La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Lo studio delle correnti ioniche di singolo canale mediante la tecnica del patch-clamp.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Lo studio delle correnti ioniche di singolo canale mediante la tecnica del patch-clamp."— Transcript della presentazione:

1 Lo studio delle correnti ioniche di singolo canale mediante la tecnica del patch-clamp

2 Era noto da lungo tempo che attraverso la membrana plasmatica è possibile un rapido scambio di ioni. Tuttavia, Neher e Sakmann furono i primi a mostrare lesistenza di canali ionici specifici La tecnica del patch clamp Erwin Neher & Bert Sakmann Premi Nobel per la medicina nel 1991 per lo sviluppo della tecnica del patch-clamp rendendo possibile la caratterizzazione di singoli canali ionici

3 Per chiarire come funziona un canale ionico, cioè come esso si apre e si chiude, è necessario poter registrare la corrente che lo attraversa. Antecedentemente allera del patch-clamp ciò appariva elusivo in quanto la corrente ionica attraverso un singolo canale è molto piccola. Con la tecnica del patch-clamp si poterono superare tali difficoltà.

4 Il setup per il patch-clamp computer oscilloscopio amplificatore microelettrodo micromanipolatore preparato microscopio gabbia di Faraday

5 La configurazione di cell-attached

6 Registrazione di una corrente elettrica che fluisce attraverso un singolo canale ionico Elettrodo di registrazione: micropipetta di vetro m Resistenza della saldatura: >1 G Quando un singolo canale si apre, gli ioni si muoveranno attraverso il canale come una corrente elettrica Con un opportuno equipaggiamento elettronico e opportune condizioni sperimentali è possibile misurare questa corrente microscopica Amplificatore

7 Quale tipo di informazioni è possibile ottenere dalla registrazione di correnti di singolo canale?

8 Ampiezza media di singolo canale

9 Ampiezza media della corrente attraverso un singolo canale 20 ms 1 pA Chiuso Aperto Traccia di corrente attraverso un singolo canale Causa la presenza di un rumore di fondo che è riducibile ma non eliminabile, lampiezza della corrente che fluisce attraverso un singolo canale è soggetta a fluttuazioni. Di essa è pertanto possibile conoscere solo il suo valore medio Il calcolo di tale valore richiede la costruzione di un istogramma di ampiezza derivato dalla registrazione di singolo canale

10 20 ms 1 pA Chiuso Aperto Costruzione di un istogramma di ampiezza Occorre una lunga registrazione di singolo canale Si misurano le ampiezze di tutte le aperture Tali ampiezze vengono riportate in un grafico (istogramma di ampiezza) ll dominio dellampiezza (ascissa del grafico) viene suddiviso in intervalli costanti a ciascuno dei quali si associa il numero di aperture aventi ampiezza corrispondente =1.7 pA Numero degli eventi Ampiezza (pA) La larghezza dellistogramma dipende dal rumore di fondo della registrazione Landamento dellistogramma può essere descritto da una funzione gaussiana del tipo: dove: = ampiezza media di corrente = deviazione standard A = area della distribuzione

11 -30 mV 0 mV +40 mV -100 mV La conduttanza di singolo canale ( ) è un parametro biofisico caratteristico di un certo tipo di canale La relazione corrente-voltaggio a canale aperto è generalmente lineare i open single = γ (V-E K ) Misurando le correnti di singolo canale è possibile costruire la relazione I-V a canale aperto

12 Probabilità di apertura

13 Cosè la probabilità di apertura? vale a dire, Chiuso Aperto A1A1 A8A8 A2A2 A3A3 A4A4 A5A5 A6A6 A7A7 A9A9 A 10 C1C1 C2C2 C3C3 C4C4 C5C5 C6C6 C7C7 C8C8 C9C9

14 chiuso aperto Tracciati di singolo canale che mostrano P o diverse chiuso aperto chiuso aperto chiuso aperto chiuso aperto

15 -30 mV 0 mV +40 mV -100 mV P o nel caso di un canale voltaggio-dipendente: Essa varia al variare del potenziale

16 Currente, conduttanza, e voltaggio I = N·P·i I = corrente macroscopica N = numero di canali funzionali P = probabilità che un canale sia aperto i = corrente attraverso un singolo canale aperto i = (V – V R ) = conduttanza del singolo canale aperto V = potenziale di membrana V R = potenziale di inversione I = N·P· (V – V R ) I = g (V – V R ) Corrente = Conduttanza Driving force g = Conduttanza macroscopica g = N p se è costante, g è proporzionale a P I = g (V – V K )

17 Quale altro tipo di informazione può dare lanalisi delle correnti di singolo canale? 1.Il numero degli stati in cui il canale può esistere 2.Il tempo medio di permanenza in ciascun stato 3.Le velocità di transizione tra gli stati

18 chiuso aperto I tre tracciati mostrano la stessa probabilità di apertura ma cinetiche diverse chiuso aperto chiuso aperto

19 100 ms 1 pA Chiuso Aperto Durata delle aperture e delle chiusure Traccia di corrente attraverso un singolo canale ottenuta ad un potenziale fisso senza alcun tipo di sollecitazione (stato stazionario). La corrente passa frequentemente dalluno allaltro di due distinti livelli il canale pur in condizioni stazionarie può trovarsi in almeno due stati conformazionali : chiuso e aperto La traccia mostra una notevole variabilità nella durata delle aperture e delle chiusure Non è possibile prevedere quanto tempo il canale rimarrà in ciascun stato funzionale (chiuso o aperto), né quando avverrà la successiva transizione: Siamo di fronte a variabili casuali (stocastiche) Le leggi che le governano possono essere dedotte dalla distrubuzione di probabilità di un elevato numero di eventi (aperture e chiusure)

20 Come ricavare la distribuzione di probabilità delle aperture e delle chiusure Occorre una lunga registrazione di singolo canale Si misurano le durate di tutte le aperture (e chiusure) Tali durate vengono riportate in un grafico (istogramma di durata) ll dominio temporale (ascissa del grafico) viene suddiviso in intervalli costanti a ciascuno dei quali si associa il numero di aperture aventi durata corrispondente 100 ms Chiuso Aperto Tempi di apertura Numero degli eventi Durata aperture (ms) Tempi di chiusura Numero degli eventi Durata chiusure (ms) aperture=950 chiusure=950

21 Tempi di apertura Numero degli eventi Durata aperture (ms) Tempi di chiusura Numero degli eventi Durata chiusure (ms) Notare landamento decrescente delle due distribuzioni: gli eventi di breve durata sono i più frequenti gli eventi più lunghi sono via via sempre meno numerosi Le due distribuzioni delle durate sono ben descritte da funzioni del tipo: dove: N(t) = numero di aperture comprese tra (t-0.5dt) e (t+0.5dt) dt =intervallo in cui è suddivisa lascissa a e sono costanti tipiche del canale In particolare, =costante di tempo è un indice di quanto rapidamente la distribuzione declina verso zero: è il tempo a cui la distribuzione è il 37% del suo valore iniziale Nel caso di uno schema cinetico a due stati (CO) a=1/ =8 ms =26 ms

22 C O Come sono correlati i tempi di permanenza e le costanti di velocità nel caso di un modello a due stati? Tempo Medio di Apertura (MOT o o ) = 1/ Tempo medio di chiusura (MCT o c ) = 1/ Per esempio, se = 250 s -1 e = 1000 s -1, allora la durata media dei soggiorni nello stato aperto sarà 1/ = 1 ms e la durata media di soggiorni nello stato chiuso sarà 1/ = 4 ms Cioè: Il tempo medio che il canale trascorre in un particolare stato (il soggiorno in quello stato) e il reciproco della costante di velocità di transizione che porta fuori da quello stato. Si può dimostrare che:

23 La frazione di tempo che il canale trascorre in uno dei due stati dipende da entrambe le costanti di velocità e. Pertanto: Fraz. di t nello stato aperto = Se misuriamo un gran numero di tempi di apertura successivi, che tipo di distribuzione osserviamo? Supponiamo che un canale aperto abbia una probabilità P= 0.3 di chiudersi nei successivi 0.1 ms. Allora, misurando 1000 aperture, circa 700 volte si avrebbero aperture con un t o >0.1ms, ecc. Quindi, in uno schema cinetico a 2 stati: MOT=1/ e MCT=1/

24 Quando il canale è aperto vi è una probabilità costante che esso cambi il suo stato da O a C in un breve e definito intervallo di tempo t, indipendentemente da quanto a lungo già si trovava nello stato O, o da come ci era arrivato. Supponiamo per esempio che esista una probabilità P=0.3 che la transizione avvenga nei successivi 0.1 ms. Ciò significa che possiamo fare predizioni statistiche circa il cambiamento da O a C. Avendo osservato un gran numero di canali aperti, circa nel 30% di essi il cambiamento a C sarà avvenuto nei primi 0.1 ms. Quindi, dopo 0.1 ms il 70% di essi è ancora nello stato O. Nei successivi 0.1 ms, un ulteriore 30% del rimanente 70% cambierà a C, e così via. Processi con tali caratteristiche, che la probabilità di un particolare cambiamento rimane costante in piccoli intervalli di tempo successivi, sono esempi di processi Markoviani.

25 Chiuso Aperto Tempi di apertura Numero aperture Durata aperture (ms) =8 ms 1 =2.3 msa 1 =0.4 2 =25 msa 2 =0.6 Tempi di chiusura Canali con più stati chiusi distinguibili Schemi cinetici possibili: In questo caso le relazioni tra i tempi medi di apertura e di chiusura e le costanti di velocità dipendono dallo schema cinetico scelto C1C1 C2C2 O C1C1 O C2C2

26 Importanza di: Frequenza di campionamento Filtraggio dei segnali nella registrazione di correnti di singolo canale Seguiranno esempi di tracciati mostranti la perdita di informazione con una frequenza di campionamento bassa o con un filtraggio eccessivo

27 4 ms 0.5 pA Effetto del filtraggio su un tracciato di corrente di singolo canale Traccia filtrata a HzTraccia filtrata a 1000 Hz In pratica per correnti di singolo canale il filtraggio analogico del segnale è normalmente compreso tra 5 e 3 KHz

28 4 ms 0.5 pA Effetto della frequenza di campionamento su un tracciato di corrente di singolo canale Freq. camp. = 0.1 ms/puntoFreq. camp. = 0.4 ms/punto Teorema del campionamento: i dati dovrebbero essere campionati ad una frequenza almeno doppia di quella della banda passante

29 Molte informazioni sul meccanismo di funzionamento dei canali ionici sono il risultato di una collaborazione tra elettrofisiologi e biologi molecolari Supponiamo per esempio di voler testare lipotesi che una particolare catena laterale della proteina-canale sia implicata nel processo di apertura/chiusura.

30 Viene fatta esprimere la proteina con una catena laterale alterata Gene (DNA) Ipotesi circa una importante catena laterale Vengono mutati i codons desiderati Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico misura RNA o cDNA


Scaricare ppt "Lo studio delle correnti ioniche di singolo canale mediante la tecnica del patch-clamp."

Presentazioni simili


Annunci Google