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Quando il cariotipo non ce la fa GENETICA MOLECOLARE INDAGA SULLA COMPOSIZIONE CHIMICA STRUTTURA, PROPRIETA E FUNZIONAMENTO DEI GENI.

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2 Quando il cariotipo non ce la fa

3 GENETICA MOLECOLARE INDAGA SULLA COMPOSIZIONE CHIMICA STRUTTURA, PROPRIETA E FUNZIONAMENTO DEI GENI

4 La Citogenetica Molecolare Abbina la possibilità di unanalisi del DNA, propria delle tecniche di biologia molecolare, con la struttura cromosomica il cui studio è oggetto della citogenetica classica.

5 La Citogenetica Molecolare Permette unanalisi mirata di una regione cromosomica consentendo di mettere in evidenza riarrangiamenti di alcune centinaia di chilobasi.

6 Tecniche di citogenetica molecolare FISH (fluorescence in situ hybridization) PRINS (primed in situ labeling) PCR in situ (polymerase chain reaction in situ) CGH (comparative genomic hybridization) ecc.

7 FISH (Fluorescence in situ hybridization) È una tecnica di ibridazione che permette, dopo fissazione di metafasi e nuclei in interfase su vetrino, di identificare sequenze specifiche negli acidi nucleici. Tale identificazione avviene mediante sonde marcate in maniera non isotopica, impiegando fluorocromi che emettono a diverse lunghezze donda.

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9 Nel cromosoma si distinguono:

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11 LA FISH IN DIAGNOSI PRENATALE Da 15 ml di liquido amniotico metafase: - Cariotipo - FISH per diagnosi di microdelezioni - FISH per diagnosi di riarrangiamenti cromosomici Da 2 ml di liquido amniotico nucleo: - FISH per diagnosi di sesso FISH per anomalie numeriche

12 DIAGNOSI DI ANEUPLOIDIE

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14 FISH SVANTAGGI costi elevati diagnosi non completa VANTAGGI rapidità identificazione di microdelezioni e riarrangiamenti complessi diagnosi su nucleo

15 CHROMOSOME PAINTING

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18 Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) è una tecnica semplice e rapida che consente la diagnosi molecolare delle aneuploidie più comuni (trisomia 21, 13, 18 e aneuploidie dei cromosomi sessuali) Questo tipo di approccio non richiede colture cellulari: la diagnosi può essere completata in 2 giorni QF-PCR Il metodo si basa sull'amplificazione di brevi sequenze del DNA che contengono blocchi ripetuti di 2-6 basi (marcatori STRs). Queste sequenze sono specifiche per il cromosoma che si intende analizzare. Usando marcatori per i cromosomi 21, 13, 18, X e Y è possibile diagnosticare le aneuploidie più frequenti.

19 Quantitative Fluorescent PCR Trisomy detection in prenatal samples Ratio: 1 : 1 : 1 Hypervariable region on chromosome 21 amplified by F- PCR Ratio: 1 : 2

20 Quali sono i campioni biologici più frequentemente reperibili sulla scena di un crimine? Ma anche da utilizzare per effettuare analisi genetiche?

21 REPERTI DA CUI E POSSIBILE ESTRARRE IL DNA

22 IL DNA fingerprinting è attualmente la tecnica più potente per identificare un campione biologico. Viene utilizzata dal 1984 in medicina forense (medicina legale) per risolvere casi legali: attribuzione di paternità, casi di omicidi, casi di stupri, ecc. La Genetica forense, ossia lapplicazione della Genetica nella risoluzione dei casi legali, si avvale della variabilità del genoma umano per identificare un individuo, o meglio per attribuire un campione biologico ad un unico individuo.

23 I marcatori polimorfici (soprattutto gli STR) sono stati estremamente utili per ottenere una prima mappa globale del genoma umano

24 Lutilizzo simultaneo della PCR e di traccianti fluorescenti consente lanalisi simultanea (multiplex) di moltissimi polimoprfismi

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29 È stato recentemente dimostrato che il Ritardo Mentale può essere causato da riarrangiamenti cromosomici subtelomerici non evidenziabili mediante tecniche di citogenetica classica ma mediante tecniche di citogenetica molecolare a causa delle loro ridotte dimensioni.

30 Ritardo mentale Patologia eterogenea ad etiologia mista costituita da un numero molto elevato di entità nosologiche differenti, le cui cause sono solo in parte note. Prevalenza nella popolazione generale si aggira attorno al 2-3%; la grande maggioranza rientra in ritardi di modesta entità, mentre lo % della popolazione generale presenta un ritardo severo.

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33 CGH convenzionale e microarray CGH convenzionale Risoluzione di circa 10 Mb Array-CGH Risoluzione teoricamente illimitata Screening dellintero genoma

34 Array-CGH o Molecular Karyotyping Caratteristiche generali La risoluzione dipende dalla distanza genomica tra gli elementi sullarray e dalla loro dimensione La sensibilità è influenzata dal rapporto segnale/rumore Lintensità del segnale è determinata dalla complessità del DNA contenuto negli spot e dalla qualità del campione Vantaggi Indipendenza da cellule in divisione Capacità di analizzare lintero genoma in un esperimento Elevata specificità, sensibilità e risoluzione Rapidità

35 Array – CGH o Molecular Karyotyping Svantaggi Incapacità di rilevare riarrangiamenti bilanciati e poliploidie Limitata abilità di individuare mosaicismi Fattori tecnici influenti Specificità e intensità dei segnali di ibridazione Quantità e qualità del campione di DNA Fattori biologici influenti Sequenze altamente ripetute e disperse Presenza di low-copy repeats (LCRs) Presenza di polimorfismi del numero di copie (LCVs)

36 Applicazione dellarray-CGH ai casi di ritardo mentale Lestensione dellarray dalla ricerca alla diagnosi richiede attendibilità e interpretabilità dei risultati Conferma degli esperimenti tramite FISH (BAC) Estensione dellanalisi ai genitori Cautela nellinterpretazione di singoli cloni (oligo) Utilità dellapplicazione ai pazienti con RM: Descrizione del difetto molecolare Identificazione dei geni Migliore classificazione Diagnosi Nuove terapie

37 E possibile avere 500,000 probe in uno spazio di 1.28 cm 2 Ogni singolo probe è costituito da milioni di oligonucleotidi identici Per ogni oligo che presenta un match perfetto (PM) è presente un oligo identico con mismatch per una sola base in posizione centrale (MM) La presenza di un MM consente di stimare legami aspecifici e background locale e di sottrarli dal segnaledi PM locale e di sottrarli dal segnale di PM

38 SNPs-array (Affymetrix GeneChip 250K) Risoluzione di 5 KbRisoluzione di 5 Kb 250,000 SNPs250,000 SNPs Intensità di segnale rilevata da uno scanner e i dati elaborati da un software

39 Diagnosiprenatale La diagnosi prenatale comprende linsieme delle procedure che permettono di riconoscere o escludere la presenza nel feto di anomalie congenite.

40 Test rapidi in diagnosi prenatale Identificano solo le aneuploidie dei cromosomi in analisi Non è in grado di diagnosticare traslocazioni e delezioni La contaminazione con DNA materno può rappresentare un problema La presenza di mosaicismo fetale è un problema La FISH non si può eseguire se è presente una piccola contaminazione da sangue materno Svantaggi Vantaggi Tempi rapidi di risposta Risultato entro 2-3 giorni Il rischio di falsi positivi e falsi negativi riportato in letteratura è basso E necessario poco materiale di partenza QF-PCR è meno costosa e laboriosa della FISH e della citogenetica classica QF-PCR può essere automatizzata La QF-PCR può essere eseguita anche se nel campione è presente una certa contaminazione da sangue materno

41 Lo scopo della diagnosi prenatale (DP) è quello di offrire ai genitori e al medico le migliori informazioni possibili sui rischi di dare alla luce un bambino affetto da un'anomalia congenita o da una malattia genetica. Due tipi di tecniche di DP : invasive e non invasive. DIAGNOSI PRENATALE Dati recenti indicano che circa il 2-5% dei neonati è affetto da una malattia genetica

42 Esistono 4 gruppi di patologie per le quali esiste la possibilità di effettuare la DP: -Anomalie cromosomiche; -Malattie genetiche (errori del metabolismo, emoglobinopatie..); -Infezioni fetali; -Malformazioni fetali

43 LA DIAGNOSI PRENATALE PRE-IMPIANTO Diagnosi preimpianto Il materiale cellulare prelevato dagli oociti o dallembrione coltivato in vitro è esaminato in relazione ad una determinata anomalia genetica. Dopo la diagnosi gli embrioni non affetti (ma non sempre…) sono selezionati e trasferiti nellutero prima applicazione per determinazione del sesso in malattie X-linked 1992 prima nascita di un embrione selezionato (fibrosi cistica) Biopsia dei corpi polari loocita maturo è dotato di un primo corpo polare (meiosi I) che può essere prelevato per evidenziare lassetto cromosomico o lallele in un gene patologico il secondo corpo polare può essere prelevato dopo la fertilizzazione in vitro per confermare la diagnosi Biopsia dellembrione allo stadio di divisione di 8-12 cellule (3° giorno) una o due cellule possono essere prelevate senza arrecare danno allembrione dopo la diagnosi, gli embrioni selezionati possono essere trasferiti in utero in alternativa biopsia allo stadio di blastocisti (300 cellule circa, 4°-5 giorno), ma è difficile coltivare in vitro lembrione sino a questo stadio

44 Efficacia nella diagnosi : 93-95% (non 100%) Eventuale contaminazione con materiale cellulare esterno Non si esclude la presenza di malattie cromosomiche non ricercate. Si consiglia conferma della diagnosi con Villocentesi / Amniocentesi Legge 19 febbraio 2004, n. 40 Art. 13 È vietata…ogni forma di selezione a scopo eugenetico degli embrioni e dei gameti… ad eccezione degli interventi aventi finalità diagnostiche e terapeutiche …volte alla tutela della salute e allo sviluppo dell'embrione stesso

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46 Diagnosi genetica pre-impianto

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48 Possibile già oggi per malattie monogeniche per cui sia nota la mutazione In futuro, almeno in teoria, è probabile che questa tecnica, in combinazione con lanalisi simultanea di moltissimi polimorfismi, possa permettere una valutazione di tratti genetici complessi. Quali i vantaggi, e quali i pericoli?

49 LA DIAGNOSI PRENATALE POST- IMPIANTO Negli ultimi 50 anni è aumentata in modo esponenziale la richiesta di indagini che durante la gravidanza permettano il riconoscimento di difetti o malformazioni fetali.(3% pop gen) Aumentate conoscenze scientifiche su malformazioni e difetti genetici e rischio genetico Aumentata capacità diagnostica Riduzione del numero di figli/coppia nel mondo industrializzato Richiesta esplicita di figlio sano Ricerca tardiva del primo concepimento Legislazioni su IVG

50 LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO INVASIVA PRELIEVO VILLI CORIALI (CVS) AMNIOCENTESI CORDOCENTESI FETOSCOPIA NON- INVASIVA ECOGRAFIA (Soft markers) BI-TEST TRI-TEST RICERCA SANGUE FETALE NEL PLASMA MATERNO

51 LA DIAGNOSI PRENATALE POST- IMPIANTO NON INVASIVA BI-TEST/ DUO-TEST. Screening biochimico: dosaggio su sangue materno BHCG e PAPP-A + esame ecografico per datazione Si esegue alla 10°-14° settimana Aumento HCG e diminuzione PAPP-A aumentato rischio di SDR Down Attendibilità al 60% DUO TEST + NT 80%

52 LA DIAGNOSI PRENATALE POST- IMPIANTO NON INVASIVA TRI-TEST: Screening biochimico:dosaggio su sangue materno di alfa fetoproteina+ BHCG+estriolo non coniugato Associato ad esame ecografico per datazione AF ridotta (25-30%)+ BHG aumentata+estriolo ridotto aumentato rischio SDR Down Attendibilità al 60%

53 SCREENING PRENATALE LAFP ( alfa feto proteina) è prodotta nel sacco vitellino e nel fegato fetale ed una parte di questa sostanza si trova anche nel sangue materno. In tutte le lesioni di continuo della cute quali spina bifida aperta, gastroschisi, estrofia vescicale LPS etc. una maggiore quantità può essere rilevata nel sangue materno. Questa indagine è pertanto utilizzata per verificare queste condizioni che potranno poi essere confermate anche con lausilio della indagine ecografica.

54 In presenza di un feto con S. di Down, lAFP è ridotta nel sangue materno, presumibilmente perché sia il sacco vitellino che il feto sono più piccoli. LESTRIOLO è un ormone prodotto dalla placenta che utilizza precursori derivati dal fegato e dalla surrenale. Lestriolo è ridotto in presenza di un feto con S. di Down La GONADOTROPINA CORIONICA UMANA è prodotta dalla placenta ed il suo dosaggio è utile a confermare una gravidanza in atto. Una subunità di questo ormone, detta BETA aumenta in presenza di un feto con s. di Down. Lelaborazione dei valori di questi parametri e le conclusioni debbono tenere conto però delletà gestazionale che va definita mediante esame ecografico.

55 LE TECNICHE DI DIAGNOSI NON INVASIVE E' importante tenere presente che QUESTE TECNICHE DI INDAGINE consentono di effettuare quasi esclusivamente una valutazione probabilistica, cioè, non permettono di identificare o di escludere direttamente le anomalie cromosomiche ma di selezionare pazienti a basso e ad alto rischio.

56 LE TECNICHE INVASIVE - BIPOSIA VILLI CORIALI - AMNIOCENTESI - FUNICOLOCENTESI - FETOSCOPIA LE TECNICHE DI ANALISI TECNICHE CITOGENETICHE TECNICHE DI INDAGINE MOLECOLARE TECNICHE IMMUNOLOGICHE

57 INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE CITOGENETICHE madri di età avanzata: superiore a 35 anni coppie con precedenti figli affetti da patologia cromosomica genitori con anomalie cromosomiche bilanciate riscontro ecografico di malformazioni fetali, ritardo dello sviluppo fetale, anomalie del la alterazione di alcuni parametri biochimici genitori portatori di aneuploidie non associate ad infertilità alcune malattie mendeliane gravidanze ottenute con fecondazione artificiale

58 INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE BIOCHIMICHE E BIOMOLECOLARI malattie mendeliane, X-linked, mitocondriali per le quali è stato identificato il difetto metabolico malattie mendeliane, X-linked, mitocondriali per le quali è stato identificato il difetto genico

59 INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE IMMUNOLOGICHE malattie infettive a trasmissione verticale contratte o riacutizzatesi durante la gravidanza Le più frequenti sono le malattie infettive del gruppo TORCH

60 Problemi nella diagnosi prenatale 1. Possibilità che le cellule in coltura non crescano in maniera adeguata e non sia possibile effettuare la diagnosi sul campione prelevato. Presso i centri più qualificati questo problema si verifica eccezionalmente, in media in meno dell1% dei campioni.

61 2. Possibilità che lanalisi fornisca un risultato ambiguo. Questo può dipendere da una contaminazione materna, che dà quindi origine alla presenza di due linee cellulari, potenzialmente non differenziabili se il feto è di sesso femminile, mentre di solito sono facilmente evidenziabili se il feto è di sesso maschile. In altri casi può essere presente una seconda linea cellulare originata da una mutazione in vitro. È indispensabile riuscire a differenziare i campioni che contengono artefatti della coltura (pseudomosaicismo) dai mosaicismi veri, in quanto le implicazioni per il feto sono completamente diverse (rispettivamente sano e ammalato). Problemi nella diagnosi prenatale

62 3. Diagnosi certa ma implicazioni fenotipiche incerte Questo costituisce attualmente un importante limite della diagnosi citogenetica fetale. In pratica, a fronte di un risultato diagnostico accurato a livello di laboratorio, non è possibile in certi casi predire con altrettanta accuratezza il fenotipo fetale. In queste situazioni viene attribuito un rischio empirico di patologia, che non è ulteriormente precisabile. Problemi nella diagnosi prenatale

63 The future Fetal cells in the maternal circulation Free fetal DNA in maternal plasma If diagnostic – no need for CVS or amniocentesis to detect chromosome abnormality

64 Persistenza di cellule staminali fetali nel sangue e tessuti materni per decadi postpartum (Bianchi, 96) Anticorpi monoclonali CD34 antigeni di superficie di HSCs fluorescent activated cell sorting+PCR amplification di Y isolamento di HSCs Y in 6 donne poratrici di feti femmine Isolamento di Y-DNA in cellule CD34+ di 6/8 donne non gravide di cui la più anziana aveva partorito un maschio 27 anni prima Cellule nel sangue materno per lungo tempo dopo il parto MICROCHIMERISMO

65 Fetomaternal trafficking and maternal health Fetal cells graft versus host disease?? Nelson (96): microchimerismo alcune malattie più comuni nelle donne che negli uomini. Nel sangue periferico di donne affette da sclerosi sistemica cellule fetali Identificazione di cellule fetali nel sangue materno con polimorfismi familiari specifici o paterni Johnson () ha identificato con metodiche di FISH e sonde per Y e X cellule fetali nei tessuti clinicamente affetti di una donna deceduta per perforazione intestinale da LES : milza, tiroide, rene, grosso intestino, polmone, cuore, cute e piccolo intestino (> 500 cellule ) Successivamente in altre malattie: sclerosi sistemica, LES, cirrosi biliari primario, sind Sjogren, Hashimoto, Graves e lichen planus

66 Conclusioni da un ampio corpo di studi sul microchimerismo umano dimostrano un transfer di cellule fetali multipotenti verso la loro madre Koopmans (05) con sonde Y-FISH ha identificato cellule in campioni istologici di donne sane (rene, fegato, cuore) Cellule di feti abortiti persistono e ripopolano i tessuti materni (fegato, reni) a distanza di anni Johnson (02)

67 Panel di 13 mutazioni usato per la diagnosi prenatale _ F508 57% _ N1303K 7% _ G542X 5% _ W1282X 3% _ 2183AA-G 3% _ G-A 2% _ I148T 1% _ R553X 1% _ L1065P _ G1244G _ 4016insT _ R1158X _ 711+1G T 86% PECULIARI DEL SUD ( 7%)

68 Precedente figlio con patologia cromosomica Le coppie che hanno un figlio con sindrome di Down da trisomia 21 libera o con traslocazione robertsoniana de novo hanno un rischio dell1% circa di ricorrenza della sindrome. Nelle coppie attempate il rischio è quello calcolato sulletà materna. Indicazioni per la diagnosi prenatale

69 - Genitori eterozigoti per anomalie bilanciate I genitori eterozigoti per una traslocazione bilanciata hanno un rischio di patologia fetale sbilanciata del 5-10%. Tuttavia tale rischio varia ampiamente in rapporto al tipo di riarrangiamento Indicazioni per la diagnosi prenatale

70 Identificazione ecografica di patologia fetale o della gravidanza in presenza di difetti strutturali e/o dello sviluppo fetale o alterazioni del volume del liquido amniotico. In circa il 20% di queste gravidanze, soprattutto quando sono presenti difetti associati, il feto è affetto da una patologia cromosomica. Il riscontro di anomalie ecografiche costituisce perciò unindicazione al monitoraggio del cariotipo fetale. Indicazioni per la diagnosi prenatale

71 - Anamnesi familiare positiva per difetti del tubo neurale - Anamnesi familiare positiva per malformazioni congenite Malformazioni e/o rimozioni chirurgiche dellovaio o parti di esso (RR DS + 9.6) Malattie mendeliane Indicazioni per la diagnosi prenatale

72 Effetti delle mutazioni Letali Subletali Condizionali Neutre Silenti Vantaggiose Svantaggiose Pleiotropiche Il 100% muore prima delletà riproduttiva Il 50% muore prima delletà riproduttiva Restrittive e permissive Non hanno effetti sul fenotipo Inalterata la proteina genica (polimorfismi) Favoriscono cambiamenti favorevoli Effetti fenotipici malattia Singole mutazioni diversi caratteri

73 counselling Indicazioni Controindicazioni Tecnica Complicanze Early: sett Mid:15-18 sett Tardiva:II-III trim

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75 Le fonti del liquido amniotico 10 sett il volume medio di LA 30 ml incremento di 20 ml/sett alla 14a sett (accumulo di LA gradiente osmotico tra feto-cav amniotica) 16 sett. volume medio di LA 200 ml dopo la 14a sett la deglutizione e la minzione diventano significative ed il volume medio di LA si raddoppia Tessuti che contribuiscono alla popolazione cellulare del LA: desquamazione di cellule da organi fetali, amnios e cordone. 20% di cellule viabili fibroblasti maggiore capacità riproduttiva

76 early o mid Cariotipo fetale Analisi genetiche molecolari Dosaggio di analiti ( FP, etc) Diagnosi di malattie infettive fetali tardiva Maturità polmonare fetale Evacuazione polidramnios Amnioinfusione

77 Amniocentesi : indicazioni (GU n.245 del 20/10/1998) Età materna avanzata 35 a Genitore con precedente figlio affetto da patologia cromosomica Genitore portatore di riarrangiamento strutturale non associato ad effetto fenotipico Genitore con aneuploidie dei cromosomi sessuali compatibili con la fertilità Anomalie malformative evidenziate con USG Rischio aumentato di feto affetto da s. di Down in base al triplo test (1/250) o su screening USG attuati sulla base di specifici programmi regionali.

78 Controindicazioni Assolute: nessuna vera. Relative: problematiche tecniche (sovrapposizione di anse intestinali, miomi etc.) Infezioni materne (HIV, epatiti???)

79 Amniocentesi: fase preliminare Accurato counselling della gestante su tutti gli aspetti dellesame per un consenso realmente informato Adeguato supporto psicologico Paziente in posizione supina (adeguato stato di riempimento vescicale) Ecografia Disinfezione delladdome Eventuale anestesia locale

80 Ecografia per lamniocentesi Viabilità fetale Numero di feti Eventuali anomalie Topografia placentare Età gestazionale Volume di LA Tasca di LA utile per il prelievo.

81 Amniocentesi Procedura 1.Disinfezione cutanea; 2.Infissione eco-guidata di un ago sterile munito di mandrino (20-22G di diametro e 7-12 cm di lunghezza) mediante tecnica amano libera, in cui loperatore tiene in una mano la sonda e nellaltra lago in modo da dirigere il fascio dultrasuoni sul piano dinserzione dello stesso e visualizzarlo in tutta la sua lunghezza, oppure ago-guidata, in cui lago è fissato al trasduttore e percorre una traiettoria fissa (loperatore visualizza solo la punta dellago);

82 Amniocentesi PROCEDURA 3.Giunto in cavità lago, estrazione del mandrino ed aspirazione con siringa sterile di ml di liquido amniotico (è preferibile eliminare i primi 1-2 ml di liquido amniotico in quanto potenzialmente contaminati da tessuto materno); 4. Estrazione dellago e controllo del battito cardiaco fetale.

83 Complicanze immediate Procedurali : Prelievo difficile (dry tap, bloody tap, ripetizioni) Postprocedurali Contrazioni dolorose Bleeding Perdite di LA

84 Rischi materni Infezioni Iso-RH Ansia

85 Infezioni materne Amnioniti : 1/8000 Crane (1983) 0.1% Turnbull (1983) 1/1000 Schemmer (1993) Forme subcliniche ??? Complicanze mortali: rischio inesistente e non calcolabile Procedura non sterile Contaminazione secondaria a lesioni intestinali

86 Altri rischi materni Iso-Rh : rischio di emorragia feto-materna in amniocentesi non complicate è 11% (Tabor, 1986) Ansia : lo stress psicologico è comune ed è dipendente dalle indicazioni e dal counselling Immunoprofilassi antiD <20 sett : 250 IU IgG anti D >20 sett : 500 IU IgG anti D (raccomandazione grado B - RCOG, 1999)

87 Rischi fetali Danni diretti: perdite fetali, traumi Morbilità da rimozione del LA: respiratoria, ortopedica esperienza delloperatore In uno studio danese su 3000 gravidanze Leschot 1985 ha trovato una FLR di 1.53% per le prime 1500 A e di 0.47% per le successive

88 Traumi fetali La reale incidenza di traumi diretti fetali è sconosciuta Studi di follow-up neonatale suggeriscono 2-9% di lesioni cutanee minori (Epler 79) Isolati gravi danni sono stati descritti: testa, porencefalia, cecità unilaterale, danni intestinali (atresia ileale con fistola ileocutanea), arti inferiori, infarto di un braccio, rottura del tendine patellare, lesioni di nervi periferici

89 Prelievo dei Villi Coriali INDICAZIONI: Determinazione del cariotipo fetale età materna avanzata (>35 anni);età materna avanzata (>35 anni); genitore portatore di arrangiamentogenitore portatore di arrangiamento cromosomico strutturale;cromosomico strutturale; genitore con aneuploidie dei cromosomi sessuali compatibili con la fertilità;genitore con aneuploidie dei cromosomi sessuali compatibili con la fertilità; precedente figlio con malattia cromosomica;precedente figlio con malattia cromosomica; malformazioni fetali rilevate allesame ecografico;malformazioni fetali rilevate allesame ecografico; test ecografico o biochimico che indichi un rischio elevattest ecografico o biochimico che indichi un rischio elevat per sindrome di Down o altra anomalia cromosomica; per sindrome di Down o altra anomalia cromosomica; Esame del DNA fetale Esame del DNA fetale Studio di attività enzimatiche

90 Prelievo dei Villi Coriali Prima del prelievo: Effettuare un adeguato counseling Far firmare il modulo del consenso informato; Eseguire un controllo ecografico per valutare numero e vitalità dellembrione/i, rilevarne la biometria (CRL), localizzare il chorion frondosum e scegliere il punto più idoneo per linserzione dellago.

91 Prelievo dei Villi Coriali Modalità di esecuzione dellesame: Via transcervicale mediante catetere di polietilene con mandrino di alluminio o pinza da biopsia rigida; Via transaddominale mediante ago di calibro di 20 Gauge e lunghezza adeguata.

92 Prelievo dei Villi Coriali

93 Complicanze Perdita fetale:Perdita fetale: Il prelievo dei villi coriali comporta un rischio aggiuntivo di perdita fetale dell3%, correlato a diversi fattori: Il prelievo dei villi coriali comporta un rischio aggiuntivo di perdita fetale dell3%, correlato a diversi fattori: età materna avanzata; età materna avanzata; numero di tentativi di prelievo; numero di tentativi di prelievo; assetto citogenetico della placenta (mosaicismo); assetto citogenetico della placenta (mosaicismo); epoca di gravidanza; epoca di gravidanza; esperienza delloperatore. esperienza delloperatore. RCOG, 2005

94 Prelievo dei Villi Coriali Lesioni e malformazioni fetali: Il prelievo dei villi coriali eseguito primo della 10a settimana si associa ad un aumentato rischio di malformazioni degli arti (soprattutto trasverse limb defects) e di anomalie della regione oromandibolare (ipoplasie oro-mandibolari). Altre complicanze: Complicanze settiche (più frequenti in caso di CVS-TC, rare in caso di CVS-TA); Isoimmunizzazione Rh in caso di donne Rh negative con test di Coombs negativo (è opportuno effettuare profilassi mediante iniezione di immunoglobuline anti-D). RCOG, 2005

95 Prelievo dei Villi Coriali Successo e accuratezza diagnostica Successo del prelievo nel 98% dei casi al primo tentativo, nel 99,8% con due tentativi; Fallimento dellesame nello 0,5-1% dei casi per scarsità del materiale prelevato; Falsi positivi dellesame citogenetico nell1% dei casi circa per la presenza di mosaicismi placentari (90%) e raramente per aneuploidie non a mosaico; Falsi negativi degli esami citogenetici sono rarissimi (1 su 3000) utilizzando la sola tecnica diretta, eccezionali (1 su ) utilizzando lanalisi diretta insieme a quella colturale. SIEOG, 2006

96 CordocentesiINDICAZIONI Studio dei parametri ematologici del feto per la diagnosi di: difetti dellemostasi (emofilia, trombocitopenia alloimmune), patologia ematologiche (anemia fetale su base infettiva o per alloimmunizzazione materno-fetale); Determinazione rapida del cariotipo fetale (48-72 ore) nei casi di: mosaicismo o fallimento di precedenti prelievi, positività di markers ecografici di cromosomopatia, malformazione fetale potenzialmente associata a cromosomopatia; SIEOG, 2006

97 Cordocentesi INDICAZIONI Terapie mediche fetali, quali: somministrazione di sangue e/o piastrine, somministrazione di farmaci antiaritmici in feti con aritmie cardiache; Studio del DNA fetale; Ricerca di agenti infettivi.

98 Cordocentesi Prima del prelievo: Effettuare un adeguato counseling; Far firmare il modulo del consenso informato; Eseguire un controllo ecografico per valutare la posizione del feto, rilevarne la biometria, localizzare la placenta e scegliere il punto più idoneo per linserzione dellago.

99 Diritti umani e bioetica Diritti di I generazione (diritti civili: vita, libertà), nati per difendere il cittadino dai poteri dallo Stato Diritti di II generazione (diritti sociali: salute, lavoro, istruzione, informazione, ecc.), che invece richiedono lincremento degli interventi statali Diritti di III generazione (solidarietà, sviluppo, pace internazionale, ambiente protetto, comunicazione, ecc.) Diritti di IV generazione ( diritti delle generazioni future, diritto ad un patrimonio genetico non manipolato, ecc.) Questi ultimi diritti toccano da vicino la bioetica che, tuttavia, li abbraccia tutti Questi ultimi diritti toccano da vicino la bioetica che, tuttavia, li abbraccia tutti (es. diritto alla vita nellaborto, diritto alla libertà nella procreazione assistita, ecc.), pur nella difformità di vedute dei diversi orientamenti etici. Il tema dei diritti è centrale in bioetica Il tema dei diritti è centrale in bioetica, anche perché parlare di diritti significa elaborare un codice etico comune, in vista di un consenso condiviso

100 Chi ha diritto ai Diritti? Ancora oggi uomo non è per tutti sempre lequivalente di persona (cioè soggetto di diritti), come vedremo nella prossima lezioneAncora oggi uomo non è per tutti sempre lequivalente di persona (cioè soggetto di diritti), come vedremo nella prossima lezione

101 Modelli etici Attualmente possiamo distinguere quattro modelli di riferimento in bioetica, ognuno dei quali si caratterizza per un differente criterio antropologico e, di conseguenza, per una diversa formulazione del giudizio etico: MODELLO LIBERAL-RADICALE MODELLO PRAGMATICO-UTILITARISTA MODELLO SOCIO-BIOLOGISTA MODELLO PERSONALISTA

102 Modello personalista Fondato sulla persona intesa come realtà singola ma anche come linsieme delle persone Nasce dalla concezione filosofica delluomo come persona, nella quale luniverso raggiunge la massima espressione, mentre lo stesso mondo materiale acquista il suo significato. La persona umana ha, quindi, nel mondo un primato, perciò anche la società va considerata in funzione delluomo, non viceversa Poiché la natura ontologica delluomo è unità di corpo e spirito, la morale ed i principi di riferimento del modello personalista non possono non riferirsi al rispetto ed alla promozione di tutto luomo, senza trascurare né la corporeità, né la spiritualità

103 Modello personalista Le dimensioni fondamentali che qualificano l'uomo in quanto persona sono: L'inscindibilità degli aspetti corporei - psichici - spirituali (il corpo non è solo un complesso di organi e funzioni, ma espressione visibile e luogo della realizzazione dell'uomo); La libertà e la responsabilità che nascono dall'intelligenza e dalla volontà; L'eticità che deriva dalla naturale apertura al Valore Assoluto; Il diritto alla vita che è premessa indispensabile a tutti i diritti e i valori; La relazionalità che rende ragione della dimensione sociale di ogni problema umano (il problema morale ha sempre una dimensione sociale)


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