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CORSO REGIONALE SULLA ROSOLIA CONGENITA Ancona 1° ottobre 2007 La conferma di laboratorio della rosolia Patrizia Bagnarelli. Istituto.

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1 CORSO REGIONALE SULLA ROSOLIA CONGENITA Ancona 1° ottobre 2007 La conferma di laboratorio della rosolia Patrizia Bagnarelli. Istituto di Microbiologia e Scienze Biomediche.

2 Determinazione dello stato immunitario Diagnosi di infezione acuta Verranno trattati a parte: la gestante l’infezione congenita Obiettivi della presentazione

3 Decorso dell’infezione acuta settimane 1 10 anni 4 6 mesi IgM IgG viremia rash diffusione Storia naturale dell’infezione da virus della Rosolia. La presenza e la diffusione del virus nel e dal faringe precede e segue l’esantema ( rash ), il paziente è infettivo dal momento dell’infezione fino a 1-2 settimane dopo la comparsa dell’esantema che, spesso, a parte la febbre, è l’unico sintomo clinico. La linfoadenomegalia è un segno prodromico, coincide con la viremia, precede febbre ed esantema, quest’ultimo può durare da 3 a 10 giorni. La presenza nel siero di anticorpi dosabili di classe IgM correla con la comparsa del rash che probabilmente è causato dalla formazione di immunocomplessi. Gli anticorpi di classe IgG vengono prodotti con un lieve ritardo e permangono determinabili nel siero per tutta la vita, documentando la pregressa infezione da virus della Rosolia.

4 - Presenza di IgG virus-specifiche = immunità - Assenza di IgG virus-specifiche = suscettibilità vaccinazione Determinazione dello stato immunitario

5 Diagnosi di laboratorio ~25% delle infezioni subcliniche ~25% delle infezioni subcliniche l’esantema può non apparire o essere confuso con quello sostenuto da enterov. l’esantema può non apparire o essere confuso con quello sostenuto da enterov. molti altri agenti causano sintomi identici molti altri agenti causano sintomi identici Sierologia Isolamento del virus Ricerca acido nucleico virale RNA

6 Diagnosi sierologica IgM IgM – Infezione acuta o recente (fino a 6 settimane dopo la scomparsa dei sintomi) – Viene utilizzata anche nel sospetto di sindrome rubeolica congenta (SRC), in quanto la persistenza del virus provoca nel feto la risposta IgM specifica a partire dalla 20 a settimana di gestazione, ed il riscontro di IgM nel bambino indica inequivocabilmente infezione intrauterina IgG IgG – Pregressa infezione o vaccinazione (protezione)

7 Diagnosi sierologica in gravidanza Al fine di utilizzare al meglio tutti i saggi diagnostici disponibili, la definizione dello stato immune dovrebbe essere accertato il più precocemente possibile all’inizio della gravidanza

8 Anticorpi IgM rosolia specifici Compaiono entro una settimana dall’esantema e sono evidenziabili per 6-8 settimane Nei primi 5 giorni dalla comparsa dell’esantema possono esserci dei falsi negativi

9 Cinetica delle IgM rosolia specifiche

10 Prelievo per anticorpi IgM specifici Va eseguito il più rapidamente possibile, preferibilmente entro 7-10 giorni dalla comparsa dell’esantema Se il prelievo è stato eseguito nei primi 5 giorni ed è risultato negativo, il test va ripetuto su un nuovo campione di sangue prelevato a distanza di qualche giorno

11 Metodica raccomandata per il dosaggio delle IgM La metodica raccomandata per la ricerca delle IgM è l’EIA (Enzyme Immune Assay) a cattura

12 ELISA O EIA DI TIPO CATTURA determinazione dell’anticorpo Siero Antigene virale e Coniugato MoAb anti virus ssSubstrato Anti IgM umane e

13 Criteri per la diagnosi di infezione acuta basata sulle IgM Comparsa ex novo: sieroconversione Se la sieroconversione non è documentabile: – – Presenza di IgM specifiche associata a sintomi clinici compatibili – – e/o IgG virus-specifiche a bassa avidità

14 Interpretazione di un risultato positivo per IgM specifiche La presenza di IgM specifiche è diagnostica di infezione rubeolica acuta se può essere dimostrata la sieroconversione (precedente risultato negativo) Ma …..

15 Problemi di interpretazione delle IgM specifiche persistere parecchi mesi IgM virus-specifiche possono persistere a valori sostanzialmente invariati per parecchi mesi o anche anni dopo l’infezione naturale o dopo la vaccinazione Reattività aspecifiche Reattività aspecifiche (falsi positivi) possono verificarsi in soggetti con altre infezioni virali (Parvovirus B19, CMV, EBV ) o affetti da malattie autoimmuni (fattore reumatoide positivo) Le IgM possono possono essere anche transitoriamente prodotte in seguito a reinfezione Le IgM possono possono essere anche transitoriamente prodotte in seguito a reinfezione

16 Approfondimenti sierologici Esiste dunque la possibilità di contemporanea presenza di IgG ed IgM in assenza di sintomi. Esiste dunque la possibilità di contemporanea presenza di IgG ed IgM in assenza di sintomi. Quando tale situazione riguarda una donna nelle prime 8-12 settimane di gravidanza, è importante effettuare un approfondimento diagnostico che ci permetta di datare l’infezione Quando tale situazione riguarda una donna nelle prime 8-12 settimane di gravidanza, è importante effettuare un approfondimento diagnostico che ci permetta di datare l’infezione Si utilizza un saggio sierologico in grado di valutare l’avidità degli anticorpi di classe IgG Si utilizza un saggio sierologico in grado di valutare l’avidità degli anticorpi di classe IgG

17 Il concetto di Avidità L’avidità di un anticorpo nei confronti di un antigene è espressa dalla capacità che ha l’anticorpo stesso di formare con l’antigene legami stabili

18 Avidità anticorpale  In seguito a qualsiasi infezione virale l’avidità anticorpale (espressione della maturazione della risposta immune) è scarsa nei primi mesi (fase acuta) (fase acuta)  L’avidità anticorpale, nei soggetti immunocompetenti, raggiunge la maturazione nei primi 4-6 mesi dopo l’infezione acuta (fase cronica/convalescenza) (fase cronica/convalescenza)  La valutazione della avidità IgG è correntemente impiegata per escludere una infezione recente in pazienti IgM+ (Toxo, CMV, Rosolia)

19 AVIDITA’ IgG Il saggio sfrutta il naturale processo di maturazione delle IgG che diventano con il tempo più affini per l’antigene che le ha evocate. Il saggio sfrutta il naturale processo di maturazione delle IgG che diventano con il tempo più affini per l’antigene che le ha evocate. Il che si traduce in un aumento della forza del legame tra queste IgG e l’antigene, un legame difficile da scindere con un tampone di dissociazione a base di urea o guanidinio 1M Il che si traduce in un aumento della forza del legame tra queste IgG e l’antigene, un legame difficile da scindere con un tampone di dissociazione a base di urea o guanidinio 1M Nel caso del virus della Rosolia le IgG maturano rapidamente nel corso dei 3 mesi successivi all’infezione Nel caso del virus della Rosolia le IgG maturano rapidamente nel corso dei 3 mesi successivi all’infezione –Il saggio fornisce importanti informazioni circa il tempo passato dall’infezione primaria –Anticorpi ad alta avidità indicano infezione contratta almeno 3-4 mesi prima o reinfezione.

20 AVIDITA’ IgG: il saggio In caso di contemporanea presenza di IgG ed IgM o di sieroconversione IgG, in assenza di sintomi, in una donna nelle prime 8-12 settimane di gravidanza Viene misurato il legame delle IgG all’antigene prima e dopo una lieve denaturazione Viene misurato il legame delle IgG all’antigene prima e dopo una lieve denaturazione Alta avidità Alta avidità – Infezione contratta almeno 3-4 mesi prima o reinfezione Bassa avidità Bassa avidità – Infezione recente

21 Test di Avidità L’avidità delle IgG con test Elisa si ottiene confrontando, per ogni siero ad opportuna diluizione, le densità ottiche ottenute con e senza trattamento del campione con soluzioni dissocianti di urea. La percentuale di IgG residue è tanto più bassa quanto maggiore è la quantità di IgG giovani, poco avide, scisse dal legame e rimosse dal lavaggio.

22 TEST DI AVIDITA’ EIA DI TIPO INDIRETTO siero urea sss s Viene calcolato il rapporto percentuale tra IgG residue dopo trattamento (quelle affini) e IgG totali (es. 1/3 = 33%)

23 Maturazione della avidità Ab dopo infezione acuta (indice di avidità ) Mesi dal contagio Indice di avidit � à (%)

24 Avidità delle IgG rosolia specifiche Una bassa percentuale di IgG ad alta avidità indica un’infezione recente Un’alta percentuale di IgG ad alta avidità indica un’infezione pregressa, anche se in presenza di IgM va valutata caso per caso (anamnesi, informazioni cliniche, altre eventuali indagini di laboratorio) La percentuale soglia varia a seconda del kit utilizzato

25 Infezione molto recente (<3 mesi): indice di avidità <20% Infezione molto recente (<3 mesi): indice di avidità <20% Infezione recente (3-6 mesi): Infezione recente (3-6 mesi): indice di avidità 21-34% Infezione pregressa da oltre 6 mesi: Infezione pregressa da oltre 6 mesi: indice di avidità >34% indice di avidità >34% Variazioni dell’avidità anticorpale e tempo trascorso dall’infezione (virus Rosolia)

26 Anticorpi IgG rosolia specifici Durano per tutta la vita La presenza di IgG anti-rosolia-specifiche su singolo campione indica immunità da pregressa infezione o vaccinazione Per diagnosticare un’infezione acuta solo sulla base delle IgG è necessario valutarne la cinetica

27 Prelievo per anticorpi IgG specifici Vanno eseguiti due prelievi: il primo entro 7-10 giorni dalla comparsa dell’esantema (fase acuta) il secondo almeno 2 settimane dopo (fase convalescente) I due campioni andrebbero esaminati con la stessa metodologia e nella stessa seduta analitica

28 Criteri per la diagnosi basata sulle IgG Sieroconversione tra il prelievo in fase acuta e quello convalescente, o Incremento di almeno 4 volte del titolo anticorpale tra il prelievo in fase acuta e quello convalescente

29 Diagnosi virologica di infezione acuta Isolamento virale Identificazione del genoma virale (RNA) tramite RT-PCR

30 Diagnosi diretta: isolamento Da tampone faringeo sei giorni prima del rash fino a una settimana dopo la comparsa Da tampone faringeo sei giorni prima del rash fino a una settimana dopo la comparsa Nel neonato infettato in utero risultano positivi tamponi faringei, feci, urine e CSF Nel neonato infettato in utero risultano positivi tamponi faringei, feci, urine e CSF Cresce su cellule Vero con un modestissimo effetto citopatico, viene identificata mediante interferenza eterologa con Echo 11, o DFA in shell-vial Cresce su cellule Vero con un modestissimo effetto citopatico, viene identificata mediante interferenza eterologa con Echo 11, o DFA in shell-vial

31 Diagnosi diretta: RT-PCR Nel sospetto non chiarito da altri test di un’infezione primaria in gravidanza, la ricerca dell’RNA genomico, in differenti campioni clinici del neonato o in campioni di villi coriali o liquido amniotico, può essere effettuata con rapidità sensibilità e specificità mediante RT- PCR con sonde specifiche solitamente per il gene E1. Nel sospetto non chiarito da altri test di un’infezione primaria in gravidanza, la ricerca dell’RNA genomico, in differenti campioni clinici del neonato o in campioni di villi coriali o liquido amniotico, può essere effettuata con rapidità sensibilità e specificità mediante RT- PCR con sonde specifiche solitamente per il gene E1.

32 Prelievi per diagnosi virologica Campioni biologici (tampone faringeo, urine, saliva, sangue, liquido amniotico, etc) Raccolti entro una settimana dall’esordio dell’esantema o alla nascita o dalla 20° settimana di gestazione Conservati e trasportati mantenendo la catena del freddo Trasportati al laboratorio entro 24 ore dalla raccolta La diagnosi virologica viene eseguita in centri di riferimento

33 Quali sono gli esami per la conferma di laboratorio Sieroconversione Sieroconversione IgM specifiche, confermate da altri testi o sintomi clinici IgM specifiche, confermate da altri testi o sintomi clinici Incremento significativo delle IgG specifiche Incremento significativo delle IgG specifiche Isolamento virale Isolamento virale Genoma virale identificato tramite RT-PCR Genoma virale identificato tramite RT-PCR

34 La conferma di laboratorio i test sierologici indiretti Sieroconversione: comparsa ex novo di anticorpi IgM o IgG virus-specifici Sieroconversione: comparsa ex novo di anticorpi IgM o IgG virus-specifici Nota: ci deve essere un precedente test negativo! Positività IgM: deve essere associata a sintomi clinici compatibili e/o di a un test positivo per IgG specifiche a bassa avidità. Positività IgM: deve essere associata a sintomi clinici compatibili e/o di a un test positivo per IgG specifiche a bassa avidità. Incremento IgG: Aumento di almeno 4 volte rispetto ai livelli iniziali. Incremento IgG: Aumento di almeno 4 volte rispetto ai livelli iniziali. –Il primo campione prelevato entro 7-10 giorni dalla comparsa dell’esantema o subito dopo il contatto con un soggetto infetto (fase acuta) –il secondo almeno 2 settimane dopo (fase convalescente) –per dimostrare l’incremento, i due campioni devono essere esaminati nel corso della stessa seduta analitica.

35 La conferma di laboratorio i test virologici diretti Isolamento virale: da campione biologico (sangue, urine, tampone faringeo, saliva), raccolto entro 4 giorni dalla comparsa dall’esantema. Isolamento virale: da campione biologico (sangue, urine, tampone faringeo, saliva), raccolto entro 4 giorni dalla comparsa dall’esantema. Nota: i 4 giorni dall’esantema rappresentano il periodo ottimale, ma il virus della rosolia può essere isolato da una settimana prima fino a 2 settimane dopo la comparsa dell’esantema. RT-PCR: test positivo per RNA virale mediante la metodica di RT-PCR, su un campione biologico raccolto come sopra. RT-PCR: test positivo per RNA virale mediante la metodica di RT-PCR, su un campione biologico raccolto come sopra.

36 Numero di casi notificati di rosolia e copertura vaccinale per vaccino MPR entro 24 mesi di età. Nel 2005 notificati in tutta Italia 9 casi di sospetta infezione in gravidanza confermata in 7 casi

37 Valutazione dello stato immune in una popolazione femminile seguita presso la SOD Virologia nel 2006 (717 donne >20 anni; 598 italiane, 119 straniere) Positività per IgG 90,9% (652/717) Positività per IgG 90,9% (652/717) Negatività per IgG 9,1% (65/717) Negatività per IgG 9,1% (65/717) –Frequenza di negatività > tra le straniere (21/119 17,6%) che tra le italiane (44/598 7,3%) Positività per IgM 3.9% (28/717), 5/28 straniere Positività per IgM 3.9% (28/717), 5/28 straniere –2/28 post-vaccinazione (italiane) –1 non ulteriormente indagato (straniera) Avidità delle IgG eseguita in 25/28 IgM positive Avidità delle IgG eseguita in 25/28 IgM positive –Valore medio: 2 casi; Valore alto: 23 casi (92%)


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