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BKV:Analisi quantitativa mediante RealTime PCR Firenze 20 Novembre 2004 Web:www.genedia.itWeb:www.genedia.it.

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2 BKV:Analisi quantitativa mediante RealTime PCR Firenze 20 Novembre 2004 Web:www.genedia.itWeb:www.genedia.it

3 La Reazione di PCR 5’ 3’ d. NTPs DNA TAQ Polymerase Primers 5’ 3’ 5’3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Aggiungere Master Mix e Campione Denaturazione 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Annealing Aggiungere al Tubo di reazione DNA Templato

4 Inizio Estensione 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Fine Estensione 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Taq 3’ 5’ 3’ Taq 5’ Repliche La Reazione di PCR Annealing

5 5’3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’3’ 5’ 3’ Ciclo 2 4 Copie Ciclo 3 8 Copie 5’ 3’ 5’ 3’ 5’3’ 5’ 3’ 5’3’ 5’ 3’ 5’3’ 5’ 3’ 5’3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’3’ 5’ 3’ La Reazione di PCR

6 CicliQuantità Relativa ( x)= numero iniziale di copie ….…….. Y = X ( 1+  ) N-1 Y= Quantità Finale di DNA Amplificato X= Quantità di DNA portato in PCR  = Efficienza di Amplificazione N= Numero dei Cicli

7 Curva di Amplificazione-PCR Incremento Esponenziale segue quello Lineare Incremento Esponenziale segue quello Lineare Incremento Esponenziale Limitato Incremento Esponenziale Limitato Plateau Plateau Il plateau non è correlato alla quantità iniziale di DNA Il plateau non è correlato alla quantità iniziale di DNA Cicli # TeoricoReale Log. DNA Amplificato

8 Fase Esponenziale Fase Plateau Curva di Amplificazione-PCR

9 Qual è l’intervallo migliore per ottenere informazioni di tipo quantitativo? Durante la fase esponenziale:Durante la fase esponenziale: -Non c’è nessun fattore limitante -I prodotti di amplificazione si formano alla stessa velocità -Bisogna monitorare la reazione così come avviene!

10 Cos’è la Real Time PCR? E’ una tecnica per monitorare la reazione di amplificazione così come avviene. E’ una tecnica basata sulla Fluorescenza: l’emissione della fluorescenza è direttamente correlata alla quantità di DNA amplificato. Perchè la Real Time PCR? Per quantificare il DNA (e per l’analisi e detezione di mutazioni)

11 96 repliche di una identica reazione possono avere singole efficienze molto diverse in prossimità della fine del processo, ma..

12 ..ma il Ciclo Soglia (Threshold Cycle,C t ) di tali repliche mostra valori molto simili.

13 Che cos’è il Ciclo Soglia (C T )? CTCTCTCT Il Ciclo Soglia (CT) è il ciclo della Reazione di Amplificazione in corrispondenza del quale il segnale di fluorescenza emesso dal campione supera il valore della threshold.

14 Ciclo Soglia (C T )  E’ strettamente correlato con la quantità iniziale di copie di DNA.  E’ lineare con il log del numero iniziale di copie fino a 6 o più ordini di grandezza. Qual è la quantità maggiore ? Quella Minore?

15 BKV c/mlC t 1.53E E E E ml di urina estratta Ciclo Soglia (C T )

16 Il Ciclo Soglia C T è un indicatore del numero iniziale di copie.

17 Analisi quantitativa: calcolo efficienza di PCR  = [10 (-1/s) ] - 1 dove  = efficienza s = slope ses =  = 1.00 (100%) ses =  = 1.21 (121%) ses =  = 0.9 (90%) Per diluizioni seriali: C T2 -C T1 = log (N1/N2)/log (1+  ) dove:N1/N2 = fattore di diluizione CT1 e CT2 = rispettivi cicli soglia se N1/N2 = 2 e  =1, C T2 -C T1 = 1 se N1/N2 = 10 e  =1, C T2 -C T1 = 3.322

18 Curva di calibrazione per BKV

19 Quale chimica possiamo usare? Come possiamo mettere a punto una tecnica di Real Time PCR? Real Time PCR? Come possiamo mettere a punto una tecnica di Real Time PCR? Real Time PCR?

20 IntercalantiIntercalanti Russ Higuchi ha dimostrato il principio chiave della Real Time PCR usando Bromuro di Etidio EtBr emette fluorescenza fino a 25 volte quando si lega al dsDNA Il SYBR Green, un intercalante più sensibile, fornisce un approccio maggiormente interessante SYBR Green emette fluorescenza fino a 200 volte quando si lega al dsDNA

21 5’ 3’ d. NTPs Thermal Stable DNA Polymerase Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Aggiungere la Master Mix al campione Denaturazione 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’3’ 5’3’ Annealing Tubo di reazione IntercalantiIntercalanti Intercalanti Taq ID Templato

22 Estensione 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Estensione Terminata Si applica una eccitazione (a 490 nm per SYBR Green) 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Taq 3’ 5’ 3’ Taq 5’ Emissione (a 540 nm per SYBR Green) IntercalantiIntercalanti ID Annealing

23 Curva di Dissociazione Eseguire una Curva di Dissociazione alla fine di un esperimento di Real Time PCR in cui si utilizza SYBR green, consente di vedere se è presente una sorgente non specifica di fluorescenza nella PCR.Eseguire una Curva di Dissociazione alla fine di un esperimento di Real Time PCR in cui si utilizza SYBR green, consente di vedere se è presente una sorgente non specifica di fluorescenza nella PCR. Senza Curva di Dissociazione non si ha la certezza che la fluorescenza osservata è correlata realmente al frammento atteso.Senza Curva di Dissociazione non si ha la certezza che la fluorescenza osservata è correlata realmente al frammento atteso.

24 Curva di Dissociazione Che cosa è?  La Curva di Dissociazione determina un progressivo incremento della temperatura finchè la doppia elica del DNA si apre completamente  Questa temperatura viene detta “Tm” (temperatura di Melting) ed è caratteristica per ogni frammento di DNA.  Il Tm dipende infatti dal N° e dal tipo di basi presenti

25 Curva di Dissociazione Come si può determinare la temperatura di melt?  Si sfrutta il fatto che il SYBR Green emette fluorescenza maggiormente quando è legato al dsDNA piuttosto che quando è legato al ssDNA.  Così, man mano che la temperatura aumenta i filamenti del DNA si aprono, ed il segnale di fluorescenza decade.

26 La riduzione della fluorescenza all’aumentare della temperatura Si può vedere direttamente la riduzione della fluorescenza all’aumentare della temperatura (in Real Time!) Si può vedere direttamente la riduzione della fluorescenza all’aumentare della temperatura (in Real Time!)

27 AmplificatoBKV Aspecific o Rivelazione di amplificati non specifici

28 Qual è la temperatura migliore per acquisire la fluorescenza nelle determinazioni quantitative?

29 Set-up utilizzato per la determinazione quantitativa di BKV 10 µl DNA estratto+ 40 µl Master MIX Composizione Master Mix H 2 O qb a 40 µl RealT.Buffer15 µl Primer BK1(25 µM) 1 µl Primer BK2(25 µM) 1 µl MgCl 2 (25 mM) 6 µl Taq Gold (5 U/µl)0.5 µl UDG heat-lable (1U/µl)1 µl

30 Set-up utilizzato per la determinazione quantitativa di BKV 1 ciclo20°C 10 min94°C 6 min 2 cicli94°C 1 min55°C 1 min72°C 1 min 40 cicli94°C 30 sec55°C 30 sec72°C 30 sec82°C 10 sec lettura Curva di meltda 55°C a 95°C (incremento 0.5°C) Storage72°C

31 Disegno dei primers (BK1/BK2) Lunghezza amplificato (compresi primers BK1 e BK2): 366 bp Lunghezza BK1:36 bp Lunghezza BK2: 25 bp Sequenza Virus BKV DN 1ttttgcaaaa attgcaaaag aatagggatt tccccaaata gttttgctag gcctcagaaa 61 aagcctccac acccttacta cttgagagaa agggtggagg cagaggcggc ctcggcctct 121 tatatattat aaaaaaaaag gccacaggga ggagctgctt acccatggaa tgcagccaaa 181 ccatgacctc aggaaggaaa gtgcatgact cacaggggaa tgcagccaaa ccatgacctc 241 aggaaggaaa gtgcatgact cacagggagg agctgcttac ccatggaatg cagccaaacc 301 atgacctcag gaaggaaagt gcatgacaga catgttttgc gagcctagga atcttggcct 361 tgtccccagt taaactggac aaaggccatg gttctgcgcc agctgtcacg acaagcttca 421 etc………….

32 Foto gel amplicone (366 bp) POS POS POS MVIII POS POS NEG BIANCO

33 Conclusioni (riproducibilità)

34 Conclusioni (linearità)


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