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Limmunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica Roberto Caporale Pistoia, 29 ottobre 2011.

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Presentazione sul tema: "Limmunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica Roberto Caporale Pistoia, 29 ottobre 2011."— Transcript della presentazione:

1 Limmunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica Roberto Caporale Pistoia, 29 ottobre 2011

2 Bernard Shoor & Leonard Herzenberg at Stanford with one of the original BD Flow Cytometers Becton & Dickson, using FACS technology, introduced 1st commercial Flow (FACS-1)

3 Sistema FACSCanto II BD Biosciences

4 Microscopia Citometria in fluorescenza Microscopia Citometria in fluorescenza

5 Citometria a Flusso (CFM) La CFM consente lanalisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse, misurandone le caratteristiche fisiche e/o biochimiche allinterno di un flusso laminare che interseca una sorgente di eccitazione

6 FOCALIZZAZIONE IDRODINAMICA campione sheath fluid LASER

7 Diffrazione: proporzionale alle dimensioni della cellula rilevata lungo lasse della luce incidente 0° Rifrazione & Riflessione: proporzionale alla granularità cellulare e alla complessità rilevate a 90° rispetto la luce incidente. Generazione dei segnali di scatter SSC FSC GRANULOCITI MONOCITI LINFOCITI

8 La combinazione dei due tipi di segnali permette di ottenere un particolare diagramma di dispersione denominato CITOGRAMMA nel quale si possono evidenziare fino a 5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base alle sole caratteristiche fisiche

9 Sottopopolazioni leucocitarie in sangue periferico -Citogramma - -Citogramma - LINFOCITI MONOCITI LINFOCITI MONOCITI NEUTROFILI LINFOCITI MONOCITI NEUTROFILI EOSINOFILI LINFOCITI MONOCITI NEUTROFILI EOSINOFILI BASOFILI VOLUME VOLUME COMPLESSITA COMPLESSITA

10

11 Immunofenotipizzazione cellulare - definizione - Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla quantificazione ed alla localizzazione di strutture cellulari per mezzo di reagenti immunologici (anticorpi monoclonali).

12 Pubblicazioni Crescita delle applicazioni diagnostiche in citometria a flusso 1st references (2010)

13 Esperienza delloperatore Valutazione delle prestazioni e della stabilità della strumentazione Controlli di qualità (IQC, VEQ, EQAS) Requisiti per una buona analisi citometrica

14 Riproducibilità dei parametri di fluorescenza Linfoma Follicolare - diagnosi Linfoma Follicolare - MMR

15 Liquidi: Sangue periferico Aspirati Midollari Leucaferesi Liquor Liquidi cavitari Solidi: Linfonodi Biopsie Agoaspirati Materiali idonei per indagini in CFM

16 Regole per una corretta analisi citometrica in onco-ematologia Quesito diagnostico (dialogo con i clinici) Caratteristiche del campione da analizzare Scelta di adeguate combinazioni di anticorpi monoclonali Regolazione dello strumento e compensazione delle fluorescenze Strategie di gating per il riconoscimento delle popolazioni cellulari da analizzare Integrazione con i laboratori di morfologia, citogenetica e biologia molecolare Formulazione di una risposta adeguata e conclusiva

17 Metodo di studio in citometria Valutazione delle normali componenti cellulari del sangue midollare Valutazione dello stadio maturativo di tali componenti Dimostrazione della presenza nel campione di cellule anormali Eventuale dimostrazione della loro clonalità Evidenziazione di fenotipi peculiari allo scopo di identificare una determinata entità nosografica e/o utili per lasciare una traccia in corso di follow-up (MMR)

18 Espressione del CD45 nei leucociti

19 Sangue Periferico vs Sangue Midollare Sangue periferico Sangue midollare

20 Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER

21 MATURAZIONE MIELOIDE: granulocitopoiesi stem cellBlasto mieloide promieloc ita Mielo citagranulo cita CD66cCD13CD11bCD11aCD66bCD11cCD16CD64 Meta mielocita CD34 CD33CD15

22 stem cellBlasto mieloide promonoc ita Mono cita CD13CD33CD14CD11bCD36CD64 MATURAZIONE MIELOIDE monocitopoiesi CD34

23 0 100 PROMIELOMIELOMETAMIELOGRAN CD11b CD10 CD16 CD64 CD13 MATURAZIONE MIELOIDE: variabili di espressione

24 Interpretazione su CD66b/CD11b

25 BM normaleSindrome mielodisplastica + mature immature blocco maturativo blasti Maturazione Mieloide Interpretazione su CD66b/CD11b

26 CD16 CD15CD64 CD10 CD13 CD11b Maturazione mieloide in BM normale

27 CD16 CD15CD64 CD10 CD13 CD11b Maturazione mieloide in BM con MDS

28

29 Maturazione monocitaria in BM con LMMC

30 Mean values of bone marrow leucocyte populations A. Santagostino Cell count34.5 x 10 6 cell/ml (SD 28.0) Erythroid10.8% (SD 5.7) Lymphocytes12.4% (SD 5.9) CD361.4% (SD 15.1)CD429.3% (SD 11.3) CD830.8% (SD 13.1)NK11.2% (SD 9.2) CD1918.9% (SD 14.0) CD % (SD28.6) CD % (SD28.9) Monocytes (CD14)3.2% (SD 1.5) CD34+ cells0.9% (SD 0.7) Whole myeloid serie72.2% (SD 8.7) Immature/blast3.6% (SD 2.1) Promyelocytes12.3% (SD 6.3) Myelo and metamyelo28.4% (SD 11.4) band and mature48.9% (SD 15.5) Eosinophils1.9% (SD 1.5) Plasmacells0.4% (SD 0.3)

31 CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/ CD11b PE-Cy7/CD117 APC/CD45 APC-Cy7

32 NORMALE MDS Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER

33 Stetler-Stevenson, Blood 2001 Hypogranulation of PMN84% CD11b/CD16 abnormal70% CD13/CD16 abnormal78% CD64+ granulocytes66% CD10- granulocytes11% CD45-dim blasts53% CD56+ granulocytes21% CD56+ monocytes33% My-cells expressing non-My Ags38% MDS ABNORMALITIES BY FCM

34 CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/ CD11b PE-Cy7/CD56 APC/CD45 APC-Cy7

35 CD19 nucleare TdTCD22 citoplasmatico cµ CD10CD20 CD34 stem cellCellula pre-pre B Cellula pre B Cellula B citoplasmatico CD79a SmIg PROFILO ANTIGENCO Maturazione linfoide B

36 CD20 FITC/CD10 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/ CD38 PE-Cy7/CD19 APC/CD45 APC-Cy7

37 Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative MCL CLL CD22 FITC/CD200 PE/ CD19 PerCP-Cy5.5 / CD5 PE-Cy7/ CD23 APC /CD45 APC-Cy7

38 MCL CLL Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative Kappa FITC/Lambda PE/ CD20 PerCP-Cy5.5 / CD38 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7

39 Presenza o assenza di marcatori nelle M. Linfoproliferative MCLCLL

40 Espressione di ZAP-70 nelle CLL

41 VALUTAZIONE HCL CD103 FITC/CD11c PE/ CD20 PerCP-Cy5.5 / CD25 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7

42 VALUTAZIONE T-LDGL CD57 FITC/CD5 PE/ CD3 PerCP-Cy5.5 / HLA-DR PE-Cy7/ CD8 APC /CD45 APC-Cy7

43 ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK pattern atteso in una popolazione policlonale CD158a CD158b

44 ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+ pattern compatibili con lipotesi di clonalità CD158a CD158b

45 pattern compatibili con lipotesi di clonalità ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK pattern atteso in una popolazione policlonale

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47 VALUTAZIONE PLASMACELLULE

48 Immunofenotipo plasmacellule normali Combinazione MoAbFITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7APCAPC-H7HV-450 1CD138CD117CD20CD38CD56CD45CD19

49 Combinazione MoAbFITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7APCAPC-H7HV-450 1CD138CD117CD20CD38CD56CD45CD19 Immunofenotipo plasmacellule trasformate

50 CD19-CD56- CD19-CD56+ Immunofenotipo plasmacellule trasformate

51 Plasma cells: normal vs clonal Ocqueteau et al, AJP 152,1655,1998 Normal & reactive CD45+ CD38+++ CD138++ CD56- CD19+ CD117- k & l (polyclonal) CD20- MGUS CD45+/- CD38+++/++ CD138++ CD56-/+ CD19-/+ CD117- CD20- k &/or l (monoclonal in a proportion of PCs) Clonal CD56++ CD45- CD38++ CD138++ CD19- CD117-/+ CD20- k or l (monoclonal) CD45+ CD38+++ CD138++ CD56- CD19+ CD117- CD20- k & l (polyclonal) Myeloma CD56++ CD45- CD38++ CD138++ CD19- CD117-/+ CD20- k or l (monoclonal)

52 MM: dimostrazione di monoclonalità

53 IF1IF2IF3IF4 CD CD % PC<0.4>0.4NS Immunofenotipi plasmacellulari IF2 % PC=15 % PC=15% % PC=19% % PC=5% IF3 IF4 IF1

54 CD45 CD117CD56 CD38 fattori prognostici in CFM CD20 CD20+CD38dimCD45-CD56-CD117+ IF1///18/ IF2 331 IF IF TOT IF

55 Nuovi targets per la terapia contro il MM

56 SANGUE MIDOLLARE MM SANGUE PERIFERICO MM Presenza di PC-MM su Sangue periferico: SANGUE PERIFERICO NORMALE

57 Malattia Minima Residua A B DIAGNOSI MMR Sensibilità strumentale = 1/10000

58 Utilità della citofluorimetria nel paziente affetto da MM: distingue tra plasmacellule normali, reattive e patologiche determina eventuali fattori prognostici identificare nuovi targets per la terapia contro il mieloma unelevata sensibilità nel valutare la MMR possibilità di evidenziare PC-MM anche su sangue periferico Conclusioni (I)

59 Lanalisi multiparametrica multicolore consente una maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni cellulari.Lanalisi multiparametrica multicolore consente una maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni cellulari. E necessario applicare buone procedure di validazione strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei reagenti.E necessario applicare buone procedure di validazione strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei reagenti. Lelettronica digitale ha decisamente aiutato nella esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa impensabili.Lelettronica digitale ha decisamente aiutato nella esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa impensabili. Conclusioni (II)


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