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Diretto o a "sandwich”: accertare la presenza di un antigene; indiretto: accertare la presenza di un anticorpo specifico contro un antigene Saggio Immunoenzimatico.

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Presentazione sul tema: "Diretto o a "sandwich”: accertare la presenza di un antigene; indiretto: accertare la presenza di un anticorpo specifico contro un antigene Saggio Immunoenzimatico."— Transcript della presentazione:

1 diretto o a "sandwich”: accertare la presenza di un antigene; indiretto: accertare la presenza di un anticorpo specifico contro un antigene Saggio Immunoenzimatico ELISA

2 ELISA DIRETTO: 1)Ieri coating con anticorpo anti IL-2 2)Stamattina blocking con PBS-BSA3% 3)CAMPIONI e curva standard: su piastra diversa preparare diluizione campioni MLR e curva standard. Campioni  tal quale + 3 diluizioni 1:2, partire da volume di 250 µl, diluire in 125µl di reagent diluent Curva standard  fare 7 diluizioni a partire da 2ng/ml, dil 1:2, da volume di 250 µl, diluire in 125µl di reagent diluent, 8° pozzetto SOLO reagent diluent. CONC. Iniziale rIL ng/ml 4) 2 lavaggi con 200µl PBS-TWEEN 0,05%, poi 50 µl/well

3 A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10A11A12 B1B2B3B4B5B6B7B8B9B10B11B12 C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C12 D1D2D3D4D5D6D7D8D9D10D11D12 E1E2E3E4E5E6E7E8E9E10E11E12 F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10F11F12 G1G2G3G4G5G6G7G8G9G10G11G12 H1H2H3H4H5H6H7H8H9H10H11H12

4 1:2 PIASTRA ELISA

5 PIASTRA “gemella” x diluizioni prepare 250µl di IL-2 2ng/ml in RD (Ci IL2 140 ng)

6 PIASTRA “gemella” x diluizioni prepare 250 ul di IL2 2 ng/ml in RD (Ci IL2 140 ng) 1:2 Dilute1:2 from well A1; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A1) Dilute1:2 from well A2; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A2) Dilute1:2 from well A3; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A3) … ONLY 125 ul RD

7 STD 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 bianco 250 µl 125 µl

8 PIASTRA ELISA

9 PIASTRA “gemella” x diluizioni

10 eg. hormones drugs tumour antigens cytokines Sandwice ELISA (direct) to detect Antigenes

11 1.Anti-analyte capture antibody purified Direct: sandwice ELISA to detect Antigenes Coating

12 2. BSA 1-3% 1. Anti-analyte Blocking

13 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte Standard-Sample

14 biotin Detection 4. Antibody-biotinilated 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte

15 5. Streptavidin-enzyme HRP 4. Anti-analyte-biotin 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte biotin Streptavidin-HRP Conjugation Sandwice ELISA (direct) to detect Antigenes

16 6. TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA 5. Streptavidin-enzyme 4. Anti-analyte-biotin 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte biotin Streptavidin-HRP Substrate biotin Streptavidin-HRP

17 7. H 2 SO 4 1N 6. TMB 5. Streptavidin-enzyme 4. Anti-analyte-biotin 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte biotin Streptavidin-HRP Stop reaction

18 Analisi Quantitativa: la retta standard nel saggio diretto Sandwich, y=mx+q L’intensità della reazione colorimetrica è proporzionale alla quantità di enzima La quantità di enzima presente nel pozzetto è proporzionale alla quantità di anitcorpo secondario La quantità di anticorpo secondario è proporzionale alla quantità di ANTIGENE Quindi l’intensità della reazione colorimetrica è proporzionale alla quantità di antigene! biotin Streptavidin-HRP

19 Per domani portare un computer per gruppo analisi elisa sandwich

20 Lab ed. U4, 5° piano Uff. 2027/B - ed. U3, 2° piano


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