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Bioinformatica Microarray Dr. Giuseppe Pigola –

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Presentazione sul tema: "Bioinformatica Microarray Dr. Giuseppe Pigola –"— Transcript della presentazione:

1 Bioinformatica Microarray Dr. Giuseppe Pigola –

2 Microarray A parte poche eccezioni, ogni cellula del nostro organismo contiene un set completo di cromosomi composti da geni identici. In una specifica cellula, solo una parte di questi geni è attiva, e sono proprio i diversi gruppi di geni attivi che conferiscono proprietà specifiche ad ogni tipo cellulare. Per espressione genetica si intende la produzione di proteina da parte di un gene (la trascrizione delle informazioni contenute sul DNA nellmRNA che a sua volta viene tradotto nelle proteine che provvedono alle funzioni di base delle cellule). Il tipo e la quantità di mRNA prodotto ci dicono quanto un gene sia espresso. Ad esempio una alterazione dellespressione genica può indicare la presenza di una malattia. Bioinformatica2

3 Microarray Bioinformatica3 Biological question Differentially expressed genes Sample class prediction etc. Testing Biological verification and interpretation Microarray experiment Estimation Experimental design Image analysis Normalization Clustering Discrimination

4 Microarray Analizzare lespressione genica vuol dire analizzare la quantità di mRNA o di proteine prodotte da una cellula in un particolare momento. I Microarray, chiamati anche DNA chip, permettono lanalisi dellespressione di migliaia di geni con un singolo esperimento. Il principio alla base dellanalisi dellespressione genica consiste nel confronto di campioni diversi, ad esempio tessuti sani o malati per studiare lespressione genica in una determinata malattia. Bioinformatica4

5 Microarray Le molecole di mRNA si legano selettivamente, attraverso lappaiamento delle basi, ad una sequenza di DNA complementare; Migliaia di sequenze di DNA a singolo filamento vengono posizionate su una griglia microscopica di pochi centimetri, che funge da supporto per lappaiamento di molecole di mRNA che vengono poste sulla sua superficie (con lausilio di robot); Bioinformatica5

6 Microarray Come già detto si confrontano le espressioni geniche per correlarle a malattie. Un tipico esempio è quello di confrontare lespressione genica di un certo numero di geni in diversi campioni (=pazienti) appartenenti a diverse classi (=norm vs cancer). Bioinformatica6 rapporto di espressione del gene 5 nel paziente 4 Array1Array2Array3 …

7 Microarray Una volta preparato il microarray, gli mRNA relativi a determinati geni vengono trattati con dei coloranti fluorescenti (tipicamente Cy3 e Cy5); Dei laser applicati al microarray producono una emissione di colori che indicano lespressione dei mRNA; Bioinformatica7 A questo punto viene prodotta una immagine RGB: Blu settato a 0; Rosso per le intensità di Cy5; Verde per le intensità di Cy3;

8 Microarray PROCESSAMENTO DELLIMMAGINE Addressing/Gridding: Ad ogni spot è assegnata una coordinata; Segmentation: Classificazione dei pixel (backgroud/spot); Intensity determination: Viene misurata lintensità di ciascuno spot in relazione allintensità del backgroud; Bioinformatica8

9 Microarray CREAZIONE DELLA MATRICE DI ESPRESSIONE Il microarray viene rappresentato da una matrice A(i,j) dove: A(i,j) = value_R/value_G Value= Median (Foreground) - Median (Background); Value = Mean (Foreground) - Mean (Background); Bioinformatica9

10 Microarray Software GenPix: Bioinformatica10

11 Microarray Data Mining Una volta ottenuta la matrice che rappresenta il microarray è possibile applicare tecniche di data mining per: Trovare biomarcatori che permettono di individuare una determinata classe (normal/tumor); Classificare un profilo di espressione genica sconosciuta; Bioinformatica11

12 Microarray Data Mining METODI Esistono diverse tecniche di data-mining per la classificazione di dati di espressione genica. Bioinformatica12

13 Microarray Data Mining Una nuova tecnica di data mining per costruire un classificatore: INPUT: Matrice di espressione genica (miRNA); Ridurre i campioni per classe in modo da equlilbrare la generazione dei NFI; Filtraggio di geni differentemente espressi nelle varie classi; Discretizzazione dei dati; Eliminazione dei geni non discriminanti; Costruzione di Maxima Frequent Itemset per ciascuna classe; Estrazione di regole di associazione utilizzate per classificare samples sconosciuti; Validazione del modello tramite KFCV; Bioinformatica13

14 Microarray Data Mining Bioinformatica14 Profiling data Profiling data Genes patterns (data mining: max freq itemsets) Genes patterns (data mining: max freq itemsets) Model validation (KFCV) Model validation (KFCV) Discretization Filtering (i.e. discriminant genes) Filtering (i.e. discriminant genes) Filtering based on permutation test Filtering based on permutation test Superset of robust biomarkers Superset of robust biomarkers Bayesian Networks Construction (reverse engineering) Pathway Perturbation microRNAs analysis Bayesian Networks Construction (reverse engineering) Pathway Perturbation microRNAs analysis Binary strategy

15 Microarray Data Mining Abbiamo N campioni dove x i è un vettore M dimensionale e rappresenta la classe di appartenenza. I geni (miRNA) sono denotati da dove rappresenta i valori di espressione del campione x per il gene (miRNA) m. Bioinformatica15

16 Microarray Data Mining DISCRETIZZAZIONE Al fine di calcolare i Maximal Frequent Itemset dobbiamo prima discretizzare. Ogni valore di gene discretizzato sarà mappato in un Item (quindi i geni-valore sono sostituiti da geni-intervalli) rappresentato da un numero intero; Differenti metodi di discretizzazione possono influenzare laccuratezza del metodo (supervised- unsupervised, global-local, topdown-bottomup (splitting-merging), etc. etc.; Per discretizzare possiamo usare diversi metodi: Equal Width Interval Bin; Recursive Minimal Entropy Partitioning; Class-Attribute Contingency Coefficient; Unparametrized Supervised Discretization; Iterative Dicotomizer 3 Discretizer; …… Bioinformatica16

17 Microarray Data Mining DISCRETIZZAZIONE: Equal Width Interval Bin Discretizziamo il range di una variabile continua in B bin (contenitori); Dati i livelli d espressione di un gene nel range lampieza di ciascun bin è impostata a I limiti confini di ciascun sono impostati a Il metodo è applicato ad ogni gene indipendentemente scegliendo i valori discretizzati nellinsieme A seconda del bin in cui cade un valore continuo Bioinformatica17

18 Microarray Data Mining DISCRETIZZAZIONE: Recursive Minimal Entropy Partitioning Dato linsieme di livelli di espressione genica per il gene e il confine di partizione T i, lentropia della partizione indotta da T i è Il punto di partizione T i che minimizza lentropia verrà scelto e il procedimento proseguirà ricorsivamente finché non si verifica una condizione di stop: Dove Con a,a 1,a 2 numero di classi nei set S i, S i 1,S i 2 rispettivamente e N numero di valori del gene in S i (Uguali per tutti i geni). Bioinformatica18

19 Microarray Data Mining DISCRETIZZAZIONE: Recursive Minimal Entropy Partitioning Ordiniamo i valori di Siano x 1,x 2,…,x M i valori ordinati; Calcoliamo i punti di mezzo Per ciascuno di questi calcoliamo lentropia e scegliamo come cutting point quello in cui abbiamo minima entropia ottenendo cosi due intervalli; Procediamo ricorsivamente sui due intervalli; Bioinformatica19 x2x2 x1x1 x3x3 x4x4 T 1 =(x 1 +x 2 )/2 T 2 =(x 2 +x 3 )/2 T 3 =(x 3 +x 4 )/2 …….

20 Microarray Data Mining DISCRETIZZAZIONE: Class-Attribute Contingency Coefficient q ir (i = 1,2,...,S, r = 1,2,...,n) numero totale di campioni appartenenti alla classe i-esima che stano nellintervallo (d r-1,d r ]; M i+ Numero totale di campioni della classe i-esima; M +r Numero totale di campioni che stanno nellintervallo (d r-1,d r ]; n Numero di intervalli; C.J. Tsai, C.-I. Lee, W.-P. Yang. A discretization algorithm based on Class-Attribute Contingency Coefficient. Information Sciences 178:3 (2008) Bioinformatica20

21 Microarray Data Mining DISCRETIZZAZIONE: Class-Attribute Contingency Coefficient q ir (i = 1,2,...,S, r = 1,2,...,n) numero totale di campioni appartenenti alla classe i-esima che stano nellintervallo (d r-1,d r ]; M i+ Numero totale di campioni della classe i-esima; M +r Numero totale di campioni che stanno nellintervallo (d r-1,d r ]; n Numero di intervalli; C.J. Tsai, C.-I. Lee, W.-P. Yang. A discretization algorithm based on Class-Attribute Contingency Coefficient. Information Sciences 178:3 (2008) Bioinformatica21 Otteniamo i risultati migliori quando i valori continui di ciascuna classe si trovano insieme nello stesso intervallo.

22 Microarray Data Mining DISCRETIZZAZIONE: Class-Attribute Contingency Coefficient Bioinformatica22

23 Microarray Data Mining DISCRETIZZAZIONE: Class-Attribute Contingency Coefficient (ESEMPIO) Bioinformatica23

24 Microarray Data Mining DISCRETIZZAZIONE: Unparametrized Supervised Discretizer Definiamo: Pure Value per un attributo: Il valore ha la stessa classe per ogni sua ocorrenza; Impure Value: Altrimenti; CutPoint: Valori che delimitano lintervallo; Pure Interval: Ogni valore nellintervallo appartiene alla stessa classe; Impure interval: Altrimenti; Majority class per un intervallo: La classe con più occorrenze; Goodness di un intervallo: La bontà di un intervallo dipende dalla sua purezza; Goodness = (Cardinalità della classe con più elementi nellintervallo)/(1+rimanenti elementi nellintervallo) Bioinformatica24

25 Microarray Data Mining DISCRETIZZAZIONE: Unparametrized Supervised Discretizer Algoritmo: Calcolo dei cutpoints iniziali: Massimizzare la purity di ogni intervallo (Questo porta ad avere un numero di intervalli elevato); Refinement: gli intervalli vengono ridotti (facendo una join di intervalli adiacenti) in base alla funzione booleana: Unioncondition(I i,I i+1 ) = [I i ha la stessa majority class di I i+1 ] AND [la goodness dellunione tra i due intervalli è maggiore della media della goodness di I i e I i+1 ] La condizione viene applicata ad ogni step a tutte le possibili unioni e viene poi fatta la join di quella coppia di intervalli con goodness migliore; Alla fine lalgoritmo darà in output linsieme di intervalli con goodness migliore; Bioinformatica25

26 Microarray Data Mining DISCRETIZZAZIONE: Iterative Dicotomizer 3 Discretizer Molto simile al metodo dellentropia; Bioinformatica26

27 Microarray Data Mining DISCRIMINANT GENE FILTERING Se è equamente distribuito tra le classi, esso non contribuirà alla classificazione. Per questo motivo calcoliamo Fissato un threshold TH, definiamo Se tale funzione restituirà false, allora il gene valore non sarà considerato nella costruzione del MFI. Bioinformatica27

28 Microarray Data Mining DISCRIMINANT GENE FILTERING In pratica, dato un valore discretizzato v e una classe k quello che calcoliamo è: Tale valore sarà: 0 se v ha la stessa frequenza nelle varie classi; >1 se v compare di più nella classe k rispetto alle altre; <1 se v compare di più nelle altre classi piuttosto che in k; Bioinformatica28

29 Microarray Data Mining EFRON TEST Significatività statistica; Come per altri casi già visti quantifica (statisticamente) se un valore discretizzato sia discriminante per una classe solo per caso; I valori discretizzati hanno una distribuzione nelle varie classi (ad es. per due classi): Generiamo una distribuzione random dei valori discretizzati nelle varie classi e conteggiamo (count) quante volte otteniamo una occorrenza maggiore a quella reale nella distribuzione random (eseguiamno il test per un certo numero di volte); Bioinformatica29 D1D1 D2D2 …..DkDk C1C1 419….12 C2C2 51…..10

30 Microarray Data Mining FREQUENT ITEMSETS. Uno dei problemi più importanti in Data Mining e quello delle regole di associazione: Si occupa di identificare relazioni «interessanti» tra itemset, predicendo inoltre associazioni e correlazioni che possono presentarsi i nuovi dati dello stesso tipo; Market Basket Analysis: Analizzare i carrelli della spesa per stabilire quali prodotti vengono venduti assieme; Questo consente di identificare quei prodotti che fanno da traino (e che quindi possono innescare con alta probabilità lacquisto di altri prodotti); Pannolini birra; (non vale il viceversa); Marketing: posizionare in modo opportuno i prodotti negli scaffali; Bioinformatica30

31 Microarray Data Mining FREQUENT ITEMSETS. Bisogna affrontare il problema del frequent pattern analysis: individuare un pattern (insieme di item) che si presenta frequentemente nei dati; In generale nel market-basket problem si vogliono estrapolare regole di associazione del tipo: Se un cliente compra x 1,x 2,…,x k allora probabilmente comprerà anche y; La probabilità minima che pretendiamo si chiama confidenza; Bioinformatica31

32 Microarray Data Mining FREQUENT ITEMSETS. Sia I={i 1,i 2,…,i N } un insieme di item e sia D un un insieme di transazioni su I. Una transazione è costituita da un sottoinsieme di I; Itemset di lunghezza k sono indicati con k-itemset; Ogni itemset X I ha associato un supporto che indica la frazione di transazioni contenente X; Un itenset X sarà frequente se ha un supporto superiore a una soglia minima data (minsupp) sotto forma di numero (assoluto) o percentuale (relativo); Bioinformatica32

33 Microarray Data Mining FREQUENT ITEMSETS E REGOLE DI ASSOCIAZIONE Gli insiemi frequenti ci permettono di costruire delle regole di associazione (ad es. pannolini birra); Le regole di associazione forniscono delle regole dei tipi IF-THEN Bioinformatica33

34 Microarray Data Mining FREQUENT ITEMSETS E REGOLE DI ASSOCIAZIONE Data una regola di associazione X Y possiamo definire il supporto e la confidenza di tale regola come Dove X Y significa che i due itemset sono presenti nella stessa transazione; In generale il supporto rappresenta la probabilità che una transazione contenga X e Y cioè p(XY); La confidenza è quindi una probabilità condizionata che indica quanto robusta è una implicazione (bisogna come per supp fissare una soglia minconf); Bioinformatica34

35 Microarray Data Mining FREQUENT ITEMSETS. Impostiamo minsupp = 50% e minconf=50% I prodotti che superano la soglia minsupp sono: Birra 3; Noccioline 3; Pannolini 4; Uova 3; {birra,pannolini} 3; Dallitemset {birra,pannolini} possiamo tirare fuori le regole di associazione: Bioinformatica35 Entrambe superano la soglia di minsupp; Tutte le transazioni che contengono birra, contengono anche pannolini (conf=100%); Nel viceversa solo il 75%

36 Microarray Data Mining APRIORI Monotonicità: Se un insieme S di articoli è frequente, allora anche suo sottoinsieme lo è; Lalgoritmo costruisce i singoli insiemi frequenti, a partire da questi costruisce le coppie di insiemi frequenti, dalle coppie costruisce le triple di insiemi frequenti (livelli successivi si procede più velocemente), fino ad arrivare a k-uple di insiemi frequenti in cui non esistono itemset frequenti costituite da k + 1 elementi; Bioinformatica36

37 Microarray Data Mining APRIORI: ESEMPIO Minsupp=2; C i = candidati; Bioinformatica37

38 Microarray Data Mining APRIORI: PSEUDOCODICE Bioinformatica38

39 Microarray Data Mining INSIEMI FREQUENTI, CHIUSI, MASSIMALI Gli insiemi massimali sono chiusi, e gli insiemi chiusi sono frequenti; Bioinformatica39

40 Microarray Data Mining MAXIMAL FREQUENT ITEMSETS: Dato linsieme di geni discriminanti discretizzato, estraiamo per ogni classe k linsieme di itemset massimale (MFI); Per ogni classe k=0,…,K 1, viene calcolato separatamente lMFI corrispondente MFI(0),MFI(1),…, MFI(K-1) Fissata la classe k MFI(k) sarà composto da un certo numero di itemset frequenti dove il v-esimo sarà della forma mfi v (k)={I 1,I 2,…,I j } (ogni item I è un valore discretizzato che indica un gene intervallo); mfi v (k) può essere visto come una regola di associazione nella forma: Bioinformatica40

41 Microarray Data Mining MAXIMAL FREQUENT ITEMSETS: VALUTAZIONE Siano allora date le regole di associazione per ogni classe e un campione sconosciuto (discretizzato): Possiamo allora valutare quante regole vengono soddisfatte, anche parzialmente per ogni classe. Fissata la classe k e la regola r v valutiamo il campione sconosciuto assegnando uno score EVAL cerca di tenere in considerazione il numero di item del campione contenute nella regola insieme alla cardinalità della regola (più grande è la cardinalità più alto sarà lo score). Tale score è normalizzato per la cardinalità dellitemset. Lo score finale per una data classe sarà allora dato da: Bioinformatica41

42 Microarray Data Mining - Validazione k-Fold Cross-Validation: Il training set è diviso in k gruppi distinti; Si usano k-1 gruppi come training set e il gruppo escluso come test input; Processo iterato per ognuna delle k possibili scelte del gruppo tolto dal training-set; Risultato: Media dei risultati; Leave-one-out Cross-Validation: Si estra un elemento dal set di dati; Il set di dati meno lelemento verrà usato come training set; Lelemento verrà usato come test input; Processo iterato; Bioinformatica42

43 Microarray Data Mining TOOL Bioinformatica43

44 Microarray Data Mining RISULTATI: LVOCV Ci siamo confrontati con uno dei più recenti ed efficienti metodi oggi conosciuti (ANMM4CBR) su quattro dataset. Bioinformatica44 Yao B, Li S: ANMM4CBR: a case-based reasoning method for gene expression data classication. Algorithms for Molecular Biology 2010, 5:14, [http://www.almob.org/content/5/1/14]. DatasetANMM4CBRNuovo Metodo Leukemia97.61 Colon86.71 SRBCT99.71 CGM

45 Microarray Data Mining RISULTATI: BLIND TEST Bioinformatica45 Yao B, Li S: ANMM4CBR: a case-based reasoning method for gene expression data classication. Algorithms for Molecular Biology 2010, 5:14, [http://www.almob.org/content/5/1/14]. DatasetANMM4CBRNuovo Metodo Leukemia97.60,98 Colon86.71 SRBCT99.71 CGM


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