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UNIVERSITA DI MILANO-BICOCCA LAUREA MAGISTRALE IN BIOINFORMATICA Corso di BIOINFORMATICA: TECNICHE DI BASE Prof. Giancarlo Mauri Lezione 9 Pattern discovery.

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1 UNIVERSITA DI MILANO-BICOCCA LAUREA MAGISTRALE IN BIOINFORMATICA Corso di BIOINFORMATICA: TECNICHE DI BASE Prof. Giancarlo Mauri Lezione 9 Pattern discovery

2 2 Il problema Abbiamo un insieme di sequenze (DNA o proteine) non allineate e funzionalmente correlate Sappiamo che: tutte le sequenze (o la maggior parte di esse) contengono regioni simili tra loro le regioni comuni potrebbero essere responsabili della funzione delle sequenze Problema: esiste un metodo efficiente e affidabile per trovare tali regioni?

3 3 Obiettivo: individuare regioni simili allinterno di due o più sequenze per scoprire origine evolutiva comune funzioni comuni Per le biosequenze (DNA, RNA e proteine), una forte similarità di solito implica una significativa similarità funzionale o strutturale Esempi: Similarità tra loncogene n-sys del virus del sarcoma delle scimmie e il gene del fattore di crescita PDGF (Doolittle 83, Waterfield, 83). Similarità tra i geni delle globine nelluomo e nello scimpanzè Un problema più generale: confronto di sequenze

4 4 Quanto simili? Identiche Con nucleotidi diversi permessi in alcune posizioni Con mutazioni (in generale) Con inserzioni e/o delezioni Con alcune parti conservate separate da regioni casuali All of the above(??)

5 5 ttatcACAAAccaatggcgattccgaactttacc gtacaactatcttAGAAAagcaaggattacttat gggtgagtaATAAAtagtcgctaactactgaatc gaccctggcaccccaacaAAAAAagaggaataca Regione: AXAAA Mutazioni in posizione fissa ttatcACAAAccaatggcgattccga gtacaactatcttAGAAAagcaaggattacttat gggtgagtaATAAAtagtcgctaactactgaatc ccccaacaAAAAAagaggaataca

6 6 atattACAAAacctttgctctggtagaggttacg ccccctggagcttaAAGAAcgtgatcggttcctt ggggacccctgAAAATattatggcaagattgtga aaacctgGAAAAagaccataaatggagccgttaa gcccgactttccgttttcAAACAaggagttccct Regione: AAAAA Mutazioni atattACAAAaccttt ccccctggagcttaAAGAAcgtgatcggttcctt ggggacccctgAAAATattatggcaaga aaacctgGAAAAagaccata ttccgttttcAAACAaggagttccct

7 7 ccaaacAAAgcgAAAggtatcaaacacccggctt agagcagcagtagtAAAtgAAAacgtcaggcaac aacAAAggactAAActccgcatatgctctactac cgaaatttctgagcttcctgAAAcAAAcctttat Regione: AAAX(1,5)AAA Gap caaacAAA---gcAAAggt gagcagcagtagtAAA---tgAAAacgtcaggcaa aacAAAggactAAAc ttaatcctgAAAc----AAAcctttat

8 8 Pattern Discovery Obiettivo: dato un insieme di sequenze (nucleotidi o proteine) trovare tutti i pattern (anche detti segnali o motivi) che occorrono in forma esatta o approssimata (con mutazioni, inserzioni o delezioni) in tutte o in un numero significativo di esse Ricercare un singolo pattern esatto è facile (O(n)): ACGAGCGAGCACGAAGCG XXGXGXGAGCXXGAXGXG

9 9 Pattern Discovery approssimato Obiettivo: dato un insieme di sequenze (nucleotidi o proteine) trovare tutti i pattern (anche detti segnali o motivi) che: occorrano, con un numero di mutazioni, inserzioni o delezioni non superiore a un massimo assegnato, in ogni sequenza del set; oppure: occorrano come sopra in forme non più distanti di un massimo assegnato, secondo una assegnata misura di distanza; oppure: occorrano come sopra in un numero di sequenze sorprendentemente elevato ma... non si sa quale pattern si deve cercare

10 10 Pattern Discovery approssimato Problema 1 INPUT: una sequenza S sullalfabeto, due valori e,q N OUTPUT: tutti i pattern che occorrono in S almeno q volte con al più e mismatches

11 11 Pattern Discovery approssimato Problema 2 INPUT: un insieme S = {S 1, …, S k } di sequenze sullalfabeto, due valori e, q N OUTPUT: tutti i pattern che occorrono in almeno q elementi di S con al più e mismatches

12 12 Problema 3 INPUT: una sequenza S definita sullalfabeto, due valori e, q N ed una misura di distanza d OUTPUT: tutti i pattern P che occorrono in S almeno q volte con un forma P tale che d(P,P) e Misure di distanza: - numero di mismatches (mutazioni) - distanza di edit - weight matrices (PAM,BLOSUM) Misure di distanza: - numero di mismatches (mutazioni) - distanza di edit - weight matrices (PAM,BLOSUM) Pattern Discovery approssimato

13 13 Metodi Pattern Driven La soluzione più semplice: Generare tutti i pattern fino ad una lunghezza massima m Cercare separatamente ogni pattern nelle sequenze Riportare il pattern più significativo sulla base di qualche misura statistica La ricerca è più efficiente con laiuto di una struttura di indicizzazione dei testi adatta Limite: ci sono 4 m o 20 m pattern candidati per ogni lunghezza m: m = 5 : 1024 pattern m = 10 : pattern m = 15 : pattern

14 14 Metodi Pattern Driven Lenumerazione di tutti i pattern possibili funziona solo per lunghezze limitate e per DNA (lalfabeto è più piccolo) Soluzioni possibili per accelerare la ricerca sono: Ridurre a priori il numero di pattern candidati (limitando la ricerca a quelli che occorrono almeno una volta senza errori) Imporre restrizioni alle posizioni in cui possono verificarsi mutazioni (ossia permettere errori solo in specifiche posizioni) Se il pattern è contenuto nel set di candidati, questi metodi garantiscono di trovarlo

15 15 Metodi Pattern Driven Funzionano bene nella pratica: con pattern corti (fino a 8-10 residui) se il pattern occorre esatto in almeno una sequenza se sono solo permesse mutazioni in posizione fissa (ad esempio: ATXGGGXTCAXXG) Limite: deve essere predefinito un valore di errore massimo (dipendente dalla dimensione del pattern)

16 16 Metodi Sequence Driven La maggior parte dei software usati si basano su metodi sequence driven che: prendono tutti i pattern che occorrono nelle sequenze, e cercano similarità tra di essi non necessitano di un limite superiore della lunghezza del motivo e/o del numero di mutazioni non necessitano di una soglia di distanza: semplicemente cercano il gruppo (o i gruppi) dei pattern più simili (uno per ogni sequenza) Limite: il problema diventa anche più difficile di prima

17 17 Grafo in cui: -i nodi sono i pattern -gli archi connettono pattern entro una distanza 2d (possono essere istanze dello stesso pattern) GGATA GAAAA AAAAT ACAAA GAAAA Metodi Sequence Driven Esempio: pattern di lunghezza m con al più d mutazioni

18 18 …è NP-difficile!!! Metodi Sequence Driven Equivalente a trovare una cricca massimale nel grafo...

19 19 Metodi Sequence Driven Miglioramenti: introdurre euristiche per ottenere una buona (possibilmente la migliore) soluzione in un tempo accettabile, senza verificare tutti i profili possibili La soluzione ottima non è più garantita I programmi più ampiamente utilizzati: CONSENSUS (greedy) Gibbs Sampler (probabilistico) MEME (machine learning) sono sequence driven. Ognuno è basato su uneuristica diversa

20 20 Metodi Sequence Driven Pregi: Non si deve imporre nessun limite alla lunghezza della regione comune Non si deve definire esplicitamente un limite superiore allerrore Una soluzione viene sempre trovata Difetti: Non garantiscono di trovare la soluzione migliore La dimensione della regione deve sempre essere suggerita allalgoritmo

21 21 Metodi Sequence Driven La sequenza può essere vista come generata da due diverse sorgenti: una che genera nucleotidi appartenenti a rumore di fondo casuale (random background noise) una che genera il motivo Soluzione: provare a stimare i parametri della sorgente che genera il motivo Più il motivo differisce dal rumore di fondo, più ci si aspetta che sia significativo

22 22 Metodi Sequence Driven Computano la frequenza di ogni nucleotide nelle sequenze (p i ) Tentano di costruire un profilo della sorgente del pattern con una matrice di frequenze Trovano la matrice le cui frequenze differiscono maggiormente dalle frequenze di background Più il segnale è vicino alla distribuzione del rumore di fondo, più è arduo rilevarlo con metodi sequence driven

23 A | C | G | T | atattACAAAaccttt ccccctggagcttaAAGAAcgtgatcggttcctt ggggacccctgAAAATattatggcaaga aaacctgGAAAAagaccata ttccgttttcAAACAaggagttccct Profili A | C | G | T |

24 24 Scoring Patterns (SD) Il solo conteggio del numero di occorrenze di un pattern può non essere sufficiente Obiettivo: associare ad ogni pattern (o profilo) un punteggio statistico, tentando di riflettere il più possibile la sua rilevanza biologica Riporta dunque i pattern con score più elevato Pattern driven: computa il numero di occorrenze di un pattern e lo compara con qualche valore atteso: S(p) = Obs(p)/Exp(p)

25 25 êMinimo quando f i,j = Pr i êMassimo quando il nucleotide meno probabile occorre esclusivamente Scoring Patterns (SD) I metodi SD classificano la matrice di frequenza secondo il suo contenuto di informazione (o entropia relativa):

26 A C G T Consensus (1990) Prende un pattern dalla prima sequenza, uno dalla seconda e costruisce la matrice delle frequenze Ripete per ogni coppia di pattern Salva la matrice migliore

27 27 Consensus (1990) Ripete per k volte, aggiungendo ad ogni passo i pattern di una nuova sequenza e salvando le più elevate matrici di scoring Alla fine, stampa in output le matrici migliori, che corrisponderanno alle occorrenze del motivo (uno per ogni sequenza) Lalgoritmo è greedy: nessuna garanzia che le matrici finali siano le migliori possibili

28 28 Gibbs Sampler (1993) Sceglie a caso un pattern da ogni sequenza Costruisce la matrice delle frequenze Scarta il pattern appartenente ad una sequenza (S) Per ogni pattern di S calcola la verosimiglianza (likelihood) che venga generato dalla sorgente del motivo rispetto alla sorgente di background: L(P i ) = M(P i )/B(P i ) Assegna ad ogni posizione i di S una probabilità proporzionale a L(P i ) e sceglie uno nuovo pattern da S

29 29 Gibbs Sampler (1993) Si ferma dopo un dato numero di iterazioni, o quando gli score della matrice sono stabili Riporta i profili migliori Necessita di un elevato (>10) numero di sequenze in input Una soluzione candidata (profilo) potrebbe essere rimpiazzata da una peggiore Deve essere eseguito più di una volta

30 AATGCTCAGC cataccaata c AATCGTCAGC cagagctgtg aa AATCCCCAGC gaataacgcg gtg AATGCTCAGC cagttaatgg agcg ATTCCTCAGC tgtcgggtag gttgg GATCCTCAGC ataaaaaaaa ctcgac AATCCTCAGG agacgactta tgctacg AATCCTCAGT atcttattca tcaaaaga AATCCTCCGC aaatggttac agacaaacc AATTCTCAGC agaatgaagt atgacgaaat AATCCTCTGC agacctggtc gaacaaaact AATCCTCACC tagcttgagg aactacggct AATCCTCATC tcctgggaag tacagacgat AATCCTTAGC agcccgctac gttcaggcta AATCCCCAGC ggcacggtct sites: ********** Gibbs Sampler (1993)

31 31 Gibbs Sampler (1993) Motif model (residue frequency x 100): POS A C G T Info

32 32 Limiti di performance Falliscono tutti sul seguente benchmark (Pevzner 2000): Trovare un segnale lungo 15 nucleotidi che appare con esattamente 4 mutazioni in un campione di 20 sequenze, ognuna lunga 600 nucleotidi In generale, Pevzner ha evidenziato i seguenti valori limite per lunghezza pattern/numero di mismatches per insiemi di venti sequenze di lunghezza

33 33 AGGAAGCCGAGCGAT gctgtcgcacAGGAATCCGACGGACaatggcagctggggttaaagcatg tcctgaaaagAGGAAGCCATATGATgggctttactacaccgagagaggt gtttcaggtgTGAAAGCCGGGGGATacggcagcggaattgaataacggt gagtgtcggtTGGATACCGATCGATtaaacgtcgcggtacaagtatcat actcacgggaAGGAAGCCACGAGCTcacacataccactacctaagtcaa ctccaagtatAATAAGCCGAGCGTCgcaagaggcttctatctacaattt aaacacaaacAGTTGGCCGAGCGACttatgtgacgtacactccttattg ataggtcataAAGAATCCGAGACATgacctcaacgattggcacacaagg cgaggtcaccAAGAAGGCGAAAGATccaagggtataagtcaaggagtta ggcaacggaaCGGATGCCGAGATATatgaacgccaggtgggaaggttcc aggcctccggAGTAATTCTAGCGATctgtaacacctcggacgcaacgcc tcttttattaAGTAAGCCCCGCGTTcgtggttacgtgggtgggcggaca atgccaagtaACTAAGCTGAGCGACcgaagagtagactgcggagactgt gactcgtcgcCCGAAGGTGAGCGATtatctgaattacacatctccatcg tcgtgtccgaACGAAGCCGAATTATgtcgaatggacgaatggtagggca ccctgtgcgcAGGAAGGCGACCGTCagggagtgccattagtttacgacg ttatattccaAGGAAGTGGAACTATgcgtcacaagcggaggtaaaggca ttgggaaggtATGAAGCAGCCCGATgggctccatggcacgtccttccga tacctcccctGGGAAGCTGAACGAGagctttaaccctataaccagagca ggggtcgatgTGGAAGCCCGTCGATgggtcgcgactcgggacgtgcgat Segnale (15,4)

34 34 Le ricerche più recenti La ricerca recente si è focalizzata sul problema del motivo (l,e) per il DNA: trovare tutti i pattern di lunghezza l che occorrono con al più e mutazioni in un insieme di sequenze Il problema è stato probabilmente risolto in modo adeguato Più alta è la probabilità di successo desiderata, più tempo richiede il programma Alcuni programmi: SP-Star Projection Weeder

35 35 Si raffinano i pattern trovati costruendo una stringa di consensus SP-Star (2000) Per tutti i pattern p che occorrono esattamente nelle sequenze, si trova la migliore istanza p i in ogni sequenza i Si selezionano i pattern che minimizzano:

36 36 A AG T G Alcune occorrenze del motivo saranno proiettate nello stesso sub-pattern Le posizioni da rimuovere sono scelte a caso ad ogni passo Il raffinamento del pattern avviene con un profilo Projection (2001) Idea: proiettare un pattern di m caratteri in un sottospazio a k dimensioni, con k

37 37 Weeder (2001) Idea: invece di ridurre il set di pattern candidati, ridurre il set di possibili match per ogni pattern, tentando di risparmiare un numero significativo di occorrenze valide Invece di effettuare una ricerca esaustiva dei patterns che occorrono in ogni sequenza, si cercano pattern che occorrono in un loro sottoinsieme Lalgoritmo ha bisogno in input solo di un prefissato rapporto di errore

38 38 Weeder (2001) Input: un insieme di sequenze e un rapporto di errore Output: tutti i pattern che occorrono in almeno q sequenze con al più m mutazioni Le mutazioni non possono essere concentrate allinizio del pattern

39 39 Weeder (2001) Dato un pattern P = p 1 p 2....p m, lalgoritmo può trovare tutte le occorrenze valide di P (con al più |P| mutazioni), tale che al più i mutazioni occorrono nei primi i caratteri del pattern Ma: alcune occorrenze del pattern possono venire dimenticate completamente I segnali di DNA sono sempre così puliti da mostrarsi decomposti in blocchi? La risposta è no, ma si può usare Weeder con buon senso

40 40 Uso di Weeder Esempio: pattern (15,4) che occorre in 20 sequenze i.i.d. Possibili occorrenze valide (decomposte in blocchi): 829 Possibili occorrenze totali: 1365 Probabilità di centrare unoccorrenza possibile in una sequenza: p hit =.61 Probabilita di trovare il pattern in ogni sequenza: come tentare di vincere allEnalotto! Se si cercano pattern che occorrono in almeno 10 sequenze, la probabilità di vedere il pattern almeno 10 volte è: P hit (20,10) =.89

41 41 Uso di Weeder Si può usare Weeder come setaccio, per filtrare il set di pattern candidati Tutti i pattern trovati da Weeder in almeno q sequenze possono essere ricercati nuovamente nelle sequenze, questa volta senza restrizione sulla posizione dei mismatch Ci si aspetta che il numero dei pattern (pattern casuali diversi dal segnale reale) passati alla seconda fase sia molto più piccolo di quello originale (e non più esponenziale)

42 42 Uso di Weeder La probabilità di trovare un pattern in una sequenza dipende dalla sua lunghezza e dal rapporto di errore La probabilità di trovare un pattern in un insieme di sequenze (e in questo modo la scelta del quorum q per la prima fase) dipende dal numero di sequenze Lo stesso approccio può essere applicato quando il segnale non compare in ogni sequenza

43 43 Uso di Weeder Quando ci si aspetta che il segnale da trovare sia corto, lalgoritmo può essere usato in exact mode Per segnale più lungo, più è basso il quorum q, più sarà alta la probabilità di trovare il segnale Ma: anche il numero di pattern che soddisfano i vincoli di input è più elevato, e il programma è più lento Lutente può scegliere un opportuno trade-off tra tempo e accuratezza

44 44 Complessità teorica in tempo Approccio naïve O(4 m en) Approccio con suffix tree (Sagot, 1998) O(4 e m e kn) con n dimensione dellinput, m lunghezza del pattern ed e numero di mutazioni permesse Weeder O((1/ ) e 4 e kn) con e numero di mutazioni che occorrono nel più lungo pattern trovato

45 45 Conclusioni Metodi esaustivi Adatti per pattern corti e analisi di dati once-for-all (ad esempio per interi genomi) Metodi Sequence Driven Danno risposte più veloci ma meno accurate Per dati di dimensione limitata E possibile scegliere un trade-off tra tempo e accuratezza

46 46 Cosa troviamo sicuramente Pattern corti Pattern che occorrono esatti almeno una volta Pattern composti da posizioni conservate e quelli wildcard (senza limiti di lunghezza, eccetto...) DNA pattern con mutazioni (probabilmente! Ma si deve sapere quante mutazioni sono permesse) Per il resto..... good luck!


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