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Moderne tecniche diagnostiche: dallematossilina-eosina alla proteomica Moderne tecniche diagnostiche: dallematossilina-eosina alla proteomica Roma 2-4.

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1 Moderne tecniche diagnostiche: dallematossilina-eosina alla proteomica Moderne tecniche diagnostiche: dallematossilina-eosina alla proteomica Roma 2-4 dicembre 2004 Prof. Lorenzo Lo Muzio CORSO MULTIDISCIPLINARE DI PATOLOGIA ORALE: NEOPLASIE DEI TESSUTI MOLLI E DURI DEL CAVO ORALE

2 Lakhani S.R. and Ashworth A. NATURE REV CANCER 2001; 1:151-7 Lakhani S.R. and Ashworth A. NATURE REV CANCER 2001; 1:151-7 Evoluzione della patologia Debebele & Forsson: Primo microscopio Debebele & Forsson: Primo microscopio Malpighi: Microcircolo capillare Malpighi: Microcircolo capillare Virchow: Basi cellulari delle malattie Virchow: Basi cellulari delle malattie Primo paper su immunoistochimica PCR Microarray Genoma umano ? ?

3 Lakhani S.R. and Ashworth A. NATURE REV CANCER 2001; 1:151-7 Lakhani S.R. and Ashworth A. NATURE REV CANCER 2001; 1:151-7 Microarray and histopathological analysis of tumours: The future and the past? Microarray and histopathological analysis of tumours: The future and the past?

4 Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92:650-9 Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2002; 93:56-74 Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92:650-9 Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2002; 93:56-74 Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology Part I: Molecular methods Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology Part I: Molecular methods Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods

5 Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92: Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92: Guest Editorial Histopathology meets molecular pathology. Guest Editorial Histopathology meets molecular pathology. Histopathology remains at the core of disease diagnosis….. ……Dont ask me to run a gel electrophoresis or extract DNA from a specimen and amplify it by polimerase chain reaction…. Histopathology remains at the core of disease diagnosis….. ……Dont ask me to run a gel electrophoresis or extract DNA from a specimen and amplify it by polimerase chain reaction….

6 Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92: Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92: Guest Editorial Histopathology meets molecular pathology. Guest Editorial Histopathology meets molecular pathology. Working together (surgical pathologists and molecular scientist), molecular tools can be applied to practical problems to better understand disease mechanisms and improve diagnostic skills, ultimately aiding in the development of rational therapeutic regimens…..

7 Definizione etiologica Patogenesi Terapia mirata Prognosi Definizione etiologica Patogenesi Terapia mirata Prognosi La biopsia diagnostica quando e perché? La biopsia diagnostica quando e perché?

8 Membrana e parete Antigeni parietali / capsulari / somatici / nucleici Acidi nucleici (DNA / RNA) Strutture citoplasmatiche Recettori Membrana e parete Antigeni parietali / capsulari / somatici / nucleici Acidi nucleici (DNA / RNA) Strutture citoplasmatiche Recettori Identificazione di componenti in cito-istopatologia Strutture identificabili Identificazione di componenti in cito-istopatologia Strutture identificabili

9 microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare Possibili metodiche istologiche e su tessuti

10 Esame morfologico (su preparati citologici o bioptici): alterazioni citopatiche nucleo-citoplasmatiche presenza strutture esogene Immunoistochimica/immunofluorescenza: antigeni di membrana/citoplasmatici/nucleari (anche in assenza di evidenti manifestazioni cliniche e/o di alterazioni citomorfologiche) Ibridazione molecolare: in situ estrattiva (priva di dettagli morfologici) Esame morfologico (su preparati citologici o bioptici): alterazioni citopatiche nucleo-citoplasmatiche presenza strutture esogene Immunoistochimica/immunofluorescenza: antigeni di membrana/citoplasmatici/nucleari (anche in assenza di evidenti manifestazioni cliniche e/o di alterazioni citomorfologiche) Ibridazione molecolare: in situ estrattiva (priva di dettagli morfologici)

11 microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare Possibili metodiche istologiche e su tessuti

12 microscopia ottica colorazioni speciali Van Gieson (collageno) Colorazione tricromica (collageno, fibre muscolari) impregnazione argentica (reticolina – collag tipo III, membrana basale – collag IV) acido Periodico di Schiff (membrana basale – collageno tipo IV, carboidrati….) Ematossilina di Verhoeff (elastina) Resorcina (elastina) Fucsina (elastina) Orceina (elastina) Metodo di Feulgen (DNA nucleare) Rosso Congo (amiloide) Metodo argentico di Masson-Fontana (melanina…) Sudan (lipidi) Argento-Metenamina di Jones (membrana basale glomerulare) microscopia ottica colorazioni speciali Van Gieson (collageno) Colorazione tricromica (collageno, fibre muscolari) impregnazione argentica (reticolina – collag tipo III, membrana basale – collag IV) acido Periodico di Schiff (membrana basale – collageno tipo IV, carboidrati….) Ematossilina di Verhoeff (elastina) Resorcina (elastina) Fucsina (elastina) Orceina (elastina) Metodo di Feulgen (DNA nucleare) Rosso Congo (amiloide) Metodo argentico di Masson-Fontana (melanina…) Sudan (lipidi) Argento-Metenamina di Jones (membrana basale glomerulare)

13 microscopia ottica colorazioni speciali per microrganismi Gram Ziehl-Neelsen Giemsa metodo di Wade-Fite (lebbra) metodo argentico di Grocott (miceti e Pneumocystis) acido Periodico di Schiff (miceti, protozoi, elminti….) Giemsa (protozoi, elminti….) metodi di Dieterle o Warthin - Starry (spirochete e legionelle) orceina di Shikata (HBV) colorazione di Lugol Argento-Metenamina di Gomori microscopia ottica colorazioni speciali per microrganismi Gram Ziehl-Neelsen Giemsa metodo di Wade-Fite (lebbra) metodo argentico di Grocott (miceti e Pneumocystis) acido Periodico di Schiff (miceti, protozoi, elminti….) Giemsa (protozoi, elminti….) metodi di Dieterle o Warthin - Starry (spirochete e legionelle) orceina di Shikata (HBV) colorazione di Lugol Argento-Metenamina di Gomori

14 Immunoistochimica Prevede il legame di anticorpi primari specifici con lantigene, lanticorpo o con il complesso antigene-anticorpo da ricercare. La positività del test è evidenziato dallimpiego di un anticorpo secondario coniugato con un cromogeno Prevede il legame di anticorpi primari specifici con lantigene, lanticorpo o con il complesso antigene-anticorpo da ricercare. La positività del test è evidenziato dallimpiego di un anticorpo secondario coniugato con un cromogeno CromogenoCromogeno AnticorposecondarioAnticorposecondario AnticorpoprimarioAnticorpoprimario Complesso Anticorpo primario – secondario – cromogenoComplesso Anticorpo primario – secondario – cromogeno Cellula target

15 fissazione in formalina tamponata neutra (soluzioni acide riducono lantigenicità tissutale) fissazione immediata processazione del campione fissato entro ore sezioni di 4-5 micron smascheramento dellantigene amplificazione dellantigene fissazione in formalina tamponata neutra (soluzioni acide riducono lantigenicità tissutale) fissazione immediata processazione del campione fissato entro ore sezioni di 4-5 micron smascheramento dellantigene amplificazione dellantigene Standardizzazione della tecnica

16 La fissazione in paraffina provoca: legami proteine-proteine legami proteine-acidi nucleici legami con ioni calcio con mascheramento o danneggiamento degli epitopi a causa dellalterazione tridimensionale delle proteine Smascheramento antigenico: digestione enzimatica (soluzione di proteasi, tripsina o pepsina), bollitura, forno a microonde…. La fissazione in paraffina provoca: legami proteine-proteine legami proteine-acidi nucleici legami con ioni calcio con mascheramento o danneggiamento degli epitopi a causa dellalterazione tridimensionale delle proteine Smascheramento antigenico: digestione enzimatica (soluzione di proteasi, tripsina o pepsina), bollitura, forno a microonde…. Smascheramento antigenico

17 Coniugazione o attacco di un marker enzimatico ad un anticorpo secondario e formazione di un complesso terziario: Avidina-Biotina-Perossidasi (ABC) Perossidasi-anti-perossidasi (PAP) Fosfatasi Alcalina/anti-Fosfatasi Alcalina (APAAP) Envision (Polymer detection) Coniugazione o attacco di un marker enzimatico ad un anticorpo secondario e formazione di un complesso terziario: Avidina-Biotina-Perossidasi (ABC) Perossidasi-anti-perossidasi (PAP) Fosfatasi Alcalina/anti-Fosfatasi Alcalina (APAAP) Envision (Polymer detection) Amplificazione antigenica CromogenoCromogeno AnticorposecondarioAnticorposecondario AnticorpoprimarioAnticorpoprimario Complesso Anticorpo primario – secondario – cromogenoComplesso Anticorpo primario – secondario – cromogeno Cellula target

18 uso di sezioni tissutali routinarie sistema sensibile (bassi livelli di antigene) sistema specifico (dipende da specificità dellanticorpo) uso di sezioni tissutali routinarie sistema sensibile (bassi livelli di antigene) sistema specifico (dipende da specificità dellanticorpo) Vantaggi stesso antigene presente in diverse patologie/neoplasie reazione con diversi antigeni no utile per differenziare lesioni benigne e maligne uso di più anticorpi per identificare un tipo specifico di lesione/neoplasia soggettività della valutazione per molti antigeni necessità di controlli positivi e negativi molti anticorpi funzionano solo su sezioni congelate stesso antigene presente in diverse patologie/neoplasie reazione con diversi antigeni no utile per differenziare lesioni benigne e maligne uso di più anticorpi per identificare un tipo specifico di lesione/neoplasia soggettività della valutazione per molti antigeni necessità di controlli positivi e negativi molti anticorpi funzionano solo su sezioni congelate Svantaggi

19 Identificazione cellulare EpitelialiCitocheratine (CK) MesenchimaliVimentina MuscolariDesmina Actine Mioglobina miogenina NeuronaliS-100 GFAP Neurofilamenti CD57 (NK o tumori neuronali) EndotelialiCD31 CD34 Fattore VIII MelanocitiHMB45 MART-1 S100 LinfoidiKappa e lambda CD3, 15, 20, 30, 45, 68, 79a ALK-1 TdT SalivariS100, actina

20 Antigeni associati ai tumori CarcinomaCitocheratine (CK) AdenocarcinomiCitocheratine (CK) RabdomiosarcomaDesmina, Actina, Mioglobina, miogenina, actina muscolo-specifica LeiomiosarcomaActina muscolo liscio neurosarcomaNeurofilamenti, S100 MelanomaHMB45, MART-1 (melan-A), S100 Angiosarcoma e S. KaposiCD31, 34, fattore VIII Tumore di Ewing e Neuroendocrini CD99 (MIC2 gene product) Cellule di LangerhansCD1a Tumori SalivariS100, actina, calponina Limfomi a cellule B a cellule T a grandi cell anaplastiche (Ki-1) CD45, CD45RB CD20, CD791, CD45RA CD3, CD43, CD45RO CD30 (Ber-H2 clone), ALK-1 Limfoma di di HodgkinCD15, CD30 Infiltrati leucemiciTdT, mieloperossidasi MielomaCatene leggere kappa e lambda Carcinoma neuroendocrino e paraganglioma Neurofilamenti, cromogranina, sinaptofisina Tumore a cellule di MerkelCromogranina, sinaptofisina Tumore fibroso solitarioCD34, CD99, bcl-2

21 Profilo immunoistochimico delle metastasi epiteliali Profilo immunoistochimico delle metastasi epiteliali TUMOREPROFILO ANTIGENICO Polmone (adeno)CK7+ CK20- VILLINA+ Polmone (SCC)CK7- CK20- ColonCK7- CK20+ VILLINA+ MammellaCK7+ CK20- VILLINA- ReneCK7- CK20- VILLINA- ProstataCK7- CK20- PSA+ Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA. Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology. Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2002; 93:56-74 Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA. Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology. Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2002; 93:56-74

22 microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare Possibili metodiche istologiche e su tessuti

23 Limmunofluorescenza Coons AH, Creech HJ, Jones RN Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med 1941; 47: Coons AH, Creech HJ, Jones RN Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med 1941; 47: FluorocromoFluorocromo Anti-Auto Ab Auto Ab Complesso Anti-Auto Ab FluorocromoComplesso Auto Ab Anti-Auto Ab Fluorocromo Immunofluorescenza diretta Cellula target Introdotta nel 1941 da Coons et al. è basata sul legame chimico tra il fluorocromo e lanticorpo. La positività del test è riconducibile allintensità della colorazione. Introdotta nel 1941 da Coons et al. è basata sul legame chimico tra il fluorocromo e lanticorpo. La positività del test è riconducibile allintensità della colorazione.

24 Immunofluorescenza IF DIRETTA IF INDIRETTA IgG anti-umane marcate con fluorescina (FITC) Siero del paziente (con autoAb) Tessuto di controllo Biopsia del paziente (auto Ab in tessuto)

25 identificazione di anticorpi o altre proteine flogistiche in patologie autoimmunitarie (IgG, IgA, IgM, C3 e fibrinogeno) identificazione di antigeni esogeni (virus….) identificazione di antigeni o componenti della cellula identificazione di anticorpi o altre proteine flogistiche in patologie autoimmunitarie (IgG, IgA, IgM, C3 e fibrinogeno) identificazione di antigeni esogeni (virus….) identificazione di antigeni o componenti della cellula Applicazioni dellimmunofluorescenza diretta

26 Immunofluorescenza in lesioni orali PatologiaIgGIgAIgMC3Fibrinogeno PemfigoMembr cellneg Membr cellneg Pemfigoide benigno delle mucose Memb bas lin neg Lupus oraleMemb bas granul negMemb bas granul Memb bas – Lamina superf Lichen oraleNeg Memb bas fin granul Memb bas – Lamina superf Eritema multiformeNeg Memb bas fin granul neg Malattia lineare a IgANegMemb basNeg Epidermolisi bollosa acquisitaMemb bas wide NegMemb bas wide neg Stomatite ulcerativa cronicaNucleareNeg Memb bas – Lamina superf Infiammazione cronica aspecifica neg NegMemb bas fin granul neg

27 ImmunoistochimicaImmunofluorescenza VantaggiBuona conservazione del colore Strutture tissutali facilmente identificabili Maggiore sensibilità Tecnica semplice Migliore contrasto Facile identificazione di elementi anche molto piccoli Il risultato è visualizzabile subito dopo la reazione immunologica SvantaggiTecnica complessa Contrasto mediocre Non identifica lenzima marcato ma i prodotti della reazione La fluorescenza decade rapidamente Strutture tissutali difficilmente identificabili Necessità di microscopio a fluorescenza Sezioni immediatamente congelate o trattate Steroidi topici falsi negativi (1 mese) Vantaggi e svantaggi IF Ep IHC Laminina 5: immunoistochimica ed immunofluorescenza

28 microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia confocale microscopia elettronica ibridazione molecolare microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia confocale microscopia elettronica ibridazione molecolare Possibili metodiche istologiche e su tessuti

29 Microscopia confocale laser White JG, AmosWBand FordhamM. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. Journal of Cell Biology 1987; 105: 41–48. White JG, AmosWBand FordhamM. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. Journal of Cell Biology 1987; 105: 41–48. Sorgente laser Monitor Preparato Obiettivo Digital Imaging System Testa dello scanner Introdotto negli anni 80 permette di ottenere: immagini prive di fluorescenze dovute a strutture non poste sul piano focale maggiori dettagli delle cellule ricostruzione 3D delle immagini. Introdotto negli anni 80 permette di ottenere: immagini prive di fluorescenze dovute a strutture non poste sul piano focale maggiori dettagli delle cellule ricostruzione 3D delle immagini.

30 microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia confocale microscopia elettronica ibridazione molecolare microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia confocale microscopia elettronica ibridazione molecolare Possibili metodiche istologiche e su tessuti

31 Microscopia otticaMicroscopia elettronica Osservazione diretta con colori originaliOsservazione indiretta su schermo. Foto solo in bianco e nero Modesto ingrandimento, fino a 1500x, ma ampio campo e facile orientamento Notevole ingrandimento fino a 2,000,000x Potere di risoluzione fino a 0.25 µm.Potere di risoluzione fino a 1 nm (0.001µm.) Sezioni criostatate anche solo 20 minuti.Almeno 24 ore Possibili artefattiBuona fissazione e preparazione assicurano alta risoluzione, notevole ingrandimento e pochi artefatti Lo spessore delle sezioni (1-30 µm) permette una ridotta profondità di campo per poter avere 3D della struttura esaminata. Necessarie sezioni seriate. Sezioni supersottili, ma le informazioni 3-D possono essere ottenute: (a) sezioni più spesse con ME as alto voltaggio; (b) SEM (scanning electron microscopy) Le colorazioni sono usate selettivamente e la maggior parte dei materiali e delle strutture non può essere esaminata nello stesso momento La colorazione con metalli pesanti permette una migliore comprensione delle strutture cellulari: membrane, granuli, filamenti, cristalli…. Campioni grandi e viviCampioni molto piccoli, difficili da gestire Costi ridottiCosti notevoli

32 microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare Possibili metodiche istologiche e su tessuti

33 Ibridazione molecolare In situ: Isotopica Cromogenica (C.I.S.H.) Fluorescente (F.I.S.H.) Estrattiva: Dot blotting Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Ibridazione molecolare In situ: Isotopica Cromogenica (C.I.S.H.) Fluorescente (F.I.S.H.) Estrattiva: Dot blotting Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)

34 Ibridazione molecolare In situ Ibridazione molecolare In situ L'ibridazione in situ rivela acidi nucleici in campioni cito-istologici morfologicamente preservati. La tecnica prevede la formazione di ibridi di acidi nucleici costituiti da DNA endogeno a catena unica (denaturata) o mRNA e da una sequenza complementare di acidi nucleici esogeni a singola catena marcata con radioisotopo, con tracciante fluorescente (FISH) o con cromogeni osservabili in microscopia ottica (CISH). L'ibridazione in situ rivela acidi nucleici in campioni cito-istologici morfologicamente preservati. La tecnica prevede la formazione di ibridi di acidi nucleici costituiti da DNA endogeno a catena unica (denaturata) o mRNA e da una sequenza complementare di acidi nucleici esogeni a singola catena marcata con radioisotopo, con tracciante fluorescente (FISH) o con cromogeni osservabili in microscopia ottica (CISH). Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. PNAS 1969;64: John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 1969;223: Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. PNAS 1969;64: John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 1969;223: Fissazione Denaturazione Ibridizzazione

35 Ibridazione molecolare - In situ Applicazioni cliniche Identificazione di DNA o RNA estraneo (virus, funghi, batteri e parassiti coltivabili con difficoltà o non coltivabili in vitro - es.: HPV e Pneumocystis carinii) La metodica, inoltre, consente la definizione specifica di tipo e ceppo. Alterazioni del DNA cellulare (amplificazione genica, traslocazioni…) Mutazioni geniche Espressione corretta o alterata di RNA cellulare (prodotti genici) Applicazioni cliniche Identificazione di DNA o RNA estraneo (virus, funghi, batteri e parassiti coltivabili con difficoltà o non coltivabili in vitro - es.: HPV e Pneumocystis carinii) La metodica, inoltre, consente la definizione specifica di tipo e ceppo. Alterazioni del DNA cellulare (amplificazione genica, traslocazioni…) Mutazioni geniche Espressione corretta o alterata di RNA cellulare (prodotti genici)

36 Ibridazione molecolare FISH Ibridazione molecolare FISH La FISH (Fluorescence in situ hybridization) è usata per mappare i geni sui cromosomi e caratterizzare le anomalie cromosomiche: u na sonda di DNA, marcata con biotina e specifica per un segmento cromosomico o un intero cromosoma (metafase) è ibridizzata ai cromosomi. Dopo il lavaggio si evidenzia la marcatura incubando con un anticorpo anti-biotina marcato con fluorocromo. La FISH (Fluorescence in situ hybridization) è usata per mappare i geni sui cromosomi e caratterizzare le anomalie cromosomiche: u na sonda di DNA, marcata con biotina e specifica per un segmento cromosomico o un intero cromosoma (metafase) è ibridizzata ai cromosomi. Dopo il lavaggio si evidenzia la marcatura incubando con un anticorpo anti-biotina marcato con fluorocromo. Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. PNAS 1969;64: John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 1969;223: Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. PNAS 1969;64: John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 1969;223:582-7.

37 Ibridazione molecolare FISH Ibridazione molecolare FISH La FISH può essere usata per determinare: Delezioni cromosomiche Traslocazioni Riarrangiamenti Amplificazioni La FISH può essere usata per determinare: Delezioni cromosomiche Traslocazioni Riarrangiamenti Amplificazioni Glassman AB. Cytogenetics, in situ hybridization and molecular approaches in the diagnosis of cancer. Ann Clin Lab Sci 1998;28: Okami K et al. Cyclin D1 amplification is independent of p 16 inactivation in head and neck squamous cell carcinoma. Oncogene 1999;18: Glassman AB. Cytogenetics, in situ hybridization and molecular approaches in the diagnosis of cancer. Ann Clin Lab Sci 1998;28: Okami K et al. Cyclin D1 amplification is independent of p 16 inactivation in head and neck squamous cell carcinoma. Oncogene 1999;18:

38 Ibridazione molecolare Estrattiva: Non amplificata Dot blotting Southern Blot (DNA) Northern Blot (RNA) Western Blot (Proteine) Amplificata Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Ibridazione molecolare Estrattiva: Non amplificata Dot blotting Southern Blot (DNA) Northern Blot (RNA) Western Blot (Proteine) Amplificata Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

39 SOUTHERN BLOT per DNA (Dr. Edward Southern, 1975) Taglio con enzimi di restrizione (frammentazione riproducibile del DNA) Separazione dei frammenti di restrizione tramite elettroforesi su gel Denaturazione del DNA e trasferimento (blotting) dal gel ad un substrato solido (filtro di nylon o nitrocellulosa) Incubazione del filtro con con una sonda molecolare specifica, marcata con radioisotopo Evidenziazione dei frammenti ibridizzati con la sonda tramite autoradiografia. SOUTHERN BLOT per DNA (Dr. Edward Southern, 1975) Taglio con enzimi di restrizione (frammentazione riproducibile del DNA) Separazione dei frammenti di restrizione tramite elettroforesi su gel Denaturazione del DNA e trasferimento (blotting) dal gel ad un substrato solido (filtro di nylon o nitrocellulosa) Incubazione del filtro con con una sonda molecolare specifica, marcata con radioisotopo Evidenziazione dei frammenti ibridizzati con la sonda tramite autoradiografia Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975;98:

40 NORTHERN BLOT per RNA Linearizzazione delle molecole di RNA in agente denaturante (formaldeide) Separazione del RNA tramite gel elettroforesi Trasferimento su filtro di nitrocellulosa Incubazione con una sonda marcata Autoradiografia. Linearizzazione delle molecole di RNA in agente denaturante (formaldeide) Separazione del RNA tramite gel elettroforesi Trasferimento su filtro di nitrocellulosa Incubazione con una sonda marcata Autoradiografia. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. PNAS 1977;74:

41 WESTERN BLOT per proteine Separazione di molecole proteiche in base al peso molecolare (estensione dell'elettroforesi su gel di poliacrilamide) Trasferimento dal gel a filtro di nitrocellulosa Incubazione con anticorpo specifico per la proteina in esame Visualizzazione del complesso antigene (proteina)/anticorpo legato alla proteina con sistema anti-immunoglobulina biotinilata e successiva rivelazione cromogena WESTERN BLOT per proteine Separazione di molecole proteiche in base al peso molecolare (estensione dell'elettroforesi su gel di poliacrilamide) Trasferimento dal gel a filtro di nitrocellulosa Incubazione con anticorpo specifico per la proteina in esame Visualizzazione del complesso antigene (proteina)/anticorpo legato alla proteina con sistema anti-immunoglobulina biotinilata e successiva rivelazione cromogena

42 Ibridazione molecolare Estrattiva: Non amplificata Dot blotting Southern Blot (DNA) Northern Blot (RNA) Western Blot (Proteine) Amplificata Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Ibridazione molecolare Estrattiva: Non amplificata Dot blotting Southern Blot (DNA) Northern Blot (RNA) Western Blot (Proteine) Amplificata Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

43 Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Procedura elaborata da Kary Mullis (premio Nobel) nel Metodica di amplificazione sequenziale ed evidenziazione del DNA (qualora presente in esiguo numero di copie) che permette di ottenere una quantità di acido nucleico misurabile e caratterizzabile. Procedura elaborata da Kary Mullis (premio Nobel) nel Metodica di amplificazione sequenziale ed evidenziazione del DNA (qualora presente in esiguo numero di copie) che permette di ottenere una quantità di acido nucleico misurabile e caratterizzabile.

44 Denaturazione delle doppie eliche di DNA Incubazione con due primers (oligonucleotidi, 20 basi) che corrispondano alle estremità del tratto di DNA che si vuole amplificare (primer di avvio e di stop) Aggiunta di nucleotidi e DNA-polimerasi termostabile. Sequenza di cicli di riscaldamento (denaturazione, copiatura ed estensione della sequenza) e raffreddamento (accoppiamento della catena neo- sintetizzata con quella originaria/stampo) Ripetizione per un numero di cicli sufficienti ad ottenere un numero di copie identificabili Denaturazione delle doppie eliche di DNA Incubazione con due primers (oligonucleotidi, 20 basi) che corrispondano alle estremità del tratto di DNA che si vuole amplificare (primer di avvio e di stop) Aggiunta di nucleotidi e DNA-polimerasi termostabile. Sequenza di cicli di riscaldamento (denaturazione, copiatura ed estensione della sequenza) e raffreddamento (accoppiamento della catena neo- sintetizzata con quella originaria/stampo) Ripetizione per un numero di cicli sufficienti ad ottenere un numero di copie identificabili Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) (4 copie) Riscaldamento Raffreddamento Denaturazione Aggiunta Primers Riassociazione Primers Riassociazione Primers Ciclo 1° Sequenza target DNA polimerasi, Nucleotidi Allungamento primers Allungamento primers PP PP PP P P P P P P P P Ciclo 2° Ciclo 3° (8 copie) (2 copie) Sequenza target P P P

45 Semplificata ed impiegata su vasta scala dallavvento di apparecchi che effettuano automaticamente i cicli di denaturazione/ copiatura a temperature variabili (DNA Thermal Cycler) Per scopi diagnostici, consente di individuare anche una singola copia di acido nucleico Nuove tecniche derivate: RT-PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, In situ PCR, Quantitative PCR Semplificata ed impiegata su vasta scala dallavvento di apparecchi che effettuano automaticamente i cicli di denaturazione/ copiatura a temperature variabili (DNA Thermal Cycler) Per scopi diagnostici, consente di individuare anche una singola copia di acido nucleico Nuove tecniche derivate: RT-PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, In situ PCR, Quantitative PCR Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)

46 Applicazioni MICROBIOLOGIA Luso della PCR ha rivoluzionato la diagnosi e lo studio delle patologie ad etiologia infettiva: la PCR ha risolto molti problemi connessi alle tecniche diagnostiche tradizionali (microscopia ottica, colture cellulari…) e lindividuazione di DNA o RNA appartenente allagente biologico permette una diagnosi sicura e veloce. Lesame di materiale di archivio ha permesso di stabilire il ruolo di alcuni agenti infettivi in molte neoplasie (HPV e ca della cervice uterina, Epstein-Barr virus e neoplasie post-trapianto, Human Herpesvirus 8 e sarcoma di Kaposi ) Applicazioni MICROBIOLOGIA Luso della PCR ha rivoluzionato la diagnosi e lo studio delle patologie ad etiologia infettiva: la PCR ha risolto molti problemi connessi alle tecniche diagnostiche tradizionali (microscopia ottica, colture cellulari…) e lindividuazione di DNA o RNA appartenente allagente biologico permette una diagnosi sicura e veloce. Lesame di materiale di archivio ha permesso di stabilire il ruolo di alcuni agenti infettivi in molte neoplasie (HPV e ca della cervice uterina, Epstein-Barr virus e neoplasie post-trapianto, Human Herpesvirus 8 e sarcoma di Kaposi ) Schneider A et al. Screening for high-grade cervical intra-epithelial neoplasia and cancer by testing for high-risk HPV, routine cytology or colposcopy. Int J Cancer 2000;89: Marchioli CC et al. Prevalence of human herpesvirus 8 DNA sequences in several patient populations. J Clin Microbiol 1996;34: Mathis A et al. Simplified sample processing combined with a sensitive one-tube nested PCR assay for detection of Pneumocystis carinii in respiratory specimens. J Clin Microbiol 1997;35: Honda J et al. Clinical use of capillary PCR to diagnose Mycoplasma pneumonia. J Clin Microbiol 2000;38: Schneider A et al. Screening for high-grade cervical intra-epithelial neoplasia and cancer by testing for high-risk HPV, routine cytology or colposcopy. Int J Cancer 2000;89: Marchioli CC et al. Prevalence of human herpesvirus 8 DNA sequences in several patient populations. J Clin Microbiol 1996;34: Mathis A et al. Simplified sample processing combined with a sensitive one-tube nested PCR assay for detection of Pneumocystis carinii in respiratory specimens. J Clin Microbiol 1997;35: Honda J et al. Clinical use of capillary PCR to diagnose Mycoplasma pneumonia. J Clin Microbiol 2000;38:

47 Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) GENETICA La PCR è utile nellidentificazione di disordini cromosomiali e patologie ereditarie, come la fibrosi cistica, la malattia di Gaucher, il deficit della alfa-1- antitripsina, lemofilia, la trisomia 21, la sindrome di Turner, la NBCCS. Thomas MR et al. The time of appearance and disappearance of fetal DNA from the maternal circulation. Prenat Diagn 1995;15: Lo YM et al. Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood. Lancet 1989;2: Tutschek B et al. Isolation of fetal cells from transcervical samples by micromanipulation: molecular confirmation of their fetal origin and diagnosis of fetal aneuploidy. Prenat Diagn 1995;15: Thomas MR et al. The time of appearance and disappearance of fetal DNA from the maternal circulation. Prenat Diagn 1995;15: Lo YM et al. Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood. Lancet 1989;2: Tutschek B et al. Isolation of fetal cells from transcervical samples by micromanipulation: molecular confirmation of their fetal origin and diagnosis of fetal aneuploidy. Prenat Diagn 1995;15:951-60

48 Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) ONCOLOGIA La PCR ha rivoluzionato lo studio dei tumori: permette la detenzione di mutazioni in oncogeni associati al tumore (K-ras, N-ras….), geni soppressori del tumore (p53, p16), traslocazione cromosomiale (cromosoma Filadelfia, t(14;18) in LMC. ONCOLOGIA La PCR ha rivoluzionato lo studio dei tumori: permette la detenzione di mutazioni in oncogeni associati al tumore (K-ras, N-ras….), geni soppressori del tumore (p53, p16), traslocazione cromosomiale (cromosoma Filadelfia, t(14;18) in LMC. Sarkar FH et al. A universal method for the mutational analysis of K-ras and p53 gene in non–small-cell lung cancer using formalin-fixed paraffin embedded tissues. Diagn Mol Pathol 1995;4: Stenmark-Askmalm M et al. Cellular accumulation of p53 protein: an independent prognostic factor in stage II breast cancer. Eur J Cancer 1994;30A: Shahnavaz SA et al. p53 gene mutations in sequential oral epithelial dysplasias and squamous cell carcinomas. J Pathol 2000; 190: Liu L et al. Mutation of the CDKN2A 5´ UTR creates an aberrant initiation codon and predisposes to melanoma. Nat Genet 1999;21: Baker SJ et al. Chromosome 17 deletions and p53 gene mutations in colorectal carcinomas. Science 1989;244: Sarkar FH et al. A universal method for the mutational analysis of K-ras and p53 gene in non–small-cell lung cancer using formalin-fixed paraffin embedded tissues. Diagn Mol Pathol 1995;4: Stenmark-Askmalm M et al. Cellular accumulation of p53 protein: an independent prognostic factor in stage II breast cancer. Eur J Cancer 1994;30A: Shahnavaz SA et al. p53 gene mutations in sequential oral epithelial dysplasias and squamous cell carcinomas. J Pathol 2000; 190: Liu L et al. Mutation of the CDKN2A 5´ UTR creates an aberrant initiation codon and predisposes to melanoma. Nat Genet 1999;21: Baker SJ et al. Chromosome 17 deletions and p53 gene mutations in colorectal carcinomas. Science 1989;244:

49 Tecniche per identificare materiale genetico TecnicaCampioneMetodicaVantaggiSvantaggi PCR10-25 ng of DNA o meno Gel e col. fluorescente Radioattiva Estremamente sensibile, specifica Flessibile ed adattabile Spesso troppo sensibile (falsi-positivi) Contaminazione RT-PCR<1 ng di RNA totale <1 × 104 cells Gel e col. fluorescente Radioattiva Estremamente sensibile, specifica Flessibile ed adattabile Spesso troppo sensibile (falsi-positivi) Contaminazione No informazioni su dimensioni mRNA Southern blot µg di DNARadioattiva Chemiluminescente Colorimetrica Notizie dimensioni DNA Quantificazione del numero copie di gene Tempo Trasferimento su membrana Ibridizzazione Molto DNA alta qualità Northern blot 5 µg di poly (A)+ mRNA mg di RNA totale Radioattiva Chemiluminescente Colorimetrica Notizie dimensioni RNA Quantificazione accurata espressione mRNA Tempo Trasferimento su membrana Ibridizzazione Molto RNA alta qualità

50 Target e metodo diagnostico TargetIdentificazioneQuantificazioneLocalizzazione MolecolaWB Southern Northern Immunoprecipitazione Agglutinazione Radioimmunoassay ELISA Colorazione tessuto e microscopia (ottica, fluorescenza, confocale, elettronica…) CellulaCitometria di flusso Microscopia Citometria di flusso Videoanalisi di immagine Colorazione tessuto e microscopia (ottica, fluorescenza, confocale, elettronica…)


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