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I metodi RFLP SSCP/DGGE/TGGE Ibridazione con sonde oligonucleotidche Sequenziamento DNA microarrays Pyrosequencing Preceduti da amplificazione Eventuale.

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1 I metodi RFLP SSCP/DGGE/TGGE Ibridazione con sonde oligonucleotidche Sequenziamento DNA microarrays Pyrosequencing Preceduti da amplificazione Eventuale clonaggio

2 Restriction fragment lenght polymorphism (RFLP)

3 RFLP

4 Prodotto della PCR delle sequenza di interesse Purificazione e quantificazione Digestione con l’enzima scelto (concentrazione, tempo, temperatura) Elettroforesi in gel di agarosio Digestione con più enzimi di restrizione Confronto di amplificati di ceppi diversi

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6 SSCP T A G C T A G C NormaleMutato Denaturazione Singoli filamenti Forme differenti per la presenza di mutazioni Gel Mutazione Mobilità differente

7 SSCP Sensibilità: –70-95% mutazioni (<200 pb) –50% mutazioni (>400 pb) Parametri: – Temperatura – Concentrazione del tampone – Concentrazione di acrilamidde – Presenza di additivi – Marcatori

8 DGGE/TGGE Diversa migrazione elettroforetica del singolo filamento –In gradiente di denaturazione chimico –In gradiente di temperatura

9 DGGE –Purificazione del prodotto della PCR –Determinazione del profilo di melting e del gradiente di denaturazione Formula di Fodde e Losekoot –% di denaturante=(3,2xTm)- 182,4 –Clamp

10 DGGE

11 Vantaggi –Alta sensibilità –Sonde radioattive: NO –Possibilità di ottimizzare il sistema Svantaggi – Tempi per la messa a punto del sistema – Clamp – Possibilità di ottimizzare il sistema – Dimensioni dei frammenti (max 500 pb) – Localizzazione mutazione: NO

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13 Sequenziamento Metodo di Maxam e Gilbert Limiti del Metodo – Scarsa riproducibilità – Materiale radioattivo – Sequenze brevi

14 Sequenziamento Metodo di Sanger Limiti del Metodo – Scarsa riproducibilità – Materiale radioattivo – Sequenze brevi

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26 Marcatura Fluorocromo dell’infrarosso Fluorocromi : fluoresceina, Texas red, ecc.

27 Sequenziatori automatici Modulo elettroforetico –Raggio laser –Fotodiodi –Piastra termostatica Modulo per l’alimentatore Computer –Software Controllo del sistema Analisi ed elaborazione dati

28 Sequenziatori ABI PRISM 310, 3100, 8000 Tecnologia per il sequenziamento automatico in elettroforesi capillare Terminatori fluorescenti a trasferimento di energia Cycle Sequencing

29 Marcatori: ddNTP marcati in fluorescenza Tecnologia dell’elettroforesi capillare Sequenziatori CEQ TM 2000, 8000 (BECKMAN)

30 DNA microarrays

31 “formati”

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33 NanoChip electtronico NanoChip TM Molecular Biology Workstation (Nanogen, San Diego, CA, USA) 100 siti testo (pads) array (NanoChip cartridge) Each test site is electronically connected to the NanoChip system by a platinum wire.

34 Pad (elettrodi) Pad (elettrodi) Connessioni elettroniche Connessioni elettroniche NanoChip elettronico

35 Pyrosequencing: principio (DNA) n +dNTP(DNA) n+1 + PPi polymerase

36 Analisi dei dati Allineamento delle sequenze Confronto con sequenze di riferimento (banche dati) Elaborazione dei dati –NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/)www.ncbi.nlm.nih.gov/ –EMBL (www.embl- heidelberg.de)www.embl- heidelberg.de –Blast, Fasta, Phylip, Neighbor-Joining Method ……………


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