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HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND.

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1 HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3 Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n) […] PDB: banca dati di strutture (Protein Data Bank) – ridondante – strutture ottenute sperimentalmente via X-ray o NMR

2 ATOM 1 N VAL A N ATOM 2 CA VAL A C ATOM 3 C VAL A C ATOM 4 O VAL A O ATOM 5 CB VAL A C ATOM 6 CG1 VAL A C ATOM 7 CG2 VAL A C ATOM 8 N LEU A N ATOM 9 CA LEU A C ATOM 10 C LEU A C ATOM 11 O LEU A O ATOM 12 CB LEU A C ATOM 13 CG LEU A C ATOM 14 CD1 LEU A C ATOM 15 CD2 LEU A C ATOM 16 N SER A N ATOM 17 CA SER A C ATOM 18 C SER A C ATOM 19 O SER A O ATOM 20 CB SER A C ATOM 21 OG SER A O … XYZ coordinate tipo di atomo tipo di amminoacido

3 Classificazioni gerarchiche

4 SCOP (Structural Classification of Proteins) Class –,, /, +,... Fold – Similarità strutturale Superfamily – Omologia Family – Omologia e funzione Principalmente annotata a mano

5 CATH Class (,, /, +,...) Architecture Topology (including connections between sec. str. elements) Homologous superfamily Semiautomatica – Solo Architecture viene assegnata manualmente

6 Esempi di categorie di fold (CATH architectures)

7 Come nel confronto di sequenze e necessario allinearle, nel confronto di strutture 3D e necessario sovrapporle come corpi rigidi scegliendo una regola di corrispondenza tra coppie di atomi o di residui nelle due strutture. La prima difficoltà consiste nel fatto che le due proteine molto spesso non hanno lo stesso numero di residui. Per la sovrapposizione si possono utilizzare le catene dei carboni alfa appartenenti agli elementi di struttura secondaria perche in genere le inserzioni e delezioni si accumulano nei loop che possono semplicemente venire esclusi dalla sovrapposizione. I metodi di confronto 3D utilizzano l allineamento delle sequenze per decidere la regola di corrispondenza alla base della sovrapposizione strutturale CONFRONTO STRUTTURE 3D DI PROTEINE – ALLINEAMENTO STRUTTURALE

8 Un allineamento strutturale può essere valutato in base alla deviazione quadratica media (root mean square deviation o r.m.s.d.), al numero di atomi che sono stati accoppiati nella sovrapposizione e alla valutazione della similarità dei residui sovrapposti. Lr.m.s.d. o r.m.s. di una sovrapposizione tridimensionale è la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie che hanno partecipato allallineamento strutturale, per cui tanto più bassa è lr.m.s. tanto migliore sarà lallineamento strutturale calcolato D = distanza tra coppie di atomi appaiati N = numero di coppie considerate

9 RMSD Root-mean-square deviation – Deviazione quadratica media – Serve per paragonare strutture identiche, eccetto rotazioni e traslazioni r ai e r bi sono le posizioni dell´ atomo i nelle strutture a e b, n è il numero di atomi nelle strutture. r.m.s.d. di una sovrapposizione 3D è la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie che hanno partecipato allallineamento strutturale, per cui tanto più bassa è lr.m.s. tanto migliore sarà lallineamento strutturale calcolato

10 EVOLUZIONE DELLE PROTEINE RELAZIONE ESISTENTE TRA SIMILARITA di sequenza e struttura in omologhi Studio di un campione di strutture note di proteine omologhe (Chothia, Lesk, 1982) Similarità strutturale misurata in termini di RMSD CALCOLO RMS - Confronto di due strutture mediante SOVRAPPOSIZIONE - Determinazione di aa che si corrispondono nelle due strutture - Identificazione degli atomi che si vogliono confrontare (Cα o backbone) RMSD= n = numero residui d = distanza tra atomi corrispondenti

11 un altro criterio di valutazione di un allineamento strutturale è rappresentato dal numero di atomi o di residui che sono stati accoppiati si cerca di massimizzare il numero di atomi accoppiati e di minimizzare la corrispondente r.m.s. a parità di numero di residui accoppiati, il migliore allineamento strutturale sarà quello con minore r.m.s. a parità di r.m.s. verrà considerato migliore lallineamento strutturale operato con un maggior numero di atomi accoppiati valutazione dellallineamento strutturale oltre a questi due valori tipici delle sovrapposizioni tridimensionali, si può anche considerare il punteggio di similarità dei residui accoppiati

12 DIVERGENZA DI SEQUENZA E STRUTTURA Se si valuta la relazione esistente tra divergenza strutturale (misurata in termini di RMSD) e divergenza di sequenza si osserva che esse si corrispondono in MODO ESPONENZIALE (valutato dal confronto di strutture note) - (RMSD< 2 Å) possono avere seq molto differenti (degenerazione del codice strutturale-struttura più conservata della seq) RMSD (A) %identity 30% id.seq

13 SOGLIA di significatività per la SIMILARITA STRUTTURALE. confronto a coppie di struttura e seq di proteine 3D note, quantificato usando come parametri: lunghezza allineamento, % id seq, sim.struttura a confronto in un grafico: lunghezza allin vs id seq (e in terza dimensione sim.strutturale) Sim. Strut.parametrizzata come uguale/diverso (pallino/quadrato): 2 str. Uguali se > 70% della struttura sec è in comune (rmsd bassa). al di sotto della soglia rumore di fondo elevato 25% (x allin 80 aa) al di sopra del quale chiara similarità strutturale – soglia lunghezza dipendente possibile che proteine con identità < 25% abbiano strutture simili ma anche che non siano correlate strutturalmente (twilight zone) %id seq Length alignment Sec str identity < 70% Sec str identity > 70%

14 Protein ubiquitination Passmore, and Bardford, Biochem J, 2004 Pickart, Cell, 2004 Brzovic and Klevit, Cell Cycle, 2006 Hochstrasser, Cell, 2006 Protein ubiquitination: regulatory process influencing several aspect of eukaryoyic cell biology Polyubiquitin (polyUb) chain: link ε-amino group of a Lys of one Ub to the C-terminal carboxyl group of the next Ub in the chain E1-E2-E3 responsible for activating and transferring Ub to proteins Fundamental mechanisms of Ub-chain assembly and of E1-E2-E3 regulation still not clearly understood

15 Ubiquitin like proteins (Ubls) 8-20 kDa Ub 76 aa Globular domain (4βstrands in a antiparallel βsheet +αhelix) + flexible C- terminal terminating with a gly 7 Conserved lysine residues in Ub N.B. ISG15: ha due domini Ubl Di-Ubiquitina Ogni Ubl ha il suo set di E1-E2-E3

16 E2: Ub-conjugating enzymes Michelle et al., J Mol Evol, (2009) Ye and Rape, Nat Rev Mol Cel Biol (2009) Identification of phosphorylations by Cdks and CK2 kinases affecting E2 activity Cys forms a thiolester bond to C-terminal Gly of Ub Asn stabilizes oxyanion transition state E1 E3/E3 Multi-domain E2 classification in 17 familes reflecting structural organization of cat. dom.

17 G76 K63 K48 Hydrophobic patch Monomeric Ub

18 B_LEU8 A_ILE44 B_ILE44 B_VAL70 A_VAL70 A_LEU8 B_Cterm Legame isopeptidico polyUb crossilinkata by K48 sono segnale universale per la degradazione da proteasoma Adottano una CONFORMAZIONE CHIUSA in cui L8, I44 and V70 (patch idrofobico sulla superficie di una singola molecola di Ub) sono sequestrati allinterfaccia tra due molecole di Ub adiacenti K48-linked polyUb Diverse strutture sperimentali di Di-Ub crosslinkata K48 via NMR o X- ray e una struttura X-ray della tetra- polyUb crosslinkata via K48

19 Tetra-Ubiquitina crosslinkata K48

20 K63-linked polyUbpolyUb crosslinkata via K63 agisce come segnale regolatorio piuttosto che degradativo in molti pathway, Adotta conformazione estesa in soluzione senza contatti diretti tra patch idrofobici Diverse strutture sperimentali di Di-Ub crosslinkata K63 via NMR o X- ray e una struttura X-ray della tetra- polyUb crosslinkata via K63


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