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Farmacologia Molecolare Mer 7/4 pomeriggio dalla Prof. Curti per discussione orario Tentativamente, inizio lezioni: Mer 14/4 ore 9-11.

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1 Farmacologia Molecolare Mer 7/4 pomeriggio dalla Prof. Curti per discussione orario Tentativamente, inizio lezioni: Mer 14/4 ore 9-11

2 Canale ionico in 3D – KcsA

3 Famiglie di canali ionici I canali ionici sono raggruppati in diverse famiglie Canali della stessa famiglia tipicamente hanno: Stessa topologia di membrana della subunità che costituisce il poro del canale Somiglianze significative nelle sequenze

4 Canali ionici voltaggio-dipendenti Famiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM) Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunità Ciascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P) Vi appartengono: Canali voltaggio-dipendenti del Na +, Ca 2+ e K + Canali del K + Ca 2+ -attivati Canali cationici attivati dalliperpolarizzazione, ecc. Questa è una delle 4 (pseudo)subunità H5

5 X 4

6 Canali del K inward rectifier Famiglia di canali a 2 domini transmembrana (TM) Il poro è delineato da 4 subunità (Kir) Ciascuna contiene 2 segmenti TM e un loop interno Permettono una corrente di K + inward maggiore della outward Questa è una delle 4 (subunità

7 Recettori Ionotropici per il glutammato Sono costituiti da 4 subunità Ciascuna ha 3 segmenti TM e un loop interno

8 Recettori Nicotinici e Recettori Ionotropici correlati (5HT 3, GABA A, Glicina) Sono costituiti da 5 subunità Ciascuna subunità ha 4 segmenti TM

9 Il gating dei canali Come fa il voltaggio ad aprire i canali? Il controllo dellattività dei canali per mezzo del voltaggio è la chiave che sta alla base delleccitabilità neuronale e del signalling ovvero

10 I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio

11 Il movimento del Sensore del Voltaggio Produce una Corrente di Gating +50 mV -100 mV 1000 pA Corrente Ionica

12 +50 mV -100 mV Corr. di Gating Soluzione senza K pA 10 pA 1 ms Corrente Ionica Il movimento del Sensore del Voltaggio Produce una Corrente di Gating

13 +50 mV -100 mV 1000 pA 10 pA 1 ms Carica totale di gating Numero dei canali = cariche e - / canale Corr. di Gating Soluzione senza K + Corrente Ionica Il movimento del Sensore del Voltaggio Produce una Corrente di Gating

14 Nel canale del K + Shaker, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici regolarmente distribuiti ogni 3 aa. Canale chiuso: la 2 a Arg di S4 è seppellita nel bilayer Canale aperto: la 2 a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4 o e 5 o residui basici si muovono dal citosol allinterno del bilayer Attiva la spirale

15 Nel canale del K + Shaker la presenza di 4 segmenti S4 che fungono da sensori del voltaggio intrinseci spiega la ripida dipendenza dellattivazione del canale dal voltaggio. Le 4 subunità identiche si muovono verso il lato extracellulare in due fasi distinte: 1)Prima indipendentemente luna dallaltra; 2)Poi in maniera cooperativa, portando allapertura.

16 This simulation shows a simplified view of the channel from the outside of the cell membrane. The S6 segments of the pore (blue) represent the conduction pathway and the voltage sensors are represented by the S4 segments (brown). The link between the S4 and the pore is simply indicated as a bar (yellow) connecting the inner end of the S4 with the inner end of the S6 segment.

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21 Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL q/n (e - charges) R K R neutral AA

22 ILRVIRLVRVFRIFKLSRHSKGL q/n (e - charges) R K R neutral AA Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica

23 MacKinnon_Nature01473.pdf MacKinnon_Nature01580.pdf MacKinnon_Nature01581.pdf

24 Struttura del Canale K + Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix La visione del tetramero del canale K + è dal lato intracellulare. Ciascuna subunità è colorata separatamente e contiene 6 -eliche (etichettate S1-S6 alle loro estremità N- terminali nella subunità blu). Le eliche S5-S6 formano il poro e il filtro di selettività per il K +. Le eliche S1-S4 formano i sensori del voltaggio. Gli ioni K + sono colorati in verde.

25 Struttura del Canale K + Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix Visione laterale. È indicato lo spessore della membrana (40 A)

26 Conformazioni del Sensore del Voltaggio Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K + ; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata lossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K +. Chiuso: V r =-100 mV

27 Conformazioni del Sensore del Voltaggio Aperto: depolarizz. Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K + ; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata lossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K +.

28 Lo stato chiuso corrisponde al potenziale di riposo della cellula (~ -100 mV). Lo stato aperto è favorito da una depolarizzazione della membrana. In questo modello, S2 è assunto rimanere inalterato durante lo switch; S3a e S3b subiscono dei riarrangiamenti sostanziali; si ipotizza che anche la connessione tra S4-S5 sia rimodellata.

29 Ingrandimento del Sensore del Voltaggio chiuso Una Subunità, Chiusa: Delle eliche S2-S4 è mostrata lossatura. Le arginine che conferiscono la sensibilità al voltaggio, sono mostrate come bastoncini colorati. Sono mostrati anche lossatura del filtro di selettività e gli ioni K +.

30 Ingrandimento del Sensore del Voltaggio In aggiunta al movimento della paletta sensore del voltaggio", notare nello stato aperto la formazione di un ponte salino (legame ionico) tra lAsp 80 e lArg 133. aperto

31 Accessibilità dei Residui Interno Nella conformazione chiusa, i residui evidenziati in magenta sono esposti allo spazio interno.

32 Accessibilità dei Residui Nella conformazione aperta, i residui evidenziati in rosso sono vicini allo spazio esterno (10 Å) o si estendono verso di esso. Esterno

33 La struttura del canale del K + KvAP è descritta in: A. Jiang Y, Lee A, Chen J, Ruta V, Cadene M, Chait BT, & MacKinnon, R. (2003) "X-Ray Structure of a Voltage- Dependent K + Channel". Nature 423: 33 I movimenti delle palette del voltaggio sono descritti in: B. Jiang Y, Ruta V, Chen J, Lee A, & MacKinnon, R. (2003) "The principle of gating charge movement in a voltage- dependent K + Channel". Nature 423: 42 [1ORQ.pdb & 1ORS.pdb]

34 Per raggiungere unalta selettività senza trattenere lo ione troppo a lungo, i canali ionici hanno siti di legame multipli per lo ione permeante La permeabilità agli ioni Funzioni fisiologiche appropriate dei canali ionici dipendono dalla loro straordinaria selettività agli ioni

35 Evidenze per la presenza di siti di legame: Una dipendenza della permeabilità allo ione dalla composizione e dalla concentrazione dello ione implica la presenza di siti di legame nel canale Conduttanza Concentrazione del Na + o K + K+K+ Na +

36 Evidenze per lesistenza di più di un sito di legame: La presenza di più ioni permeanti nel poro del canale è visualizzabile da misure di cristallografia

37 La selettività ionica dei canali del Na + e del Ca 2+ I canali del Na + e Ca 2+ hanno pori più ampi di quelli dei canali del K + e tuttavia favoriscono il passaggio di ioni più piccoli del K + Come sono disegnati questi canali per essere selettivamente permeabili a Na + e Ca 2+ ?

38 In soluzione acquosa tutti gli ioni sono circondati da un alone di molecole dacqua

39 Raggio anidro e idrato e spessore dellalone idrico di solvatazione (idratazione) di alcuni ioni di interesse fisiologico Il poro dei canali del Na + e Ca 2+ è effettivamente più ampio di quello dei canali del K +, ma non sufficientemente grande da permettere la permeazione di ioni completamente idratati. Il processo di deidratazione e lenergia coinvolta costituiscono un fattore importante nel determinare la selettività. Probabilmente il poro di un canale approssima la conchiglia di idratazione del suo ione permeante, facilitando la perdita di molecole dacqua durante il movimento dello ione lungo il canale.

40 La selettività di un canale K + nei confronti del K + rispetto al Na + Gli ioni K +, idrati in soluzione, perdono le molecole di H 2 O quando passano attraverso il filtro di selettività e formano dei legami di coordinazione con quattro O di gruppi carbonilici C=O. Gli ioni Na +, essendo più piccoli, non possono coordinarsi perfettamente con questi O e quindi attraversano il canale solo raramente. K + in H 2 ONa + in H 2 O K + nel poroNa + nel poro

41 Quindi: Il canale K + è selettivo per il K + rispetto allNa + perchè gli ioni K + formano legami più forti col filtro di selettività, compensando la perdita di energia dovuta alla deidratazione. Però, come si concilia il legame forte con il fatto che gli ioni K + diffondono attraverso il canale quasi altrettanto rapidamente che nel solvente?

42 1. Nel filtro di selettività della proteina cristallizzata si possono vedere due ioni K +.

43 2. I due ioni K + sono estremamente vicini tra di loro. La repulsione tra questi due ioni carichi positivamente deve essere piuttosto forte, e tende a spingerne uno o entrambi fuori dal filtro.

44 canale del potassio canale del sodio canale-recettore per lAch canale del potassio canale del sodio Dimensioni del Poro


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