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Moderne tecniche diagnostiche:

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Presentazione sul tema: "Moderne tecniche diagnostiche:"— Transcript della presentazione:

1 Moderne tecniche diagnostiche:
CORSO MULTIDISCIPLINARE DI PATOLOGIA ORALE: NEOPLASIE DEI TESSUTI MOLLI E DURI DEL CAVO ORALE Moderne tecniche diagnostiche: dall’ematossilina-eosina alla proteomica Prof. Lorenzo Lo Muzio Roma 2-4 dicembre 2004

2 ? Evoluzione della patologia 1621 1660 1800 1940 1980 1990 2000
Virchow: Basi cellulari delle malattie Debebele & Forsson: Primo microscopio PCR Genoma umano ? Malpighi: Microcircolo capillare Primo paper su immunoistochimica Microarray Lakhani S.R. and Ashworth A. NATURE REV CANCER 2001; 1:151-7

3 Microarray and histopathological analysis of tumours:
The future and the past? Lakhani S.R. and Ashworth A. NATURE REV CANCER 2001; 1:151-7

4 Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology
Part I: Molecular methods Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92:650-9 Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2002; 93:56-74

5 Histopathology meets molecular pathology.
Guest Editorial Histopathology meets molecular pathology. “Histopathology remains at the core of disease diagnosis…..” “……Don’t ask me to run a gel electrophoresis or extract DNA from a specimen and amplify it by polimerase chain reaction….” Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92:589-90

6 Histopathology meets molecular pathology.
Guest Editorial Histopathology meets molecular pathology. “Working together (surgical pathologists and molecular scientist), molecular tools can be applied to practical problems to better understand disease mechanisms and improve diagnostic skills, ultimately aiding in the development of rational therapeutic regimens…..” Regezi JA. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2001; 92:589-90

7 La biopsia diagnostica
quando e perché? Definizione etiologica Patogenesi Terapia mirata Prognosi

8 Identificazione di componenti in cito-istopatologia
Strutture identificabili Membrana e parete Antigeni parietali / capsulari / somatici / nucleici Acidi nucleici (DNA / RNA) Strutture citoplasmatiche Recettori

9 Possibili metodiche istologiche e su tessuti
microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare

10 Possibili metodiche istologiche e su tessuti
Esame morfologico (su preparati citologici o bioptici): alterazioni citopatiche nucleo-citoplasmatiche presenza strutture esogene Immunoistochimica/immunofluorescenza: antigeni di membrana/citoplasmatici/nucleari (anche in assenza di evidenti manifestazioni cliniche e/o di alterazioni citomorfologiche) Ibridazione molecolare: in situ estrattiva (priva di dettagli morfologici)

11 Possibili metodiche istologiche e su tessuti
microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare

12 microscopia ottica colorazioni speciali Van Gieson (collageno)
Colorazione tricromica (collageno, fibre muscolari) impregnazione argentica (reticolina – collag tipo III, membrana basale – collag IV) acido Periodico di Schiff (membrana basale – collageno tipo IV, carboidrati….) Ematossilina di Verhoeff (elastina) Resorcina (elastina) Fucsina (elastina) Orceina (elastina) Metodo di Feulgen (DNA nucleare) Rosso Congo (amiloide) Metodo argentico di Masson-Fontana (melanina…) Sudan (lipidi) Argento-Metenamina di Jones (membrana basale glomerulare)

13 colorazioni speciali per microrganismi Gram
microscopia ottica colorazioni speciali per microrganismi Gram Ziehl-Neelsen Giemsa metodo di Wade-Fite (lebbra) metodo argentico di Grocott (miceti e Pneumocystis) acido Periodico di Schiff (miceti, protozoi, elminti….) Giemsa (protozoi, elminti….) metodi di Dieterle o Warthin - Starry (spirochete e legionelle) orceina di Shikata (HBV) colorazione di Lugol Argento-Metenamina di Gomori

14 Immunoistochimica Prevede il legame di anticorpi primari specifici con l’antigene, l’anticorpo o con il complesso antigene-anticorpo da ricercare. La positività del test è evidenziato dall’impiego di un anticorpo secondario coniugato con un cromogeno Cromogeno Anticorpo secondario Complesso Anticorpo primario – secondario – cromogeno Anticorpo primario Cellula target

15 Standardizzazione della tecnica
fissazione in formalina tamponata neutra (soluzioni acide riducono l’antigenicità tissutale) fissazione immediata processazione del campione fissato entro ore sezioni di 4-5 micron smascheramento dell’antigene amplificazione dell’antigene

16 Smascheramento antigenico
La fissazione in paraffina provoca: legami proteine-proteine legami proteine-acidi nucleici legami con ioni calcio con mascheramento o danneggiamento degli epitopi a causa dell’alterazione tridimensionale delle proteine Smascheramento antigenico: digestione enzimatica (soluzione di proteasi, tripsina o pepsina), bollitura, forno a microonde….

17 Amplificazione antigenica
Coniugazione o attacco di un marker enzimatico ad un anticorpo secondario e formazione di un complesso terziario: Avidina-Biotina-Perossidasi (ABC) Perossidasi-anti-perossidasi (PAP) Fosfatasi Alcalina/anti-Fosfatasi Alcalina (APAAP) Envision (Polymer detection) Cromogeno Anticorpo secondario Complesso Anticorpo primario – secondario – cromogeno Anticorpo primario Cellula target

18 Vantaggi Svantaggi uso di sezioni tissutali routinarie
sistema sensibile (bassi livelli di antigene) sistema specifico (dipende da specificità dell’anticorpo) Svantaggi stesso antigene presente in diverse patologie/neoplasie reazione con diversi antigeni no utile per differenziare lesioni benigne e maligne uso di più anticorpi per identificare un tipo specifico di lesione/neoplasia soggettività della valutazione per molti antigeni necessità di controlli positivi e negativi molti anticorpi funzionano solo su sezioni congelate

19 Identificazione cellulare
Epiteliali Citocheratine (CK) Mesenchimali Vimentina Muscolari Desmina Actine Mioglobina miogenina Neuronali S-100 GFAP Neurofilamenti CD57 (NK o tumori neuronali) Endoteliali CD31 CD34 Fattore VIII Melanociti HMB45 MART-1 S100 Linfoidi Kappa e lambda CD3, 15, 20, 30, 45, 68, 79a ALK-1 TdT Salivari S100, actina

20 Antigeni associati ai tumori
Carcinoma Citocheratine (CK) Adenocarcinomi Rabdomiosarcoma Desmina, Actina, Mioglobina, miogenina, actina muscolo-specifica Leiomiosarcoma Actina muscolo liscio neurosarcoma Neurofilamenti, S100 Melanoma HMB45, MART-1 (melan-A), S100 Angiosarcoma e S. Kaposi CD31, 34, fattore VIII Tumore di Ewing e Neuroendocrini CD99 (MIC2 gene product) Cellule di Langerhans CD1a Tumori Salivari S100, actina, calponina Limfomi a cellule B a cellule T a grandi cell anaplastiche (Ki-1) CD45, CD45RB CD20, CD791, CD45RA CD3, CD43, CD45RO CD30 (Ber-H2 clone), ALK-1 Limfoma di di Hodgkin CD15, CD30 Infiltrati leucemici TdT, mieloperossidasi Mieloma Catene leggere kappa e lambda Carcinoma neuroendocrino e paraganglioma Neurofilamenti, cromogranina, sinaptofisina Tumore a cellule di Merkel Cromogranina, sinaptofisina Tumore fibroso solitario CD34, CD99, bcl-2 Antigeni associati ai tumori

21 Profilo immunoistochimico delle metastasi epiteliali
TUMORE PROFILO ANTIGENICO Polmone (adeno) CK7+ CK20- VILLINA+ Polmone (SCC) CK7- CK20- Colon CK7- CK20+ VILLINA+ Mammella CK7+ CK20- VILLINA- Rene CK7- CK20- VILLINA- Prostata CK7- CK20- PSA+ Jordan RCK, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA. Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology. Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol Oral Rad End 2002; 93:56-74

22 Possibili metodiche istologiche e su tessuti
microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare

23 L’immunofluorescenza
Fluorocromo Introdotta nel 1941 da Coons et al. è basata sul legame chimico tra il fluorocromo e l’anticorpo. La positività del test è riconducibile all’intensità della colorazione. Complesso Auto Ab Anti-Auto Ab Fluorocromo Anti-Auto Ab Auto Ab Cellula target Immunofluorescenza diretta Coons AH, Creech HJ, Jones RN Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med 1941; 47:200-2.

24 + + + Immunofluorescenza IF DIRETTA IF INDIRETTA
IgG anti-umane marcate con fluorescina (FITC) + Siero del paziente (con autoAb) Tessuto di controllo Biopsia del paziente (auto Ab in tessuto) + + IF DIRETTA IF INDIRETTA

25 Applicazioni dell’immunofluorescenza diretta
identificazione di anticorpi o altre proteine flogistiche in patologie autoimmunitarie (IgG, IgA, IgM, C3 e fibrinogeno) identificazione di antigeni esogeni (virus….) identificazione di antigeni o componenti della cellula

26 Memb bas – Lamina superf
Immunofluorescenza in lesioni orali Patologia IgG IgA IgM C3 Fibrinogeno Pemfigo Membr cell neg Pemfigoide benigno delle mucose Memb bas lin Lupus orale Memb bas granul Memb bas – Lamina superf Lichen orale Neg Memb bas fin granul Eritema multiforme Malattia lineare a IgA Memb bas Epidermolisi bollosa acquisita Memb bas wide Stomatite ulcerativa cronica Nucleare Infiammazione cronica aspecifica

27 Immunoistochimica Immunofluorescenza Vantaggi Buona conservazione del colore Strutture tissutali facilmente identificabili Maggiore sensibilità Tecnica semplice Migliore contrasto Facile identificazione di elementi anche molto piccoli Il risultato è visualizzabile subito dopo la reazione immunologica Svantaggi Tecnica complessa Contrasto mediocre Non identifica l’enzima marcato ma i prodotti della reazione La fluorescenza decade rapidamente Strutture tissutali difficilmente identificabili Necessità di microscopio a fluorescenza Sezioni immediatamente congelate o trattate Steroidi topici  falsi negativi (1 mese) IHC IF Vantaggi e svantaggi Ep Laminina 5: immunoistochimica ed immunofluorescenza

28 Possibili metodiche istologiche e su tessuti
microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia confocale microscopia elettronica ibridazione molecolare

29 Microscopia confocale laser
Introdotto negli anni 80 permette di ottenere: immagini prive di fluorescenze dovute a strutture non poste sul piano focale maggiori dettagli delle cellule ricostruzione 3D delle immagini. Testa dello scanner Digital Imaging System Sorgente laser Monitor Monitor Obiettivo White JG, AmosWBand FordhamM. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. Journal of Cell Biology 1987; 105: 41–48. Preparato

30 Possibili metodiche istologiche e su tessuti
microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia confocale microscopia elettronica ibridazione molecolare

31 Microscopia elettronica
Microscopia ottica Microscopia elettronica Osservazione diretta con colori originali Osservazione indiretta su schermo. Foto solo in bianco e nero Modesto ingrandimento, fino a 1500x, ma ampio campo e facile orientamento Notevole ingrandimento fino a 2,000,000x Potere di risoluzione fino a 0.25 µm. Potere di risoluzione fino a 1 nm (0.001µm.) Sezioni criostatate anche solo 20 minuti. Almeno 24 ore Possibili artefatti Buona fissazione e preparazione assicurano alta risoluzione, notevole ingrandimento e pochi artefatti Lo spessore delle sezioni (1-30 µm) permette una ridotta profondità di campo per poter avere 3D della struttura esaminata. Necessarie sezioni seriate. Sezioni supersottili, ma le informazioni 3-D possono essere ottenute: (a) sezioni più spesse con ME as alto voltaggio; (b) SEM (scanning electron microscopy) Le colorazioni sono usate selettivamente e la maggior parte dei materiali e delle strutture non può essere esaminata nello stesso momento La colorazione con metalli pesanti permette una migliore comprensione delle strutture cellulari: membrane, granuli, filamenti, cristalli…. Campioni grandi e vivi Campioni molto piccoli, difficili da gestire Costi ridotti Costi notevoli

32 Possibili metodiche istologiche e su tessuti
microscopia ottica ematossilina ed eosina colorazioni speciali immunocito-istochimica immunofluorescenza microscopia elettronica microscopia confocale ibridazione molecolare

33 Ibridazione molecolare
In situ: Isotopica Cromogenica (C.I.S.H.) Fluorescente (F.I.S.H.) Estrattiva: Dot blotting Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)

34 Ibridazione molecolare
In situ Fissazione L'ibridazione in situ rivela acidi nucleici in campioni cito-istologici morfologicamente preservati. La tecnica prevede la formazione di ibridi di acidi nucleici costituiti da DNA endogeno a catena unica (denaturata) o mRNA e da una sequenza complementare di acidi nucleici esogeni a singola catena marcata con radioisotopo, con tracciante fluorescente (FISH) o con cromogeni osservabili in microscopia ottica (CISH). Denaturazione Ibridizzazione Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. PNAS 1969;64:600-4. John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 1969;223:582-7.

35 Ibridazione molecolare - In situ
Applicazioni cliniche Identificazione di DNA o RNA estraneo (virus, funghi, batteri e parassiti coltivabili con difficoltà o non coltivabili in vitro - es.: HPV e Pneumocystis carinii) La metodica, inoltre, consente la definizione specifica di tipo e ceppo. Alterazioni del DNA cellulare (amplificazione genica, traslocazioni…) Mutazioni geniche Espressione corretta o alterata di RNA cellulare (prodotti genici)

36 Ibridazione molecolare
FISH La FISH (Fluorescence in situ hybridization) è usata per mappare i geni sui cromosomi e caratterizzare le anomalie cromosomiche: una sonda di DNA, marcata con biotina e specifica per un segmento cromosomico o un intero cromosoma (metafase) è ibridizzata ai cromosomi. Dopo il lavaggio si evidenzia la marcatura incubando con un anticorpo anti-biotina marcato con fluorocromo. Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. PNAS 1969;64:600-4. John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature 1969;223:582-7.

37 Ibridazione molecolare
FISH La FISH può essere usata per determinare: Delezioni cromosomiche Traslocazioni Riarrangiamenti Amplificazioni Glassman AB. Cytogenetics, in situ hybridization and molecular approaches in the diagnosis of cancer. Ann Clin Lab Sci 1998;28: Okami K et al. Cyclin D1 amplification is independent of p 16 inactivation in head and neck squamous cell carcinoma. Oncogene 1999;18:

38 Ibridazione molecolare
Estrattiva: Non amplificata Dot blotting Southern Blot (DNA) Northern Blot (RNA) Western Blot (Proteine) Amplificata Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

39 SOUTHERN BLOT per DNA (Dr. Edward Southern, 1975)
Taglio con enzimi di restrizione (frammentazione riproducibile del DNA) Separazione dei frammenti di restrizione tramite elettroforesi su gel Denaturazione del DNA e trasferimento (blotting) dal gel ad un substrato solido (filtro di nylon o nitrocellulosa) Incubazione del filtro con con una sonda molecolare specifica, marcata con radioisotopo Evidenziazione dei frammenti ibridizzati con la sonda tramite autoradiografia. 1 4 3 5 2 8 6 7 Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975;98:

40 NORTHERN BLOT per RNA Linearizzazione delle molecole di RNA in agente denaturante (formaldeide) Separazione del RNA tramite gel elettroforesi Trasferimento su filtro di nitrocellulosa Incubazione con una sonda marcata Autoradiografia. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. PNAS 1977;74:

41 WESTERN BLOT per proteine
Separazione di molecole proteiche in base al peso molecolare (estensione dell'elettroforesi su gel di poliacrilamide) Trasferimento dal gel a filtro di nitrocellulosa Incubazione con anticorpo specifico per la proteina in esame Visualizzazione del complesso antigene (proteina)/anticorpo legato alla proteina con sistema anti-immunoglobulina biotinilata e successiva rivelazione cromogena

42 Ibridazione molecolare
Estrattiva: Non amplificata Dot blotting Southern Blot (DNA) Northern Blot (RNA) Western Blot (Proteine) Amplificata Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

43 Polymerase Chain Reaction
(P.C.R.) Procedura elaborata da Kary Mullis (premio Nobel) nel 1985. Metodica di amplificazione sequenziale ed evidenziazione del DNA (qualora presente in esiguo numero di copie) che permette di ottenere una quantità di acido nucleico misurabile e caratterizzabile.

44 Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)
Sequenza target Polymerase Chain Reaction (P.C.R.) Sequenza target Aggiunta Primers Riscaldamento Denaturazione Ciclo Denaturazione delle doppie eliche di DNA Incubazione con due primers (oligonucleotidi, 20 basi) che corrispondano alle estremità del tratto di DNA che si vuole amplificare (primer di avvio e di stop) Aggiunta di nucleotidi e DNA-polimerasi termostabile. Sequenza di cicli di riscaldamento (denaturazione, copiatura ed estensione della sequenza) e raffreddamento (accoppiamento della catena neo-sintetizzata con quella originaria/stampo) Ripetizione per un numero di cicli sufficienti ad ottenere un numero di copie identificabili Raffreddamento (2 copie) Riassociazione Primers P P DNA polimerasi, Nucleotidi P Allungamento primers P P Riscaldamento Ciclo Raffreddamento (4 copie) P P P P Riscaldamento Raffreddamento P P Ciclo P P (8 copie) P P P P

45 Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)
Semplificata ed impiegata su vasta scala dall’avvento di apparecchi che effettuano automaticamente i cicli di denaturazione/ copiatura a temperature variabili (DNA Thermal Cycler) Per scopi diagnostici, consente di individuare anche una singola copia di acido nucleico Nuove tecniche derivate: RT-PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, In situ PCR, Quantitative PCR

46 Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)
Applicazioni MICROBIOLOGIA L’uso della PCR ha rivoluzionato la diagnosi e lo studio delle patologie ad etiologia infettiva: la PCR ha risolto molti problemi connessi alle tecniche diagnostiche tradizionali (microscopia ottica, colture cellulari…) e l’individuazione di DNA o RNA appartenente all’agente biologico permette una diagnosi sicura e veloce. L’esame di materiale di archivio ha permesso di stabilire il ruolo di alcuni agenti infettivi in molte neoplasie (HPV e ca della cervice uterina, Epstein-Barr virus e neoplasie post-trapianto, Human Herpesvirus 8 e sarcoma di Kaposi) Schneider A et al. Screening for high-grade cervical intra-epithelial neoplasia and cancer by testing for high-risk HPV, routine cytology or colposcopy. Int J Cancer 2000;89: Marchioli CC et al. Prevalence of human herpesvirus 8 DNA sequences in several patient populations. J Clin Microbiol 1996;34: Mathis A et al. Simplified sample processing combined with a sensitive one-tube nested PCR assay for detection of Pneumocystis carinii in respiratory specimens. J Clin Microbiol 1997;35: Honda J et al. Clinical use of capillary PCR to diagnose Mycoplasma pneumonia. J Clin Microbiol 2000;38:

47 Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)
GENETICA La PCR è utile nell’identificazione di disordini cromosomiali e patologie ereditarie, come la fibrosi cistica, la malattia di Gaucher, il deficit della alfa-1-antitripsina, l’emofilia, la trisomia 21, la sindrome di Turner, la NBCCS. Thomas MR et al. The time of appearance and disappearance of fetal DNA from the maternal circulation. Prenat Diagn 1995;15:641-6. Lo YM et al. Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood. Lancet 1989;2: Tutschek B et al. Isolation of fetal cells from transcervical samples by micromanipulation: molecular confirmation of their fetal origin and diagnosis of fetal aneuploidy. Prenat Diagn 1995;15:951-60

48 Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)
ONCOLOGIA La PCR ha rivoluzionato lo studio dei tumori: permette la detenzione di mutazioni in oncogeni associati al tumore (K-ras, N-ras….), geni soppressori del tumore (p53, p16), traslocazione cromosomiale (cromosoma Filadelfia, t(14;18) in LMC. Sarkar FH et al. A universal method for the mutational analysis of K-ras and p53 gene in non–small-cell lung cancer using formalin-fixed paraffin embedded tissues. Diagn Mol Pathol 1995;4: Stenmark-Askmalm M et al. Cellular accumulation of p53 protein: an independent prognostic factor in stage II breast cancer. Eur J Cancer 1994;30A: Shahnavaz SA et al. p53 gene mutations in sequential oral epithelial dysplasias and squamous cell carcinomas. J Pathol 2000; 190: Liu L et al. Mutation of the CDKN2A 5´ UTR creates an aberrant initiation codon and predisposes to melanoma. Nat Genet 1999;21: Baker SJ et al. Chromosome 17 deletions and p53 gene mutations in colorectal carcinomas. Science 1989;244:

49 Tecniche per identificare materiale genetico
Tecnica Campione Metodica Vantaggi Svantaggi PCR 10-25 ng of DNA o meno Gel e col. fluorescente Radioattiva Estremamente sensibile, specifica Flessibile ed adattabile Spesso troppo sensibile (falsi-positivi) Contaminazione RT-PCR <1 ng di RNA totale <1 × 104 cells No informazioni su dimensioni mRNA Southern blot 10-20 µg di DNA Chemiluminescente Colorimetrica Notizie dimensioni DNA Quantificazione del numero copie di gene Tempo Trasferimento su membrana Ibridizzazione Molto DNA alta qualità Northern blot 5 µg di poly (A)+ mRNA 10-20 mg di RNA totale Notizie dimensioni RNA Quantificazione accurata espressione mRNA Molto RNA alta qualità

50 Target e metodo diagnostico
Identificazione Quantificazione Localizzazione Molecola WB Southern Northern Immunoprecipitazione Agglutinazione Radioimmunoassay ELISA Colorazione tessuto e microscopia (ottica, fluorescenza, confocale, elettronica…) Cellula Citometria di flusso Microscopia Videoanalisi di immagine


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