I metodi RFLP SSCP/DGGE/TGGE Ibridazione con sonde oligonucleotidche

Presentazione sul tema: "I metodi RFLP SSCP/DGGE/TGGE Ibridazione con sonde oligonucleotidche"— Transcript della presentazione:

1 I metodi RFLP SSCP/DGGE/TGGE Ibridazione con sonde oligonucleotidche
Sequenziamento DNA microarrays Pyrosequencing Preceduti da amplificazione Eventuale clonaggio

2 Restriction fragment lenght polymorphism (RFLP)

3 RFLP

4 Prodotto della PCR delle sequenza di interesse
Purificazione e quantificazione Digestione con l’enzima scelto (concentrazione, tempo, temperatura) Elettroforesi in gel di agarosio Digestione con più enzimi di restrizione Confronto di amplificati di ceppi diversi

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6 SSCP Normale Mutato Gel Singoli filamenti Forme differenti
Denaturazione A C Singoli filamenti Forme differenti per la presenza di mutazioni T G A C Gel Mobilità differente Mutazione

7 SSCP Sensibilità: Parametri: 70-95% mutazioni (<200 pb)
Temperatura Concentrazione del tampone Concentrazione di acrilamidde Presenza di additivi Marcatori

8 DGGE/TGGE Diversa migrazione elettroforetica del singolo filamento
In gradiente di denaturazione chimico In gradiente di temperatura

9 DGGE Purificazione del prodotto della PCR
Determinazione del profilo di melting e del gradiente di denaturazione Formula di Fodde e Losekoot % di denaturante=(3,2xTm)-182,4 Clamp

10 DGGE

11 DGGE Vantaggi Svantaggi Alta sensibilità Sonde radioattive: NO
Possibilità di ottimizzare il sistema Svantaggi Tempi per la messa a punto del sistema Clamp Possibilità di ottimizzare il sistema Dimensioni dei frammenti (max 500 pb) Localizzazione mutazione: NO

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13 Sequenziamento Metodo di Maxam e Gilbert Limiti del Metodo
Scarsa riproducibilità Materiale radioattivo Sequenze brevi

14 Sequenziamento Metodo di Sanger Limiti del Metodo
Scarsa riproducibilità Materiale radioattivo Sequenze brevi

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26 Marcatura Fluorocromo dell’infrarosso
Fluorocromi : fluoresceina, Texas red, ecc.

27 Sequenziatori automatici
Modulo elettroforetico Raggio laser Fotodiodi Piastra termostatica Modulo per l’alimentatore Computer Software Controllo del sistema Analisi ed elaborazione dati

28 Sequenziatori ABI PRISM 310, 3100, 8000
Tecnologia per il sequenziamento automatico in elettroforesi capillare Terminatori fluorescenti a trasferimento di energia Cycle Sequencing

29 Sequenziatori CEQTM2000, 8000 (BECKMAN)
Cycle Sequencing Marcatori: ddNTP marcati in fluorescenza Tecnologia dell’elettroforesi capillare

30 DNA microarrays

31 “formati”

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33 NanoChip electtronico
Each test site is electronically connected to the NanoChip system by a platinum wire. NanoChipTM Molecular Biology Workstation (Nanogen, San Diego, CA, USA) 100 siti testo (pads) array (NanoChip cartridge)

34 NanoChip elettronico Pad (elettrodi) Connessioni elettroniche

35 Pyrosequencing: principio
(DNA)n +dNTP (DNA)n+1+ PPi polymerase

36 Analisi dei dati Allineamento delle sequenze
Confronto con sequenze di riferimento (banche dati) Elaborazione dei dati NCBI ( EMBL ( Blast, Fasta, Phylip, Neighbor-Joining Method ……………