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L’analisi delle sequenze in virologia. La variabilità dei virus Basi genetiche –Elevato tasso di replicazione –Errori delle polimerasi virali RNA polimerasi.

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Presentazione sul tema: "L’analisi delle sequenze in virologia. La variabilità dei virus Basi genetiche –Elevato tasso di replicazione –Errori delle polimerasi virali RNA polimerasi."— Transcript della presentazione:

1 L’analisi delle sequenze in virologia

2 La variabilità dei virus Basi genetiche –Elevato tasso di replicazione –Errori delle polimerasi virali RNA polimerasi Trascrittasi inversa

3 La variabilità di HIV In un individuo con infezione da HIV virioni/giorno RT: 1 errore / nts Solo alcuni mutanti sono vitali Una mutazione adattativa in env ogni 2,5 mesi

4 Mutazioni Delezioni/dupplicazioni Ricombinazioni Riassortimento

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6 Selezione da parte del substrato (adattamento) Pressione selettiva da parte dell’immunità …………………… Selezione di varianti resistenti in presenza del farmaco

7 Il genoma virale regioni altamente variabili regioni conservate

8 Virus dell’epatite C: funzioni del genoma NS5 UTR 3’ NS4 NS3 NS2 E2/ NS1 E1C UTR 5’ Structural region Non srtructural region helicase/ protease RNA-dep RNA-PolCapsid/coreEnvelope glycoproteins % nucleotide homology 5’UTR conservata. Specifici polimorfismi 6 genotipi, diversi sottotipi E2 possiede regioni variabili e ipervariabili (aa 1-27)

9 In env (gp120) regioni ipervariabili V1-V5 alternate a regioni relativamente costanti C1-C5 Sottopopolazioni eterogenee e mutevoli all’interno dello stesso individuo Dominio immunodominante altamente conservato in gp41

10 Identificazione e tipizzazione Subtipizzazione (intratipica): polio selvaggio da vaccinale, influenza... genotipizzazione: HCV, HIV, HPV … Genotipi Sottotipi Varianti quasispecie Interesse epidemioloico Applicazioni diagnostiche: associazione genotipo/patogenicità genotipo/resistenza

11 DdeI HaeIII DdeI HaeIII M : Sabin 1 2: Sabin 2 3: Sabin 3 M: bp ladder 100 pb 200 pb 300 pb Rivelazione e identificazione di virus polio mediante RT-PCR e tipizzazione mediante RFLP : Sabin 1 2: Sabin 2 3: Sabin 3 4: “0” RNA 5: virus polio 1 di isolamento clinico 6: virus polio 2 di isolamento clinico 7: virus polio 3 di isolamento clinico 8: pb ladder 480 pb 1380 pb 517 pb 459 pb 397 pb 247 pb C.Medici, 2003

12 HCV genotipi e sottotipi

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14 HCV: genotipizzazione Heteroduplex mobility analysis using temperature gradient capillary electrophoresis (HMA-TGCE)

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18 Eterogeneità dei ceppi di HIV Tropismo cellulare Cinetica di replicazione Citopaticità Capacità di formare sincizi Latenza e inducibilità Sensibilità ad Ab neutralizzanti o enhancing Antigene

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21 Variabilità HIV Variabilità delle popolazioni di HIV in un individuo infetto 6-10% All’interno di una stessa clade15-30% Variabilità interclade30-40% % variabilità diversa a seconda del gene analizzato Alto tasso di ricombinazione genetica: numerosi ricombinanti interclade

22 applicazioni Molecular epidemiology of HIV transmission in a dental practice Ou et al 1992

23 Applicazioni Analysis of a rape case by direct sequencing of the human immunodeficiency virus type 1 pol and gag genes. Albert et al.1994

24 applicazioni Genetic and phylogenetic analyses of HIV-1 corroborate the transmission link hypothesis Pistello et al 2004

25 Amplificazione della sequenza target dai campioni in oggetto Amplificazione della stessa sequenza da controlli positivi da campioni di soggetti non collegati al caso, nella stessa\area geografica Sequenze di riferimento da banca dati Confronto

26 Organizzazione del genoma di HPV E6 E7 E2 E4 E5 L1 L2 E1 LCR trasformazione (p53-pRb ) trasformazione replicazione episomica proteina tardiva, legame citocheratine regolazione della trascrizione e replicazione DNA proteine capsidiche P97 Long control region,LCR, regione più variabile L L1, E6 E7 genotipi (>80) differenze >10% Sottotipi Differenze 2-10% Varianti Differenze < 2%

27 HPV: applicazioni diagnostiche PCR tipo-specifiche (variazioni E6,E7) Una PCR “universale” con primers di consenso (regione conservata L1) Tipizzazione dell’amplicone –sonde tipo-specifiche – RFLP –Sequenziamento –Line blot assay Hybrid capture (Digene) Primers esterni MY09-MY11 Primers interni GP5-GP6 Amplificazione con SPF10 segmento 65 pb L1 ibridazione)

28 HPV: applicazioni diagnostiche Correlation of cervical carcinoma and precancerous lesions with human papillomavirus (HPV) genotypes detected with the HPV DNA microarray method An et al. Cancer, Consensus amplification e probes (30 nts) in grado di individuare e discriminare 22 tipi HPV

29 Marcatori di patogenicità JCV PML

30 Delezioni e duplicazioni della regione di controllo della trascrizione di JCV e PML* (Ciappi et al 1999) Leucoencefalopatia Multifocale Progressiva

31 Resistenza Individuazione di mutazioni associate alla resistenza ad un farmaco antivirale HIV HBV CMV ………………...

32 CMV-ganciclovir (GCV) Basi resistenza UL97 kinasiUL54 DNA pol dopo terapia a breve +dopo terapia termineprolungata

33 Mutanti resistenti UL97: sostituzioni aa 460, 520, 594, 595 delezioni , Mutanti resistenti UL54: regione exo-II e C resistenza crociata verso cidofovir e foscarnet

34 Resistenza a Lamivudina in HBV Mutazione predominante: Met550Val/Ile Sito YMDD – DNA pol/ minor efficienza replicazione Mutazioni accessorie:Leu526 Met, Val553 Ile, Ala 546 Val, ………  possibili effetti anche su HBsAg

35 Epidemiologia molecolare Confronto isolati “flu” B Sud-Africa Isolamento Amplificazione HA Sequenziamento Sequenze banche dati Allineamento sequenze BLAST 2* Allineamenti multipli e costruzione albero filogenetico CLUSTAL X PHILIP* Basic alignement search tool Phylogeny inference package

36 Epidemiologia molecolare Molecular epidemiology of measles viruses in the United States, –Endemia –Casi di importazione –Ceppi vaccinali e selvaggi (oltre 20 genotipi) Rota et al,2002 Analisi sequenze parte NP e HA

37 Un nuovo coronavirus possibile causa di SARS Fine marzo 2003 Segnalazioni di individuazione del virus in casi di SARS in laboratori diversi : –Cina (Singapore e Hong Kong) –USA –Germania –Canada –Francia

38 RT-PCR per coronavirus Ricerca di sequenze conservate nel gene della polimerasi, ORF1b, tramite GenBank e allineamento dei genomi dei coronavirus noti Sintesi dei primers e amplificazione Sequenziamento e confronto con sequenze in banca dati

39 Nuovo coronavirus Sequenziamento intero genoma ( nts) Deduzione delle sequenze proteiche Confronto con genomi coronavirus in banche dati

40 Da analisi ORF1b replicasi Subgroup 2a ? 2b ?

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42 Virus respiratori: applicazioni diagnsotiche Microarray-based detection and gentyping of viral pathogens. Wang et al. PNAS, 2002 Microarray “spotted” con oligonucleotidi (70 nts) rappresentativi di sequenze conservate di virus di interesse. Ogni chip contiene 1600 sonde Amplificazione con random primers Ibridazione su microarray Identificazione di virus respiratori tra enterovirus, rhinovirus, paramyxovirus, adenovirus e herpesvirus


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