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UNIVERSITA’ DI MILANO-BICOCCA LAUREA MAGISTRALE IN BIOINFORMATICA

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Presentazione sul tema: "UNIVERSITA’ DI MILANO-BICOCCA LAUREA MAGISTRALE IN BIOINFORMATICA"— Transcript della presentazione:

1 UNIVERSITA’ DI MILANO-BICOCCA LAUREA MAGISTRALE IN BIOINFORMATICA
Corso di BIOINFORMATICA: TECNICHE DI BASE Prof. Giancarlo Mauri Lezione 9 Pattern discovery

2 Il problema Abbiamo un insieme di sequenze (DNA o proteine) non allineate e funzionalmente correlate Sappiamo che: tutte le sequenze (o la maggior parte di esse) contengono regioni “simili” tra loro le regioni comuni potrebbero essere responsabili della funzione delle sequenze Problema: esiste un metodo efficiente e affidabile per trovare tali regioni?

3 Un problema più generale: confronto di sequenze
Obiettivo: individuare regioni simili all’interno di due o più sequenze per scoprire origine evolutiva comune funzioni comuni Per le biosequenze (DNA, RNA e proteine), una forte similarità di solito implica una significativa similarità funzionale o strutturale Esempi: Similarità tra l’oncogene n-sys del virus del sarcoma delle scimmie e il gene del fattore di crescita PDGF (Doolittle 83, Waterfield, 83). Similarità tra i geni delle globine nell’uomo e nello scimpanzè Il confronto di seq. Su larga scala, di solito nella forma di ricerca in un DB, è uno strumento molto potente per l’inferenza biologica nella biologia molecolare moderna, ed è universalmente usato dai biol. Mol. . La scoperta di un legame tra geni che causano il cancro e geni coinvolti normalmente nel processo di crescita è stato il primo risultato significativo nel confronto di sequenze.

4 Quanto simili? Identiche
Con nucleotidi diversi permessi in alcune posizioni Con mutazioni (in generale) Con inserzioni e/o delezioni Con alcune parti conservate separate da regioni casuali All of the above(??)

5 Mutazioni in posizione fissa
ttatcACAAAccaatggcgattccgaactttacc gtacaactatcttAGAAAagcaaggattacttat gggtgagtaATAAAtagtcgctaactactgaatc gaccctggcaccccaacaAAAAAagaggaataca ttatcACAAAccaatggcgattccga gtacaactatcttAGAAAagcaaggattacttat gggtgagtaATAAAtagtcgctaactactgaatc ccccaacaAAAAAagaggaataca Regione: AXAAA

6 Mutazioni atattACAAAacctttgctctggtagaggttacg
ccccctggagcttaAAGAAcgtgatcggttcctt ggggacccctgAAAATattatggcaagattgtga aaacctgGAAAAagaccataaatggagccgttaa gcccgactttccgttttcAAACAaggagttccct atattACAAAaccttt ccccctggagcttaAAGAAcgtgatcggttcctt ggggacccctgAAAATattatggcaaga aaacctgGAAAAagaccata ttccgttttcAAACAaggagttccct Regione: AAAAA

7 Gap ccaaacAAAgcgAAAggtatcaaacacccggctt
agagcagcagtagtAAAtgAAAacgtcaggcaac aacAAAggactAAActccgcatatgctctactac cgaaatttctgagcttcctgAAAcAAAcctttat caaacAAA---gcAAAggt gagcagcagtagtAAA---tgAAAacgtcaggcaa aacAAAggactAAAc ttaatcctgAAAc----AAAcctttat Regione: AAAX(1,5)AAA

8 Pattern Discovery Obiettivo:
dato un insieme di sequenze (nucleotidi o proteine) trovare tutti i pattern (anche detti segnali o motivi) che occorrono in forma esatta o approssimata (con mutazioni, inserzioni o delezioni) in tutte o in un numero significativo di esse Ricercare un singolo pattern esatto è facile (O(n)): ACGAGCGAGCACGAAGCG XXGXGXGAGCXXGAXGXG Il confronto di seq. Su larga scala, di solito nella forma di ricerca in un DB, è uno strumento molto potente per l’inferenza biologica nella biologia molecolare moderna, ed è universalmente usato dai biol. Mol. . La scoperta di un legame tra geni che causano il cancro e geni coinvolti normalmente nel processo di crescita è stato il primo risultato significativo nel confronto di sequenze.

9 Pattern Discovery approssimato
Obiettivo: dato un insieme di sequenze (nucleotidi o proteine) trovare tutti i pattern (anche detti segnali o motivi) che: occorrano, con un numero di mutazioni, inserzioni o delezioni non superiore a un massimo assegnato, in ogni sequenza del set; oppure: occorrano come sopra in forme non più distanti di un massimo assegnato, secondo una assegnata misura di distanza; oppure: occorrano come sopra in un numero di sequenze “sorprendentemente” elevato ma... non si sa quale pattern si deve cercare Il confronto di seq. Su larga scala, di solito nella forma di ricerca in un DB, è uno strumento molto potente per l’inferenza biologica nella biologia molecolare moderna, ed è universalmente usato dai biol. Mol. . La scoperta di un legame tra geni che causano il cancro e geni coinvolti normalmente nel processo di crescita è stato il primo risultato significativo nel confronto di sequenze.

10 Pattern Discovery approssimato
Problema 1 INPUT: una sequenza S sull’alfabeto S, due valori e,q  N OUTPUT: tutti i pattern che occorrono in S almeno q volte con al più e mismatches

11 Pattern Discovery approssimato
Problema 2 INPUT: un insieme S = {S1, …, Sk} di sequenze sull’alfabeto S, due valori e, q N OUTPUT: tutti i pattern che occorrono in almeno q elementi di S con al più e mismatches

12 Pattern Discovery approssimato
Problema 3 INPUT: una sequenza S definita sull’alfabeto S, due valori e, q N ed una misura di distanza d OUTPUT: tutti i pattern P che occorrono in S almeno q volte con un forma P’ tale che d(P,P’)  e Misure di distanza: - numero di mismatches (mutazioni) - distanza di edit - weight matrices (PAM,BLOSUM)

13 Metodi Pattern Driven La soluzione più semplice:
Generare tutti i pattern fino ad una lunghezza massima m Cercare separatamente ogni pattern nelle sequenze Riportare il pattern più significativo sulla base di qualche misura statistica La ricerca è più efficiente con l’aiuto di una struttura di indicizzazione dei testi adatta Limite: ci sono 4m o 20m pattern candidati per ogni lunghezza m: m = 5 : pattern m = 10 : pattern m = 15 : pattern

14 Metodi Pattern Driven L’enumerazione di tutti i pattern possibili funziona solo per lunghezze limitate e per DNA (l’alfabeto è più piccolo) Soluzioni possibili per accelerare la ricerca sono: Ridurre a priori il numero di pattern candidati (limitando la ricerca a quelli che occorrono almeno una volta senza errori) Imporre restrizioni alle posizioni in cui possono verificarsi mutazioni (ossia permettere errori solo in specifiche posizioni) Se il pattern è contenuto nel set di candidati, questi metodi garantiscono di trovarlo

15 Metodi Pattern Driven Funzionano bene nella pratica:
con pattern corti (fino a 8-10 residui) se il pattern occorre esatto in almeno una sequenza se sono solo permesse mutazioni in posizione fissa (ad esempio: ATXGGGXTCAXXG) Limite: deve essere predefinito un valore di errore massimo (dipendente dalla dimensione del pattern)

16 Metodi Sequence Driven
La maggior parte dei software usati si basano su metodi sequence driven che: prendono tutti i pattern che occorrono nelle sequenze, e cercano similarità tra di essi non necessitano di un limite superiore della lunghezza del motivo e/o del numero di mutazioni non necessitano di una soglia di distanza: semplicemente cercano il gruppo (o i gruppi) dei pattern più simili (uno per ogni sequenza) Limite: il problema diventa anche più difficile di prima

17 Metodi Sequence Driven
Esempio: pattern di lunghezza m con al più d mutazioni GGATA GAAAA AAAAT ACAAA Grafo in cui: i nodi sono i pattern gli archi connettono pattern entro una distanza 2d (possono essere istanze dello stesso pattern)

18 Metodi Sequence Driven
Equivalente a trovare una cricca massimale nel grafo... …è NP-difficile!!!

19 Metodi Sequence Driven
Miglioramenti: introdurre euristiche per ottenere una buona (possibilmente la migliore) soluzione in un tempo accettabile, senza verificare tutti i profili possibili La soluzione ottima non è più garantita I programmi più ampiamente utilizzati: CONSENSUS (greedy) Gibbs Sampler (probabilistico) MEME (machine learning) sono sequence driven. Ognuno è basato su un’euristica diversa

20 Metodi Sequence Driven
Pregi: Non si deve imporre nessun limite alla lunghezza della regione comune Non si deve definire esplicitamente un limite superiore all’errore Una soluzione viene sempre trovata Difetti: Non garantiscono di trovare la soluzione migliore La dimensione della regione deve sempre essere “suggerita” all’algoritmo

21 Metodi Sequence Driven
La sequenza può essere vista come generata da due diverse sorgenti: una che genera nucleotidi appartenenti a rumore di fondo casuale (random background noise) una che genera il motivo Soluzione: provare a stimare i parametri della sorgente che genera il motivo Più il motivo differisce dal rumore di fondo, più ci si aspetta che sia significativo

22 Metodi Sequence Driven
Computano la frequenza di ogni nucleotide nelle sequenze (pi) Tentano di costruire un profilo della sorgente del pattern con una matrice di frequenze Trovano la matrice le cui frequenze differiscono maggiormente dalle frequenze di background Più il segnale è vicino alla distribuzione del rumore di fondo, più è arduo rilevarlo con metodi sequence driven

23 Profili atattACAAAaccttt ccccctggagcttaAAGAAcgtgatcggttcctt
ggggacccctgAAAATattatggcaaga aaacctgGAAAAagaccata ttccgttttcAAACAaggagttccct A | C | G | T | A | C | G | T |

24 Scoring Patterns (SD) Il solo conteggio del numero di occorrenze di un pattern può non essere sufficiente Obiettivo: associare ad ogni pattern (o profilo) un punteggio statistico, tentando di riflettere il più possibile la sua rilevanza biologica Riporta dunque i pattern con score più elevato Pattern driven: computa il numero di occorrenze di un pattern e lo compara con qualche valore atteso: S(p) = Obs(p)/Exp(p)

25 Scoring Patterns (SD) I metodi SD classificano la matrice di frequenza secondo il suo contenuto di informazione (o entropia relativa): Minimo quando fi,j = Pri Massimo quando il nucleotide meno probabile occorre esclusivamente

26 Consensus (1990) Prende un pattern dalla prima sequenza, uno dalla seconda e costruisce la matrice delle frequenze Ripete per ogni coppia di pattern Salva la matrice migliore A C G T

27 Consensus (1990) Ripete per k volte, aggiungendo ad ogni passo i pattern di una nuova sequenza e salvando le più elevate matrici di scoring Alla fine, stampa in output le matrici “migliori”, che corrisponderanno alle occorrenze del motivo (uno per ogni sequenza) L’algoritmo è greedy: nessuna garanzia che le matrici finali siano le migliori possibili

28 Gibbs Sampler (1993) Sceglie a caso un pattern da ogni sequenza
Costruisce la matrice delle frequenze Scarta il pattern appartenente ad una sequenza (S’) Per ogni pattern di S’ calcola la verosimiglianza (likelihood) che venga generato dalla sorgente del motivo rispetto alla sorgente di background: L(Pi) = M(Pi)/B(Pi) Assegna ad ogni posizione i di S’ una probabilità proporzionale a L(Pi) e sceglie uno nuovo pattern da S’

29 Gibbs Sampler (1993) Si ferma dopo un dato numero di iterazioni, o quando gli score della matrice sono stabili Riporta i profili migliori Necessita di un elevato (>10) numero di sequenze in input Una soluzione candidata (profilo) potrebbe essere rimpiazzata da una peggiore Deve essere eseguito più di una volta

30 Gibbs Sampler (1993) 2-1 2 c AATCGTCAGC cagagctgtg
AATGCTCAGC cataccaata c AATCGTCAGC cagagctgtg aa AATCCCCAGC gaataacgcg gtg AATGCTCAGC cagttaatgg agcg ATTCCTCAGC tgtcgggtag gttgg GATCCTCAGC ataaaaaaaa ctcgac AATCCTCAGG agacgactta tgctacg AATCCTCAGT atcttattca tcaaaaga AATCCTCCGC aaatggttac agacaaacc AATTCTCAGC agaatgaagt atgacgaaat AATCCTCTGC agacctggtc gaacaaaact AATCCTCACC tagcttgagg aactacggct AATCCTCATC tcctgggaag tacagacgat AATCCTTAGC agcccgctac gttcaggcta AATCCCCAGC ggcacggtct sites: **********

31 Gibbs Sampler (1993) Motif model (residue frequency x 100):
POS A C G T Info

32 Limiti di performance Falliscono tutti sul seguente benchmark (Pevzner 2000): Trovare un segnale lungo 15 nucleotidi che appare con esattamente 4 mutazioni in un campione di 20 sequenze, ognuna lunga 600 nucleotidi In generale, Pevzner ha evidenziato i seguenti valori limite per lunghezza pattern/numero di mismatches per insiemi di venti sequenze di lunghezza 600 6 5 4 3 2 1 20 19 18 16 15 13 12 10

33 Segnale (15,4) gctgtcgcacAGGAATCCGACGGACaatggcagctggggttaaagcatg
AGGAAGCCGAGCGAT gctgtcgcacAGGAATCCGACGGACaatggcagctggggttaaagcatg tcctgaaaagAGGAAGCCATATGATgggctttactacaccgagagaggt gtttcaggtgTGAAAGCCGGGGGATacggcagcggaattgaataacggt gagtgtcggtTGGATACCGATCGATtaaacgtcgcggtacaagtatcat actcacgggaAGGAAGCCACGAGCTcacacataccactacctaagtcaa ctccaagtatAATAAGCCGAGCGTCgcaagaggcttctatctacaattt aaacacaaacAGTTGGCCGAGCGACttatgtgacgtacactccttattg ataggtcataAAGAATCCGAGACATgacctcaacgattggcacacaagg cgaggtcaccAAGAAGGCGAAAGATccaagggtataagtcaaggagtta ggcaacggaaCGGATGCCGAGATATatgaacgccaggtgggaaggttcc aggcctccggAGTAATTCTAGCGATctgtaacacctcggacgcaacgcc tcttttattaAGTAAGCCCCGCGTTcgtggttacgtgggtgggcggaca atgccaagtaACTAAGCTGAGCGACcgaagagtagactgcggagactgt gactcgtcgcCCGAAGGTGAGCGATtatctgaattacacatctccatcg tcgtgtccgaACGAAGCCGAATTATgtcgaatggacgaatggtagggca ccctgtgcgcAGGAAGGCGACCGTCagggagtgccattagtttacgacg ttatattccaAGGAAGTGGAACTATgcgtcacaagcggaggtaaaggca ttgggaaggtATGAAGCAGCCCGATgggctccatggcacgtccttccga tacctcccctGGGAAGCTGAACGAGagctttaaccctataaccagagca ggggtcgatgTGGAAGCCCGTCGATgggtcgcgactcgggacgtgcgat

34 Le ricerche più recenti
La ricerca recente si è focalizzata sul problema del motivo (l,e) per il DNA: trovare tutti i pattern di lunghezza l che occorrono con al più e mutazioni in un insieme di sequenze Il problema è stato “probabilmente” risolto in modo adeguato Più alta è la probabilità di successo desiderata, più tempo richiede il programma Alcuni programmi: SP-Star Projection Weeder

35 SP-Star (2000) Per tutti i pattern p che occorrono esattamente nelle sequenze, si trova la migliore istanza pi in ogni sequenza i Si selezionano i pattern che minimizzano: Si raffinano i pattern trovati costruendo una stringa di consensus

36 Projection (2001) Idea: proiettare un pattern di m caratteri in un sottospazio a k dimensioni, con k<l-d: ACGAGGTCG A AG T G Alcune occorrenze del motivo saranno proiettate nello stesso sub-pattern Le posizioni da rimuovere sono scelte a caso ad ogni passo Il raffinamento del pattern avviene con un profilo

37 Weeder (2001) Idea: invece di ridurre il set di pattern candidati, ridurre il set di possibili match per ogni pattern, tentando di risparmiare un numero significativo di occorrenze valide Invece di effettuare una ricerca esaustiva dei patterns che occorrono in ogni sequenza, si cercano pattern che occorrono in un loro sottoinsieme L’algoritmo ha bisogno in input solo di un prefissato rapporto di errore 

38 Weeder (2001) Input: un insieme di sequenze e un rapporto di errore 
Output: tutti i pattern che occorrono in almeno q sequenze con al più m mutazioni Le mutazioni non possono essere concentrate all’inizio del pattern

39 Weeder (2001) Dato un pattern P = p1p2....pm, l’algoritmo può trovare tutte le occorrenze valide di P (con al più |P| mutazioni), tale che al più i mutazioni occorrono nei primi i caratteri del pattern Ma: alcune occorrenze del pattern possono venire dimenticate completamente I segnali di DNA sono sempre così “puliti” da mostrarsi decomposti in blocchi? La risposta è no, ma si può usare Weeder con buon senso

40 Uso di Weeder Esempio: pattern (15,4) che occorre in 20 sequenze i.i.d. Possibili occorrenze valide (decomposte in blocchi): 829 Possibili occorrenze totali: 1365 Probabilità di “centrare” un’occorrenza possibile in una sequenza: phit = .61 Probabilita di trovare il pattern in ogni sequenza: come tentare di vincere all’Enalotto! Se si cercano pattern che occorrono in almeno 10 sequenze, la probabilità di vedere il pattern almeno 10 volte è: Phit(20,10) = .89

41 Uso di Weeder Si può usare Weeder come setaccio, per filtrare il set di pattern candidati Tutti i pattern trovati da Weeder in almeno q sequenze possono essere ricercati nuovamente nelle sequenze, questa volta senza restrizione sulla posizione dei mismatch Ci si aspetta che il numero dei pattern (pattern casuali diversi dal segnale reale) passati alla seconda fase sia molto più piccolo di quello originale (e non più esponenziale)

42 Uso di Weeder La probabilità di trovare un pattern in una sequenza dipende dalla sua lunghezza e dal rapporto di errore La probabilità di trovare un pattern in un insieme di sequenze (e in questo modo la scelta del quorum q per la prima fase) dipende dal numero di sequenze Lo stesso approccio può essere applicato quando il segnale non compare in ogni sequenza

43 Uso di Weeder Quando ci si aspetta che il segnale da trovare sia corto, l’algoritmo può essere usato in exact mode Per segnale più lungo, più è basso il quorum q, più sarà alta la probabilità di trovare il segnale Ma: anche il numero di pattern che soddisfano i vincoli di input è più elevato, e il programma è più lento L’utente può scegliere un opportuno trade-off tra tempo e accuratezza

44 Complessità teorica in tempo
Approccio naïve O(4men) Approccio con suffix tree (Sagot, 1998) O(4emekn) con n dimensione dell’input, m lunghezza del pattern ed e numero di mutazioni permesse Weeder O((1/)e4ekn) con e numero di mutazioni che occorrono nel più lungo pattern trovato

45 Conclusioni Metodi esaustivi Metodi Sequence Driven
Adatti per pattern corti e analisi di dati once-for-all (ad esempio per interi genomi) Metodi Sequence Driven Danno risposte più veloci ma meno accurate Per dati di dimensione limitata E’ possibile scegliere un trade-off tra tempo e accuratezza

46 Cosa troviamo sicuramente
Pattern corti Pattern che occorrono esatti almeno una volta Pattern composti da posizioni conservate e quelli wildcard (senza limiti di lunghezza, eccetto...) DNA pattern con mutazioni (probabilmente! Ma si deve sapere quante mutazioni sono permesse) Per il resto..... good luck!


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