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Esempi di modelli cinetici. Mean open time (MOT) = 1/k c Mean closed time (MCT) = 1/k o Inoltre, allo stato stazionario: dP O /dt = k o - (k o + k c )P.

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1 Esempi di modelli cinetici

2 Mean open time (MOT) = 1/k c Mean closed time (MCT) = 1/k o Inoltre, allo stato stazionario: dP O /dt = k o - (k o + k c )P o = 0 P o = k o /(k o + k c ) C koko kckc O 1 Gating dei canali: modello a due stati

3 Gating dei canali: Simulazioni di 2 Stati Tempo (ms) Open Prob Tempo (ms) Cinetica lenta: k o =0.5/ms k c =0.5/msCinetica rapida: k o =5/ms k c =5/ms P o =0.5 Significato di k o : Per ogni ms che il canale è nello stato chiuso, esso in media si aprirà 0.5 volte. Significato di k c : Per ogni ms che il canale è nello stato aperto, esso in media si chiuderà 0.5 volte. Significato di k o : Per ogni ms che il canale è nello stato chiuso, esso in media si aprirà 5 volte Significato di k c : Per ogni ms che il canale è nello stato aperto, esso in media si chiuderà 5 volte.

4 Gating dei canali: Altre simulazioni a due stati Tempo (ms) Open Prob Tempo (ms) Alta P o : k o =5/ms k c =0.5/ms Tempo (ms) Bassa P o : k o =0.5/ms k c =5/ms P o =0.9 P o =0.1

5 Esercizi sul Gating 1 k o k o k o k c 1 k c 1 k o k c Tempo medio di chiusura Tempo medio di aperturaCostante di tempo dellattivazione P open stato staz. Predizioni esempiok o (1/ms)k c tempo medio di chiusura (ms) PoPo costante di tempo (ms) tempo medio di apertura

6 C O O C COCO Voltaggio Livelli energetici Costanti di velocità Corrente attraverso singoli canali 10 ms Corrente attraverso molti canali Canale K + Depolarizz mV +50 mV

7 Gating dei canali: Modello a 3 Stati con inattivazione Si applica a canali V-dipendenti inattivanti C O k +i k -i I koko kckc 2

8 Gating dei Canali: correnti medie con 3 Stati e inattivazione k o = 0.5/msk c =0.005/ms k +i = 0.25/msk -i = 0.025/ms Open Prob tempo (ms) P open k +i = 0/msk -i = 0/ms C O k +i k -i I koko kckc

9 Relazioni tra costanti di velocità e costanti di tempo in un modello a tre stati con inattivazione C O k +i k -i I MOT = 1/(k c +k +i ) MCT = 1/ k o MIT =1/k -i (tempo medio dello stato inattivato) MOB*=(k C / k +i )+1 (numero medio di aperture/burst) koko kckc Regola generale: il tempo medio che il canale trascorre in uno stato è uguale allinverso della somma delle costanti di velocità che si allontanano da quello stato * Qualora il flikering sia tra C e O; altrimenti, se fosse tra O e I allora sarebbe: MOB=(k +i / k C )+1

10 k o = 0.5/ms k c =0.005/ms k +i = 0.25/ms k -i = 0.025/ms k o = 0.5/ms k c =0.005/ms K +i = 0.25/ms k -i = 0.1/ms k o = 0.5/ms k c =0.005/ms K +i = 0.25/ms k -i = 0.25/ms Diversi gradi di inattivazione Allaumentare di k -i diminuisce il grado di inattivazione C O k +i k -i I koko kckc

11 1 ms I O C C I O C O I C O I Canale del Na + Voltaggio Livelli energetici Costanti di velocità Corrente attraverso singoli canali Corrente attraverso molti canali Depolarizz mV +10 mV

12 Che informazioni possono darci registrazioni di singolo canale circa il gating che già non abbiamo appreso dallo studio delle correnti macroscopiche? Seguirà una reinterpretazione del gating del canale del Na + VD basata su registrazioni di singolo canale. Aldrich, Corey, Stevens Nature (1983)

13 Modello classico di inattivazione vs nuove interpretazioni Modello di H. & H. Attivazione rapida Inattivazione lenta (e volt.dip.) Modello alternativo Attivazione lenta Inattivazione rapida (e volt.indip.) A reinterpretation of mammalian sodium channel gating based on single channel recording Aldrich, Corey & Stevens – NATURE (1983)

14 =2 ms =10 ms Modello classico di inattivazione vs nuove interpretazioni Lanalisi della latenza permette di discriminare tra i due modelli C O 100 I C O 800 I Modello alternativo Attivazione lenta Inattivazione rapida (e volt.indip.) Modello di H. & H. Attivazione rapida Inattivazione lenta (e volt.dip.)

15 Gating dei canali: Modello a 3 Stati Si applica a bloccanti del canale aperto Un semplice schema di blocco C O k +B · [B] k -B B canale non bloccato C O burst canale bloccato Ricordarsi che la transizione O B è data da k +B · [B], dove [B] è la concentrazione del bloccante. u.d.m.: k +B · [B] (s -1 ), [B] (M) k +B (M -1 · s -1 ) Mean open time (MOT) = 1/( k +B · [B]) Mean closed time tra i bursts (MCT) = 1/ Mean closed time allinterno dei bursts (MBT) = 1/k -B Mean opening per burst (MOB)=(k +B · [B]/ )+1 3 +B

16 Effetto della [B] sulla cinetica [B] ( M) +k * [B] C O k +B · [B] k -B B Effetto della concentrazione del bloccante k -B k +B ·[B][B] o 1/ o = +k +B ·[B]k +B =(1/ o - )/[B] s -1 M msms -1 M -1 ·s k +B Ricavabile dallanalisi dei tempi medi di apertura

17 [B]=50 M o =0.67 ms

18 [B]=25 M

19 [B]=10 M

20 [B]=5 M

21 [B]=0

22 Un semplice schema di blocco cont. Sappiamo inoltre che in assenza di bloccante MOT=1/ quindi, possiamo ricavare k +B ·[B]. Inoltre, possiamo ricavare la costante di dissociazione del bloccante K D in quanto K D =k -B /k +B (Neher & Steinbach, 1978). Pertanto, in questo semplice schema tutte e quattro le costanti di velocità e la K D possono essere determinate dallanalisi dei tempi di chiusura e di apertura. Un approccio alternativo è il seguente (Colquhoun & Hawkes, 1983): Mean open time per burst = M o · M r = 1/ dove M o =mean OT, M r = numero medio di aperture per burst e Mean closed time per burst = M c · M r = C B / dove C B = [B]/K D

23 Un canale con due stati chiusi distinti C2C2 k +1 k -1 C1C1 O MOT = 1/ MC 1 T = 1/( +k -1 ) MC 2 T = 1/k +1 E Inoltre possibile ricavare che: il numero medio di aperture per burst MOB=( / k -1 )+1 il(Colquhoun & Hawkes, 1981) (Johnston & Wu, Foundations of Cellular Neurophysiology p. 268) 4 C O burst

24 Registrazioni di singolo canale da canali del Ca 2+. Configurazione di cell-attached con la pipetta di patch riempita con Ba2+. Il bagno contiene una soluzione salina normale. Risposte a depolarizzazioni di circa -5 mV (sinistra) e +15 mV (destra). Nel pannello di destra il livello di corrente zero è indicato con linee orizzontali. Le ampiezze medie di singolo canale sono 0.9 pA a -5 mV, e 0.6 pA a +15 mV. Filtro passa- bassi a 1 kHz. Istogramma dei tempi di apertura per i dati a -5 mV (pannello di sinistra di (A). Listogramma è stato interpolato con un singolo esponenziale la cui costante di tempo è o = 0.81 ms. Istogramma dei tempi di chiusura per gli stessi dati a -5 mV. Listogramma è stato interpolato con un doppio esponenziale con costanti di tempo c = 1.05 ms e s = 25.5 ms.. c rappresenta la durata media delle brevi chiusure allinterno dei bursts osservabili nel pannello di sinistra di (A). s rappresenta il tempo medio tra eventi indipendenti. Il numero medio di aperture per burst è 0.57.

25 Correnti di singolo canale (A), e istogrammi dei tempi di apertura, chiusura e latenza (B), calcolati dalle correnti in (A). Istogramma dei tempi di apertura: interpolato con un singolo esponenziale (costante di tempo di 1.2 msec). Istogramma delle latenze: il picco più alto è a circa 5-6 ms, suggerendo la presenza di una fase di attivazione. Istogramma dei tempi di chiusura: la linea continua è ottenuta dqallinterpolazione con il doppio esponenziale A 1 exp(-t/ c1 ) +A 2 exp(-t/ c2 ). A 1 /A 2 = 4.5 = numero medio di aperture per burst. Our motivation was to learn more about the mechanisms by which the Ca channel operates.

26 C1 3 O C2C3 2 Equivalente lineare della cinetica m 3 secondo il modello di H&H Entrambi gli schemi predicono lo stesso andamento temporale dellattivazione (a livello macroscopico), tuttavia il modello di destra non è più interpretabile come lapertura di tre gates m identiche e indipendenti. Piuttosto, esso potrebbe essere interpretato come unattivazione con cooperatività positiva in cui ciascuna gate è più facile da aprire della precedente. C1 O C2C3 2 Cooperatività positiva È prevista cooperatività nellattivazione dei canali del Na e del K

27 Un semplice schema di attivazione da agonista A+R k +1 k -1 AR AR* (open) MOT = 1/ Il tempo di chiusura sarà la somma dei tempi trascorsi negli stati A e AR: MCT = 1/( +k -1 ) + 1 /(k + 1 ·[A]) Questo potrà essere separato in due componenti di tempi di chiusura se le costanti di velocità sono significativamente differenti. Tempo medio in AR (chiusure dentro i burst) = 1/( +k -1 ) Tempo medio di chiusura tra i burst) = 1/(k + 1 ·[A]) MOB= /k

28 Bibliografia 1.Colquhoun & Hawkes (1977) Proc R Soc Lond [Biol] 199: Colquhoun & Hawkes (1983) in Single channel recording eds. Neher & Sakmann, Chapter 9. 3.Neher & Steinbach (1978) J Physiol 277:

29 FINE


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