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Corso di formazione integrata scientifica e tecnologica (A.S. 2002/03) Corso di formazione integrata scientifica e tecnologica (A.S. 2002/03)

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Presentazione sul tema: "Corso di formazione integrata scientifica e tecnologica (A.S. 2002/03) Corso di formazione integrata scientifica e tecnologica (A.S. 2002/03)"— Transcript della presentazione:

1 Corso di formazione integrata scientifica e tecnologica (A.S. 2002/03) Corso di formazione integrata scientifica e tecnologica (A.S. 2002/03) Aspetti chimico-fisici e biologici dellambiente "suolo" Modulo 6: Aspetti chimico-fisici e biologici dellambiente "suolo" Daniela Lippi e Maria Rita De Paolis Istituto di Biologia Agroambientale e Forestale Area della Ricerca di Roma1 Montelibretti - Consiglio Nazionale delle Ricerche

2 Calendario degli incontri del modulo 6: Aspetti chimico-fisici e biologici dellambiente "suolo 1. Ecosistema suolo06/02 Artov 2. Pedogenesi20/02 Mlib 3. Turnover della sostanza organica nel suolo27/02 Mlib 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo06/03 Mlib 1. Ecosistema suolo06/02 Artov 5. Ciclo dellAzoto13/03 Mlib 6. Ciclo del Carbonio20/03 Mlib 2. Pedogenesi20/02 Mlib 3. Turnover della sostanza organica nel suolo27/02 Mlib 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo06/03 Mlib

3 Aspetti chimico-fisici e biologici dellambiente "suolo" 5. Ciclo dellAzoto Azotofissazione Parte teoricaEsperienze di laboratorio Introduzione Mineralizzazione Analisi di attività batteriche Azotofissazione Dosaggio proteine Immobilizzazione

4 5. Ciclo dellazoto La dipendenza reciproca di tutte le forme di vita sulla terra è dimostrata nei cicli biogeochimici dei principali elementi nutritivi; in particolare nei cicli dell'Azoto e del Carbonio nei quali troviamo una componente geochimica e una componente biologica Riserve di azoto x t Litosfera 95-98% Atmosfera 2-5% Biosfera 0,01% Ciclo molto complesso: Tutti presenti, ma prevale la forma ridotta (-3), 90% in natura e 100% nella biosfera Quindi: NH 3 e NH 4 + Composti solidi, liquidi e gassosi Solubili e insolubili N° ossidazione da +5 a -3 Passaggi pluridirezionali Numerosi ingressi e uscite Attività antropiche Difficoltà di valutare il bilancio Introduzione

5 L'azoto è il nutriente più richiesto da tutti gli organismi viventi e diviene spesso il fattore limitante Anche per quanto riguarda la capacità di assumere azoto gli organismi viventi si possono suddividere nelle tre grandi categorie: organismi fotosintetici (produttori) assimilano azoto solamente sotto forma di ammonio o nitrati animali assimilano azoto organico come proteine e aminoacidi microrganismi decompongono e mineralizzano il materiale organico, liberando CO 2 e NH 3

6 Rappresentazione schematica del ciclo dellazoto Assimilazione riduttiva del nitrato Assimilazione dellammonio Ammonificazione Nitrificazione Fissazione dellazoto Denitrificazione o dissimulazione riduttiva del nitrato (-1) NH 2 OH (+1)N 2 O (+2) NO N2 N2 (+5) NO 3 Biomassa (-3) N (-3) NH 3 (+3) NO 2 Atmosfera Biosfera

7 5. Ciclo dellazoto Esclusa l'atmosfera, l'azoto è presente quasi esclusivamente in forma ridotta e viene incorporato come ammonio nelle proteine, negli acidi nucleici e negli altri composti organici nelle cellule degli organismi viventi. Anche le riserve di azoto nel suolo sono nella forma ammoniacale: come sostanza organica (residui vegetali e animali o fertilizzanti) come forma minerale adsorbita sulle rocce, fillosilicati in grado di legare gli ioni ammonio. Nel suolo esiste un ciclo interno, distinto dal ciclo complessivo, che porta all'interscambio di azoto inorganico (NO 3 - e NH 4 + ) con quello organico. Mineralizzazione Immobilizzazione Azoto organico NH 4 + NO 3 - Immobilizzazione

8 Biomassa (-3) N (+5) NO 3 (+1) N 2 O (+2) NO N2N2 Biomassa (-3) N (-3) NH 3 (+3) NO 2 (+5) NO 3 (-1) NH 2 OH Assimilazione riduttiva del nitrato La scelta dipende dalla specie vegetale, dalla temperatura e dal pH della soluzione circolante nel terreno perchè: nitrati (ione - ) in soluzione più disponibili ammonio (ione + ) "fissato" sullargilla meno disponibile La riduzione del nitrato avviene in due stadi ad opera di due enzimi specifici: nitrito riduttasi nitrato riduttasi molibdo-flavo proteina che catalizza il trasferimento di elettroni per la riduzione del nitrato a nitrito ferro-zolfo proteina che riduce il nitrito ad ammonio utilizzando come donatore di elettroni la ferridossina ridotta, generata dalla fotosintesi Le piante assorbono solo ioni nitrato e ammonio

9 Struttura e funzione degli enzimi 1. Gli enzimi (catalizzatori biologici) sono proteine globose, formate da più sub-unità. Presentano uno o più siti attivi dove avviene il legame con il substrato che innesca la reazione. 3. Al termine lenzima è inalterato e pronto per catalizzare un'altra reazione. 2. La perfetta complementarietà tra enzima e substrato garantisce la specificità. 2 3 Prodotti di reazione * * 1 Substrato Enzima * * Siti attivi

10 La nitrato riduttasi è un complesso enzimatico che ha la funzione di catalizzare il trasferimento di 2 elettroni dal NAD(P)H 2 (piridin-nucleotide, donatore di elettroni) al nitrato (+5) che si riduce a nitrito (+3) E costituito da due parti non separabili fisicamente: una contiene il FAD (Flavin adenin dinucleotide) ed ha il sito attivo per il NAD(P)H una contiene Molibdeno e porta il sito attivo per il nitrato Porta associato anche un citocromo HNO 3 + 2e - + 2H + HNO 2 + H 2 O Il FAD, il citocromo e il molibdeno formano una catena di trasporto attraverso la quale gli elettroni sottratti al NAD(P)H arrivano al nitrato che si riduce a nitrito Il molibdeno è un elemento indispensabile per le piante NO 3 - NO 2 - NADPH 2 NADP + FAD Citocromo Mo

11 Assimilazione dellammonio Lassimilazione avviene attraverso reazioni catalizzate da diversi enzimi: Aminazione: trasferimento di NH 4 + a chetoacidi amminoacidi Transaminazione: trasferimento del gruppo amminico (NH 2 - ) da un amminoacido a un chetoacido Gli amminoacidi sono molto più numerosi dei 20 costituenti principali delle proteine Gli animali ne formano solo 8; nelle piante ne sono stati isolati oltre 50 liberi (+1) N 2 O (+2) NO N2N2 Biomassa (-3) N (-3) NH 3 (+3) NO 2 (+5) NO 3 (-1) NH 2 OH (-3) NH 3 Biomassa (-3) N H R

12 La mineralizzazione è il processo di degradazione operato dagli organismi decompositori che porta alla formazione di azoto minerale nitrico e ammoniacale, detti azoto scambiabile Nel suolo è in equilibrio con limmobilizzazione che è la simultanea sintesi di nuova biomassa Lazoto potenzialmente mineralizzabile è l'8-15% dell'azoto totale Il contenuto varia con il tempo, da sito a sito e in funzione della temperatura, del pH, dell'ossigenazione, delle condizioni idriche, della vitalità della biomassa, del tipo di sostanza organica, ecc. Anche le più comuni pratiche agricole influenzano le trasformazioni dell'azoto organico: lavorazioni del terreno, irrigazione, fertilizzazione, tipo di coltura Processo molto lento: 1) le proteine formano complessi con i costituenti poco degradabili dell'humus, per esempio la lignina e formano ligno-proteine, 2) le proteine vengono intrappolate e trattenute nell'argilla Difficile e complesso valutare il potere di mineralizzazione di un suolo 5. Ciclo dellazoto Mineralizzazione

13 Ammonificazione - Prima fase della mineralizzazione (+1) N 2 O (+2) NO N2N2 Biomassa (-3) N (-3) NH 3 (+3) NO 2 (+5) NO 3 (-1) NH 2 OH (-3) NH 3 Biomassa (-3) N Microrganismi eterotrofi decompositori: batteri, funghi, attinomiceti ( /g) Ammonificazione: proteolisi aerobica di proteine e acidi nucleici con formazione di amminoacidi e basi Putrefazione: decomposizione anaerobica delle proteine con formazione di ammine e altri composti organici volatili In serie, per mezzo di enzimi extracellulari, arrivano a liberare NH 3 con due processi

14 (+1) N 2 O (+2) NO N2N2 Biomassa (-3) N (-3) NH 3 (+3) NO 2 (+5) NO 3 (-1) NH 2 OH (-3) NH 3 (+3)NO 2 - (+5)NO 3 - Nitrificazione Ossidazione dellammonio a ione nitrico in due fasi per opera di batteri aerobi chemiolitotrofi obbligati NH 4 + NO 2 - Nitrosomonas Nitrosococcus Nitrosospira NO 2 - NO 3 - Nitrobacter Nitrococcus Nitrospira Le reazioni liberano notevoli quantità di energia, utilizzata per le biosintesi cellulari

15 Denitrificazione o dissimulazione riduttiva del nitrato (+1) N 2 O (+2) NO N2N2 Biomassa (-3) N (-3) NH 3 (+3) NO 2 (+5) NO 3 (-1) NH 2 OH (+1) N 2 O (+2) NO (+5) NO 3 (+3) NO 2 N2 N2 Tre meccanismi chimici dipendono dal pH volatilizzazione diretta dellammoniaca pH 7 decomposizione spontanea dei nitriti con emissione di ossidi di azoto pH 5,5 reazioni spontanee di acido nitroso con amminoacidi o sali di ammonio ed emissione di N 2 La via microbiologica è la più importante: produce N 2 e N 2 O Lazoto nitrico viene ridotto ed allontanato in forma gassosa con diversi meccanismi

16 La denitrificazione microbiologica è, idealmente, linverso della nitrificazione Avviene nel suolo e nelle acque in ambiente riducente, cioè privo di ossigeno che è il fattore principale di controllo di questo processo Soltanto alcuni batteri chemioeterotrofi anaerobi facoltativi, Pseudomonas e Bacillus, sono capaci di compiere questo tipo di respirazione che ha come risultato lemissione e non lassimilazione di N 2 Anche in suoli dotati di buona aerazione si possono trovare, allinterno degli aggregati, micrositi ad alta attività denitrificante La reazione globale, catalizzata dalla nitrato riduttasi, è 2 HNO H e - N H 2 O il trasporto degli elettroni avviene attraverso la catena dei citocromi Pseudomonas fluorescens Bacillus cereus E una respirazione anaerobica che utilizza il nitrato come accettore di elettroni

17 5. Ciclo dellazoto La fissazione biologica è il processo più importante attraverso il quale l'azoto molecolare inorganico viene ridotto e fissato in una forma molecolare organica Per questa via viene inserito nel processo di mineralizzazione-immobilizzazione e messo a disposizione degli organismi produttori e di conseguenza di tutti gli altri Fissazione industriale (processo Haber-Bosch) N H 2 2NH 3 * Alta temperatura ( °C) * Alta pressione ( atm) * Catalizzatore: miscela Fe-Mo * Resa 20-40% di NH 3 * Produzione 70 milioni di t annue * Alto inquinamento ( 50% perso) * Alti costi Fissazione biologica * Temperatura ( 30°C) Necessita anchessa di molta energia e di un catalizzatore * Pressione normale * Nitrogenasi: Mo-Fe proteina * Varia con condizioni ambientali * Produzione 200 milioni di t annue * Arricchimento naturale del suolo * Pronta disponibilità Azotofissazione

18 I microrganismi capaci di fissare l'azoto atmosferico sono detti azotofissatori o diazotrofi. Appartengono ad alcune famiglie di batteri e di Cianoficee (alghe verdi-azzurre). Possono essere Rizosfera Attività bassa Tubercoli radicali Attività alta LiberiSimbionti Azotobacter Beijerinckia Derxia Spirillum Enterobacter Klebsiella Clostridium Desulfovibrio Chlorobium Rhizobium Actinomyces Frankia AerobiAnaerobiBatteriCianoficee Nostoc Anabaena o

19 Fe-proteinaMo-Fe-proteina N2N2 2NH 3 Mg-ADP+Pi Mg-ATP NADH NAD + Ferridossina ossidata Ferridossina ridotta e-e- La nitrogenasi, enzima responsabile dell azotofissazione biologica, è un complesso enzimatico costituito da due proteine distinte, indispensabili: Nitrogenasi e suo meccanismo di azione la dinitrogenasi riduttasi, una ferro-proteina formata da due subunità identiche contenenti 4 atomi di Fe e 4 di S la dinitrogenasi, una molibdo-ferro-proteina formata da 4 subunità contenenti 2 atomi di molibdeno, atomi di Fe e gruppi SH Una serie di reazioni riduce l'azoto ad ammoniaca attraverso trasferimenti di elettroni. Il primo trasferimento alla Fe-proteina avviene con un flusso casuale mentre in seguito essa li trasferisce singolarmente alla Mo-Fe-proteina. Ciò deve essere ripetuto più volte affinché la Mo-Fe-proteina sia in uno stato sufficientemente ridotto, da consentirle di ridurre l N 2

20 Proprietà della nitrogenasi Nel 1966 si è scoperto che la nitrogenasi agisce anche riducendo lacetilene ad etilene, rompendo uno dei tre legami tra gli atomi di Carbonio. HC CH H 2 C CH 2 (1) N N HN NH (2) Basandosi sul dosaggio gascromatografico della riduzione dellacetilene (reazione 1) è stato possibile caratterizzare la nitrogenasi e valutare la quantità di azoto fissato (reazione 2) Le due proteine componenti della nitrogenasi vengono inattivate dallossigeno La capacità di ridurre lazoto è molto più diffusa tra i microrganismi anaerobi Gli azotofissatori aerobi attuano diversi meccanismi fisiologici per proteggere la nitrogenasi dal danno da ossigeno: Controllo genetico Microaerofilia Protezione respiratoria Protezione conformazionale Barriere fisiche Proteine specifiche

21 Azotofissazione simbiotica Lazotofissazione (batteri) è accoppiata direttamente alla fotosintesi (piante) La più nota è la simbiosi tra Rizobi e Leguminose Batteri Gram-negativi, aerobi, mobili, di forma bastoncellare, possono anche vivere come eterotrofi nel suolo: per g Circa 600 generi e specie, includono piante arboree, arbustive, erbacee ed anche acquatiche. Un buon prato di trifoglio arriva a fissare Kg di azoto per ettaro. Neoformazioni radicali: Noduli Simbiosi specifica Rizobi compatibiliEfficienza Certe Acacie tropicali possono fissare fino a 200 Kg/ha/anno

22 Rhizobium Pelo radicale Formazione del tubo dinfezione Noduli Infezione del pelo radicale 1) adesione dei rizobi ai peli radicali a seguito di segnali molecolari tra pianta e ospite: induzione geni nod 2) incurvamento dei peli radicali 3) inizio e sviluppo del filo di infezione 4) rilascio e moltiplicazione dei batteri, avvolti dalla membrana, all'interno delle cellule corticali dell'ospite 5) trasformazione dei batteri in batteroidi, 10 volte più grandi, che non si dividono 6) sintesi della leg-emoglobina nel citoplasma della cellula vegetale 7) sintesi della nitrogenasi (geni nif) e fissazione dell'azoto 8) degenerazione del nodulo e liberazione dei rizobi nel terreno dove riprendono la forma di cocchi Processo di infezione e formazione dei noduli Bastoncini mobili Batteroidi Cocchi immobili Ciclo dei rizobi nel suolo (1) (5) (8)

23 N organico NH 4 + riserve NH 4 + soluzione NH 4 + N organico Scambi di ammonio, nel suolo, tra riserve e soluzione circolante 2. Assimilazione degli ioni ammonio da parte dei vegetali 3. Restituzione al suolo dei residui vegetali Scomposizione del ciclo dellazoto Si può immaginare di scomporre il ciclo dellazoto in tre sottocicli che si svolgono in ambiti sempre più ampi 1° - Flusso di ammonio tra suolo e piante

24 N organico NH 4 + riserve NH 4 + soluzione NH 4 + N organico NO 3 - soluzione NO Nitrificazione 1. Assimilazione dei nitrati 2. Deposizione al suolo dei residui vegetali 3. Ammonificazione = degradazione dei residui vegetali 2° - Processi ossidoriduttivi tra suolo e organismi viventi

25 N organico NH 4 + riserve NH 4 + N organico NO NH 4 + soluzione N 2 NO 3 - soluzione 1. Azotofissazione (3. Nitrificazione) 2. Denitrificazione 3° - Processi ossidoriduttivi tra suolo e atmosfera

26 Dosaggio di proteine in una coltura batterica Lowry et al. (1951) Preparazione del materiale Soluzioni NaOH 1 N NaOH 0,1 N Na 2 CO 3 2% in NaOH 0,1 N CuSO 4 5H 2 O 1% in H 2 O distillata Tartrato di sodio 2% in H 2 O distillata o potassio Prima di procedere al dosaggio delle proteine in una coltura batterica è necessario disegnare su carta millimetrata la curva di taratura utilizzando una soluzione a concentrazione nota di Albumina Assorbanza g/ml proteine 5. Ciclo dellazoto Analisi di attività batteriche

27 Idrolizzare i campioni nel modo seguente: centrifugare per 20 minuti a giri/min 3 ml di coltura batterica risospendere il pellet in 3 ml di soluzione NaOH 1N prelevare (in doppio) 1 ml della sospensione ottenuta e metterlo in una provetta di vetro; chiudere ciascuna provetta con carta dalluminio mettere le provette a bollire per 10 minuti

28 preparare la miscela di reazione nella quantità necessaria, mescolando con le seguenti proporzioni le soluzioni: Na 2 CO 3 10 ml CuSO 4 5 H 2 O0,1 ml Tartrato di sodio o potassio 0,1 ml prelevare dalle provette del campione bollito 0,8 ml e metterli in unaltra provetta aggiungere 4 ml della miscela di reazione lasciare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti aggiungere 0,4 ml di reagente Folin e mettere le provette al buio per 30 minuti Proseguire con il metodo di Lowry per la determinazione delle proteine:

29 valutare la quantità di proteine dei campioni dalla curva di taratura N.B. La lettura del campione allo spettrofotometro deve essere fatta contro un bianco (H 2 O) sottoposto alle stesse reazioni del campione leggere lassorbanza allo spettrofotometro ad una lunghezza donda di 500 nm Assorbanza g/ml proteine

30 Gascromatografia o cromatografia in fase gassosa Fase mobile Gas fluisce attraverso la colonna Tecnica di separazione di miscele Fase stazionaria Solido granulare poroso riempie la colonna I meccanismi di separazione sono due: adsorbimento Dipende dalla diversa forza dei legami con cui le molecole del campione sono trattenute sulla superficie delle particelle solide che riempiono la colonna esclusione molecolare Fase stazionaria costituita da solido granulare poroso che trattiene le molecole aventi ingombro inferiore al diametro dei pori ed escludendo le altre che vengono eluite con il gas di trasporto Azotofissazione: saggio della riduzione dellacetilene


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