punto forte e il limite dellanalisi isotopica applicata agli elementi leggeri. Dal punto di vista del controllo antiadulterazione ciò facilita enormemente il metodo di riconoscimento, ma dal punto di vista della provenienza geografica è evidente che esiste una variabilità naturale dei dati che rende difficile avere riferimenti ben precisi Per questi motivi lanalisi isotopica degli elementi leggeri è ancora allo stadio sperimentale per quanto riguarda la determinazione della provenienza. Sono necessarie raccolte di dati molto ampie, che tengano conto di tutte le variazioni possibili (stagionali, climatiche). Inoltre, è necessario tener conto delle possibili variazioni artificiali introdotte nel ciclo produttivo (addizione di composti con distribuzione isotopica differente) Sicuramente lapproccio migliore consiste nel tenere conto di dati isotopici e dati di concentrazione relativi ad elementi in tracce Necessità di database

50 Banche Dati Va considerato che la variazione dei rapporti isotopici dell'alcol di vino può essere oscillante. Ad esempio per il rapporto D/H nei vini italiani, a seconda della latitudine, del clima e della piovosità si possono avere valori compresi tra circa 98 e 107 ppm Per avere un campione statistico rappresentativo di tutta la produzione viticola italiana è necessario effettuare un'indagine su tutto il territorio nazionale. A questo scopo sono state costituite, a partire dal 1987, col patrocinio del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali - Ispettorato Centrale per la Repressione delle Frodi, le Banche Dati su campioni di vino sicuramente genuini e provenienti da tutta Italia. Ogni anno vengono raccolti circa 500 campioni di uva da tutte le regioni italiane e per ogni prelievo viene compilata una scheda con le principali informazioni del vigneto; dati relativi alla produzione (kg per ceppo, resa per ettaro) eventuale irrigazione, piovosità. Tali uve vengono successivamente vinificate in laboratorio, ottenendo il vino da analizzare Nel caso del Rapporto isotopico del deuterio, la Banca Dati Italiana è stata formalmente validata da una Commissione della Comunità Europea, che si avvale del contributo tecnico del Joint Research Centre di Ispra A livello europeo, dal 1990 esiste un database di vini che raccoglie dati da campioni di provenienza certa vinificati in Europa, secondo le indicazioni del Regolamento UE 2676/90. Oltre ai dati dei valori D/H originariamente previsti, attualmente il database comprende anche valori di 13 C deletanolo e di 18 O dellacqua di vino. Siccome le possibilità di adulterazione comprendono lutilizzo di mosti rettificati, zuccheri e prodotti vari da paesi del terzo mondo, si stanno raccogliendo dati anche da vini provenienti da questi paesi

51 Determinazione della provenienza Oltre allutilizzo nellidentificazione di sofisticazioni, lanalisi isotopica è impiegata nella caratterizzazione dal punto geografico dei prodotti enologici. Come si è detto in precedenza, infatti, uve cresciute in zone climaticamente diverse daranno vini in cui C, H e O (presenti in etanolo e acqua) avranno subito frazionamenti isotopici conseguentemente diversi Nella figura a fianco sono riportati i valori di 18 O per vini provenienti da: Le differenze risultano essere significative Paesi europei caldi (Spagna, Portogallo)Paesi europei caldi (Spagna, Portogallo) Paesi europei temperati (Francia, Italia)Paesi europei temperati (Francia, Italia) Paesi europei freddi e umidi (Germania, Austria)Paesi europei freddi e umidi (Germania, Austria)

52 Problemi nella determinazione della provenienza Per la determinazione della provenienza regionale, si possono utilizzare gli stessi parametri utili a identificare le adulterazioni, cioè 13 C e 18 O di etanolo e acqua di vino. La base è ovviamente il database UE. La determinazione è però resa problematica dal fatto che i campioni incogniti possono essere stati soggetti ad adulterazione, rendendo difficile la collocazione allinterno del database. Inoltre le variazioni stagionali naturali possono essere significative (figura sotto - 18 O di vini tedeschi della Franconia in annate diverse Una misura alternativa può essere la determinazione del rapporto isotopico dellazoto ( 15 N/ 14 N) dagli aminoacidi, che però può essere influenzato dalladdizione di sali di ammonio per la fermentazione Lapproccio migliore sembra quindi essere un impiego di più variabili, sia isotopiche sia di altro genere

53 Analisi di vini tedeschi Nella figura sono mostrati i valori di 13 C e 18 O rilevati in vini di presunta produzione tedesca e ritenuti di pregio. In realtà, dal confronto con i dati del database UE sembra evidente che alcuni campioni sono miscele di vini tedeschi e vini provenienti dallEuropa meridionale

54 Analisi isotopica 13 C/ 12 C, 18 O/ 16 O e D/H su vini sloveni. In questo caso lobiettivo è verificare la possibilità di differenziare vini provenienti da regioni vinicole diverse Utilizzando i parametri isotopici e trattando statisticamente i dati secondo il metodo chemiometrico PCA, si verifica una buona separazione tra i tre gruppi considerati Analisi isotopica e PCA

55 Come si è visto, l'analisi isotopica degli elementi leggeri trova moltissime applicazioni nell'autenticazione dei prodotti alimentari. Seppure con notevoli difficoltà, è possibile applicarla anche alla provenienza geografica Ma per quanto riguarda la tracciabilità? Per trovare il collegamento tra il prodotto finito e le materie prime, sarebbe necessario investigare lungo la filiera fino ad individuare il legame con il terreno. La determinazione dei rapporti isotopici di C, H, N, O e S nel terreno è difficile da effettuare, a causa della mancanza di uniformità della matrice. Nel terreno sono presenti in concentrazioni elevate moltissimi composti contenenti gli elementi leggeri, a differenza per esempio del vino in cui letanolo e lacqua sono assolutamente prevalenti come composti su cui determinare i rapporti isotopici di C e O Lanalisi isotopica sul terreno non ha quindi applicazioni pratiche e di fatto lunico collegamento con il territorio consiste nella possibilità di analizzare campioni di provenienza certa Tracciabilità con l'analisi isotopica?

56 Un'alternativa all'analisi isotopica degli elementi leggeri è quella degli elementi pesanti, generalmente presenti negli alimenti in concentrazioni a livello di tracce (< 0.1%) Gli elementi in tracce negli alimenti hanno concentrazioni bassissime e dipendenti da fattori vari, tra cui lorigine geografica. Durante lassunzione delle sostanze minerali da parte delle piante non si ha frazionamento isotopico significativo per gli elementi presenti in tracce nel terreno. Quindi, i loro rapporti isotopici sono eccellenti indicatori di provenienza o traccianti Per questo motivo, il collegamento degli alimenti con il terreno è studiato mediante lanalisi isotopica di elementi più pesanti, quali lo stronzio (Sr) e il piombo (Pb), che sono presenti nel terreno in quantità limitate. Questi elementi hanno una distribuzione isotopica differente da terreno a terreno, che può agire da impronta digitale Le principali applicazioni dellanalisi isotopica degli elementi pesanti si hanno in campo enologico Analisi isotopica di elementi pesanti

57 La causa principale del frazionamento isotopico negli elementi pesanti è la formazione di nuclidi figli radiogenici a partire da nuclidi madri radioattivi per via di trasmutazioni nucleari che avvengono in continuo (su scala geologica). La quantità di nuclidi madri varia da minerale a minerale e quindi rocce di origine diversa contengono nuclidi figli in quantità conseguentemente differente da sito a sito Inoltre, la maggior parte degli elementi pesanti (eccezion fatta per il ferro) non sono essenziali per la vita o hanno un ruolo minore rispetto ai bioelementi più leggeri (H, C, N, O, S, P, Ca) e ciò limita la possibilità di frazionamento isotopico causato da processi biologici Cause di frazionamento negli elementi pesanti

58 Nella tabella sono riportati alcuni tra i più importanti nuclidi radioattivi (madri) e radiogenici (figli) considerati come traccianti petrogenetici e, in quanto tali, utili per la determinazione delletà in geocronometria; è indicato inoltre il rapporto isotopico per il quale essi sono traccianti anche in studi sulle piante Alcuni esempi di nuclidi utili

59 La concentrazione di Sr nel vino varia tra 60 ppb e 7 ppm a seconda della sua origine. Si può quindi definire un microelemento o elemento in tracce nel vino. Nellambito della filiera del vino, la concentrazione di Sr tende a Contenuto di Sr nei vini incrementare dalluva al mosto fino al vino, probabilmente a causa del rilascio di ioni Sr 2+ contenuti nei semi e nelle bucce. Inoltre ci può essere un apporto artificiale di ione Sr 2+ dovuto alluso di fertilizzanti o a pratiche di cantina come la chiarificazione con bentonite e la deacidificazione con CaCO 3 o altri composti di Ca che possono contenere impurezze (lo ione Sr 2+ è ione vicariante dello ione Ca 2+ ) La concentrazione di Sr è quindi poco utile per tracciare la filiera

60 Gli isotopi naturali dello stronzio sono 4: Lisotopo 87 Sr è lunico radiogenico, cioè proveniente dal decadimento radioattivo di un altro nuclide: è il prodotto di decadimento - dellisotopo 87 Rb (tempo di mezza vita = 4.88·10 10 anni) 87 Rb 87 Sr + - Distribuzione isotopica di Sr 84 Sr (0.56%) 84 Sr (0.56%) 86 Sr (9.86%) 86 Sr (9.86%) 87 Sr (7.00%) 87 Sr (7.00%) 88 Sr (82.6%) 88 Sr (82.6%)

61 La concentrazione del nuclide 87 Sr aumenta gradualmente col tempo nei minerali, a differenza degli altri isotopi di Sr. Quindi, il rapporto 87 Sr/ 86 Sr tende ad aumentare in maniera relativamente a tempi geologici. Questa è la base per un metodo di datazione comunemente utilizzato in geochimica: il sistema Rb/Sr è un vero e proprio orologio radioattivo per la datazione dei minerali ed è usato per datare antiche rocce terrestri ignee e metamorfiche e campioni di rocce lunari. Ad esempio, nelle rocce granitiche, più antiche geologicamente, il valore del rapporto 87 Sr/ 86 Sr è tipicamente 0.710, mentre in rocce basaltiche, più giovani, il rapporto varia tra 0.702 e 0.705 Dal punto di vista della tracciabilità, quel che più conta è che il rapporto 87 Sr/ 86 Sr varia a seconda delletà geologica del terreno e quindi a seconda dellarea geografica. Terreni molto antichi avranno valori più alti di questo rapporto, mentre terreni geologicamente giovani avranno valori più bassi. In definitiva il nuclide 87 Sr agisce da tracciante Il nuclide 87 Sr come tracciante

62 Limpiego degli isotopi dello stronzio come marcatori nel vino è stato introdotto da ricercatori tedeschi nel 1992. Il rapporto 87 Sr/ 86 Sr può essere utilizzato come tracciante dellorigine del vino se esiste una correlazione significativa tra il valore di questo rapporto nel terreno e nel vino e se esistono differenze significative tra vini di differente provenienza geografica Naturalmente, occorre verificare se la distribuzione isotopica di Sr rimane inalterata nel trasferimento di sostanze nutrienti dal terreno alle piante e nei vari passaggi della filiera del vino. Se così fosse, la distribuzione isotopica nel vino dovrebbe riflettere quella del terreno da cui si originano le viti Il rapporto 87 Sr/ 86 Sr nella filiera

63 Il valore di m/m per il rapporto isotopico 87 Sr/ 86 Sr è molto basso: 87 Sr/ 86 Sr (87-86)/87 0.0115 In base a questo valore, si può stimare che Sr tenda a frazionarsi poco. Per questo motivo, a differenza dei rapporti isotopici degli elementi leggeri, è lecito attendersi scarsi effetti di frazionamento di massa sulla distribuzione di Sr, dovuti a processi naturali o artificiali Frazionamento di Sr

64 La bontà delle ipotesi enunciate in precedenza è verificata in uno studio effettuato da ricercatori Portoghesi, i quali hanno determinato il rapporto 87 Sr/ 86 Sr in due vini rossi provenienti dalla regione del Douro (Portogallo nordorientale), effettuando anche misure in vari punti della filiera. I vini sono stati ottenuto da vigne cresciute in un vigneto più antico (70 anni) e in un vigneto più giovane (10 anni), entrambi su terreno composto da materiale scistoso. La vinificazione è stata effettuata secondo un protocollo ben definito, anche se differente da un vino allaltro: Verifica... le uve del vigneto più vecchio sono state vinificate a mano secondo una procedura antica che prevede un numero limitato di passaggi; le uve sono polivarietali, cioè di varietà diverse di Vitis vinifera, e danno un vino rosso simile al Porto, di cui è previsto linvecchiamento da 2 a 20 anni (per motivi di praticità il vino è stato analizzato dopo un solo anno di invecchiamento) le uve del vigneto più vecchio sono state vinificate a mano secondo una procedura antica che prevede un numero limitato di passaggi; le uve sono polivarietali, cioè di varietà diverse di Vitis vinifera, e danno un vino rosso simile al Porto, di cui è previsto linvecchiamento da 2 a 20 anni (per motivi di praticità il vino è stato analizzato dopo un solo anno di invecchiamento) le uve del vigneto più giovane sono invece monovarietali del tipo Touriga Nacional e sono state vinificate con procedimento più complesso, costituito da un numero superiore di passaggi le uve del vigneto più giovane sono invece monovarietali del tipo Touriga Nacional e sono state vinificate con procedimento più complesso, costituito da un numero superiore di passaggi

65 Schema della vinificazione (a) Vigneto antico (b) Vigneto giovane

66 Il rapporto 87 Sr/ 86 Sr è stato misurato in tutti i campioni prelevati e riconducibili alle seguenti matrici: La misura del rapporto isotopico è stata effettuata con la tecnica di spettrometria di massa con plasma induttivamente accoppiato (ICP-MS). In questa tecnica è utilizzato sempre lo spettrometro di massa per separare ioni in base al rapporto massa/carica; differisce dalla tecnica descritta in precedenza per il fatto che è utilizzato un plasma per avere il campione in forma di ioni monoatomici La misura è realizzata misurando i segnali a rapporto massa/carica 86 (dovuto allisotopo 86 Sr) e 87 (dovuto allisotopo 87 Sr), e ottenendo matematicamente il valore del r.i. Per avere un riferimento preciso dei valori di distribuzione isotopica, è stato analizzato anche un campione standard avente distribuzione certificata, composto da SrCO 3 Misurazione del rapporto 87 Sr/ 86 Sr Terreno del vigneto Terreno del vigneto Mosto Mosto Vino stabilizzato e invecchiato Vino stabilizzato e invecchiato

67 Come si nota dalla tabella, i valori di 87 Sr/ 86 Sr sono molto simili tra mosto e vino, e tra i due vini ottenuti con metodi di vinificazione molto diversi. Risulta evidente, quindi, che nè la fermentazione nè il processo globale di vinificazione influenzano la distribuzione isotopica di Sr Effettuando un test statistico (paired t-test) sui valori di r.i. in terreno, mosto e vino, i tre valori non risultano essere significativamente diversi: ciò rende il parametro adatto come marcatore dellorigine dei vini in esame. Inoltre, il valore ottenuto è identico a quelli misurati da altri ricercatori in vini provenienti dalla stessa regione e differente da quelli misurati in vini di altri distretti portoghesi come Bairrada e Borba (Portogallo centrale e sudorientale) Risultati

68 Per confronto, si valuti la variazione della concentrazione totale di Sr nei mosti e nei vari passaggi di vinificazione (a) Vigneto antico (b) Vigneto giovane Il passaggio dal mosto al vino causa un incremento di circa 3 volte della concentrazione di Sr; è evidente che questo parametro non può essere utilizzato come tracciante, a differenza del rapporto isotopico Concentrazione totale di Sr

69 La misura del rapporto 87 Sr/ 86 Sr, effettuata con tecnica ICP-MS, è complicata dal fatto che il nuclide 87 Sr è isobaro con 87 Rb, un isotopo maggiore del metallo alcalino rubidio. Dal punto di vista chimico le due specie hanno comportamento diverso, ma dal punto di vista fisico risultano avere la stessa massa Nelle condizioni di misura allinterno dello spettrometro di massa, i due nuclidi, avendo rapporto massa/carica molto simile, danno segnali indistinguibili: al valore di massa/carica = 87, il segnale è dovuto alla somma dei contributi di 87 Sr e 87 Rb La possibilità di discriminare i due segnali è legata alla capacità di risoluzione dellanalizzatore di massa. I valori esatti del rapporto massa/carica sono 86.908882 per 87 Sr e 86.909186 per 87 Rb; la vicinanza è tale che per discriminare i due contributi sarebbe necessaria una risoluzione (m/ m) di circa 3·10 5, impossibile da ottenere per i normali strumenti commerciali Complicazioni nella misura

70 Il rubidio crea quindi interferenza positiva, in quanto il segnale del suo isotopo 87 Rb si somma a quello della specie che si desidera determinare, cioè 87 Sr. Il rubidio è solitamente presente nelluva e nel vino in quantità maggiori rispetto a Sr (0.2 - 4.2 mg/l nel vino); inoltre, mentre lisotopo 87 Sr corrisponde al 7.00% del totale di stronzio, lisotopo 87 Rb corrisponde al 27.8% del totale di rubidio. Si tratta quindi di una presenza ingombrante Per questi motivi, per avere una misura accurata dellabbondanza di 87 Sr e quindi un valore di r.i. affidabile, è necessario rimuovere lo ione Rb + dai campioni preliminarmente alla misura isotopica Contenuto di Rb nel vino

71 La rimozione di Rb dai campioni è basata sulla diversa affinità che gli ioni Rb + ed Sr 2+ hanno nei confronti del trattenimento per attrazione elettrostatica su una resina a scambio cationico. Il meccanismo del trattenimento è la seguente reazione di equilibrio: n(R-SO 3 - H + ) + Me n+ n(R-SO 3 - )Me n+ + nH + Il controione H + è facilmente scambiabile e può essere sostituito con cationi a densità di carica maggiore. Il campione liquido (pH corretto a 4) è immesso nella colonna contenente la resina. Lo ione Sr 2+ ha maggiore affinità dello ione Rb + per i siti di scambio cationico, ovvero la reazione 2(R-SO 3 - H + ) + Sr 2+ 2(R-SO 3 - )Sr 2+ + 2H + è preferenziale rispetto alla reazione R-SO 3 - H + + Rb + R-SO 3 - Rb + + H + Rimozione di Rb

72 Il passaggio su colonna ha quindi leffetto di favorire il trattenimento dello ione Sr 2+, mentre lo ione Rb +, non essendo trattenuto va allo scarico ed è quindi eliminato. Successivamente, si ottiene il desorbimento degli ioni Sr 2+ facendo passare una soluzione molto concentrata di H + (generalmente HCl concentrato) che rimpiazza gli ioni dai siti di scambio cationico per via della legge dellazione di massa: 2(R-SO 3 - Sr 2+ ) + 2H + n(R-SO 3 - )Me n+ + nH + Leluato acido contiene tutti gli ioni Sr 2+ precedentemente trattenuti; utilizzando un volume di eluente uguale al volume di campione immesso in colonna si ripristina la concentrazione iniziale, anche se in realtà ciò non è importante per lesito della misura isotopica, in quanto i processi descritti nella separazione cromatografica non alterano la distribuzione isotopica Recupero di Sr

73 Preliminarmente alla separazione cromatografica Sr/Rb, si usa effettuare un pretrattamento sul campione (mosto o vino) che consiste nel distruggere la matrice organica. Ciò ha lo scopo di evitare lintroduzione nel sistema di misura di specie potenzialmente interferenti dal punto di vista della misura con spettrometria di massa; inoltre, favorisce lefficienza della separazione cromatografica Sr/Rb Il pretrattamento consiste in unirradiazione con raggi UV del campione miscelato ad acqua ossigenata al 30%, che coadiuva la degradazione fotolitica dei composti organici presenti. Il trattamento è portato avanti per un tempo definito e causa la distruzione delle principali sostanze presenti nel mosto e nel vino, in particolare polifenoli, zuccheri e proteine (C, H, O) + H 2 O 2 + h H 2 O + CO 2 Ulteriori trattamenti

74 Nella figura sono riportati i valori di 87 Sr/ 86 Sr per vini da tavola (T) e vini fortificati (R) provenienti da alcune regione vinicole: Il risultati indicano che vini provenienti da regioni diverse hanno valori di 87 Sr/ 86 Sr statisticamente differenti, e quindi il parametro isotopico può costituire una promettente impronta digitale dellorigine del vino Confronto tra vini di regioni diverse portoghesi: portoghesi: Douro (R1) Douro (R1) Dão (R2) Dão (R2) Bairrada (R3) Bairrada (R3) Borba (R4) Borba (R4) Madeira (R5) Madeira (R5) francesi: francesi: Bordeaux (R6) Bordeaux (R6)

75 Nella tabella sono riportati i valori di 87 Sr/ 86 Sr per vini di regioni diverse Si noti come vini provenienti da suoli basaltici (più giovani geologicamente) abbiano valori minori di vini provenienti da suoli granitici (più antichi)

76 Altri risultati di determinazione di 87 Sr/ 86 Sr in vini di regioni diverse

77 Un altro elemento pesante di grande potenzialità dal punto di vista della tracciabilità è il piombo (Pb). Questo elemento è un tracciante effettivo dellattività antropogenica, essendo un testimone dellimpatto che luomo ha sui cicli ambientali Dallinizio dellindustrializzazione e in particolare dallintroduzione del piombo tetraetile nelle benzine come antidetonante (1939), si è registrato un incremento di inquinamento da piombo nellambiente, in quanto esso, pur essendo liberato a terra dagli scarichi delle macchine, è veicolato in tutti i settori dellatmosfera e si ritrova anche a latitudini insospettabili. È stata dimostrata la stretta correlazione tra emissioni di Pb dagli scarichi e contenuto di Pb nei terreni, nelle piante e indirettamente in uva e vino Questa tendenza si è invertita negli anni 70, grazie alla riduzione del contenuto di Pb nelle benzine, ed è in forte calo attualmente con leliminazione quasi totale e lintroduzione della benzina verde Il piombo

78 A causa della correlazione tra inquinamento da Pb e contenuto di Pb nelle piante, il vino risulta essere un marcatore dellambiente e, seppur a malincuore, esso costituisce un interessante archivio dei cambiamenti ambientali. Analizzando il contenuto di Pb in vini prodotti dallo stesso vigneto, è possibile individuare una tendenza parallela alla quantità di emissioni di Pb in atmosfera Il contenuto medio di Pb nei vini è attorno a 60 µg/l, con variazioni nel range 10-300. Un contenuto inferiore a 100 µg/l è considerato non contaminato. Va considerato che Pb è un elemento tossico e non essenziale per lorganismo, quindi il suo contenuto nel vino deve essere necessariamente ridotto al di sotto di 250 µg/l secondo le indicazioni dellOffice International de la Vigne et du Vin Il piombo nel vino

79 Nella figura è riportato landamento del contenuto di Pb in campioni di vino provenienti dallo stesso vigneto, localizzato nella Francia sudorientale. La verticale di vino comprende le annate dal 1950 al 1991. La concentrazione totale ( ) fluttua tra 78 e 227 µg/l fino al 1980, dopodichè si attesta ben al di sotto di 100 µg/l con fluttuazioni minori Esempio di serie temporale La concentrazione più bassa, 40 µg/l, si ha nel campione dellannata 1990 e la tendenza indica chiaramente un decremento della concentrazione. La tendenza al decremento inizia già nel 1974, ma è interrotta da alti valori nelle annate 1978 e 1980 Questi risultati sembrano indicare che il contenuto di Pb nel vino riflette limpiego di antidetonante a base di composti di organoPb, che è in diminuzione in Europa da alcuni decenni

80 Pb è presente nel vino sia sotto forma di ione Pb 2+, sia sotto forma di composto organometallico, in particolare trimetilpiombo, (CH 3 ) 3 Pb +, e trietilpiombo, (CH 3 CH 2 ) 3 Pb +. Questi composti derivano da (CH 3 ) 4 Pb e (CH 3 CH 2 ) 4 Pb, i famigerati composti antidetonanti addizionati dalle benzine. Attraverso una parziale decomposizione in atmosfera, i composti di organopiombo ricadono sul suolo e sono assorbiti dalla vite. I livelli di questi composti nel vino sono 10-500 ng/l per (CH 3 ) 3 Pb + e 0-50 ng/l per (CH 3 CH 2 ) 3 Pb + in vini provenienti da zone vicine a traffico veicolare intenso. Con lintroduzione delle benzine unleaded, il livello di questi composti è diminuito nettamente in tutto il mondo Composti di organopiombo

81 Il contenuto di questi composti nel vino è un indice grossolano della sua origine e dellanno di produzione, in quanto segue landamento dellimpiego di antidetonanti a base di Pb nelle benzine OrganoPb come marcatori Vini esenti da organoPb sono originari da paesi che hanno bandito da tempo luso di composti di Pb nelle benzine, come USA e Australia, oppure sono vini europei molto recenti Vini esenti da organoPb sono originari da paesi che hanno bandito da tempo luso di composti di Pb nelle benzine, come USA e Australia, oppure sono vini europei molto recenti Un contenuto non nullo è correlabile con letà in base al rapporto relativo tra trimetil- e trietilPb; in particolare, prima del 1960 il trimetilPb è sempre assente Un contenuto non nullo è correlabile con letà in base al rapporto relativo tra trimetil- e trietilPb; in particolare, prima del 1960 il trimetilPb è sempre assente Livelli elevati di organoPb indicano prossimità a zone ad Livelli elevati di organoPb indicano prossimità a zone ad alto traffico veicolare; lopposto indica vini da zone rurali

82 Il piombo esiste in natura in quattro forme isotopiche stabili: Gli isotopi 206 Pb, 207 Pb e 208 Pb sono radiogenici, in quanto derivano dal decadimento radioattivo, rispettivamente, dei nuclidi 238 U, 235 U e 232 Th. Lisotopo 204 Pb è invece non radiogenico. Labbondanza degli isotopi radiogenici tende quindi ad aumentare nel tempo Analogamente a Sr, le percentuali relative degli isotopi variano in funzione della genesi delle rocce, che contengono U e Th in quantità differenti. Quindi, a seconda delletà geologica delle rocce e della loro collocazione geografica, le rocce e i terreni contenenti Pb hanno distribuzioni isotopiche differenti, in maniera ancora più vantaggio rispetto a Sr in quanto per Pb sono possibili frazionamenti diversi Distribuzione isotopica di Pb 204 Pb (1.4%) 204 Pb (1.4%) 206 Pb (24.1%) 206 Pb (24.1%) 207 Pb (22.1%) 207 Pb (22.1%) 208 Pb (52.4%) 208 Pb (52.4%)

83 Un buon motivo per utilizzare la distribuzione isotopica di Pb come tracciante consiste nel fatto che le variazioni dalla distribuzione media sono molto più ampie rispetto a quelle degli elementi leggeri. Si consideri che la differenza di distribuzione isotopica tra le due miniere di Pb più importanti al mondo (nel Missouri, USA, e a Broken Hill in Australia) è circa 30%, un valore enorme Il piombo tetraetile addizionato alle benzine porta in sè unimpronta digitale isotopica che si trasmette ai composti di organoPb emessi in atmosfera, i quali si diffondono in tutto il pianeta ma per la maggior parte tendono a decomporsi e a rimanere nel comparto geografico locale. La ricaduta sul terreno trasmette limpronta isotopica alle piante e infine al vino. Questo è il motivo per cui vini provenienti dagli USA e dallAustralia sono facilmente distinguibili in base ai r.i. 206 Pb/ 207 Pb e 208 Pb/ 207 Pb, che riflettono la distribuzione isotopica del minerale piombifero estratto nelle miniere locali (rispettivamente Missouri e Broken Hill) e utilizzato per produrre lantidetonante. In Europa la situazione è intermedia in quanto Pb arriva da sorgenti diverse (Marocco, Australia, ecc.) Analisi isotopica di Pb

84 Il valore di m/m per i rapporti isotopici di Pb sono bassissimi: 208 Pb/ 206 Sr (208-206)/208 0.0096 Il frazionamento isotopico di Pb per fenomeni biologici o artificiali è irrilevante rispetto alle differenze esistenti nelle rocce, che discendono dal contenuto di nuclidi madri (Th e U). Quindi i r.i. di Pb riflettono esclusivamente le differenze geochimiche già esistenti in natura Questa caratteristica è particolarmente importante per gli studi di provenienza geografica. Siccome i processi di vinificazione non influenzano limpronta isotopica di origine geochimica, il vino risulta marcato in base alla differente origine geografica Misurazione dei rapporti di Pb

85 La determinazione quantitativa degli isotopi di Pb è più semplice rispetto a quella di Sr, in quanto non ci sono problemi di interferenza positiva, tranne che per lisotopo 204 Hg che interferisce con 204 Pb; tuttavia, il mercurio nei vini è solitamente presente a concentrazioni bassissime e decisamente inferiori a quelle di Pb La misura degli isotopi di Pb è effettuata con le tecniche di spettrometria di massa, nelle varianti ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) ad alta risoluzione o TIMS (Thermal Ionization Mass Spectrometry) Determinazione di Pb con MS

86 Nella tabella sono riportati i valori dei rapporti isotopici di Pb nei campioni della serie storica 1950-1991 Come si può notare, i r.i. variano pochissimo nel tempo, essendo i vini provenienti dallo stesso terreno Esempi di studi isotopici su Pb

87 Nel grafico sono evidenziati i valori di r.i. per campioni di vino provenienti dallEuropa, dalla California e dallAustralia. I vini europei sono difficilmente distinguibili, ma è interessante la netta discriminazione tra vini europei ed extraeuropei Confronto tra vini europei e non

88 Anche in questo studio si rileva una certa differenza tra vini europei ed extraeuropei

89 Dalla tabella dei r.i. risultano differenze statisticamente significative

90 Valori di letteratura

91 Pb in vini italiani In un recente studio sui vini italiani è stata valutata la possibilità di impiegare i r.i. di Pb dal punto di vista della classificazione geografica. La determinazione della concentrazione totale di Pb non è particolarmente significativa, in quanto le numerose sorgenti di contaminazione causano sovrapposizioni dei valori È però interessante notare che il valore medio più elevato si ha per i vini dellItalia nordoccidentale, zona a elevata industrializzazione I r.i. dei vini italiani rientrano negli intervalli noti per i vini europei; non si registra però una netta discriminazione tra i vini delle quattro macroregioni considerate (nordovest, nordest, centro, sud)