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Sistema NF-kB e sua modulazione a fini terapeutici nelle neoplasie solide ed ematologiche Anna Marina Liberati Lorenzo Falchi Giorgia Desantis Annamaria.

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Presentazione sul tema: "Sistema NF-kB e sua modulazione a fini terapeutici nelle neoplasie solide ed ematologiche Anna Marina Liberati Lorenzo Falchi Giorgia Desantis Annamaria."— Transcript della presentazione:

1 Sistema NF-kB e sua modulazione a fini terapeutici nelle neoplasie solide ed ematologiche Anna Marina Liberati Lorenzo Falchi Giorgia Desantis Annamaria Rauco Paola Cerroni Federica Di Costanzo

2 Modulazione del sistema NF-kB nella strategia terapeutica delle neoplasie Perché ?

3 Modulazione del sistema NF-kB nella strategia terapeutica delle neoplasie Attivazione NF-kB Alterazioni genetiche dei vari componenti del sistema Meccanismi diversi in assenza di mutazioni dirette nei geni di questa via Neoplasie ematologiche Neoplasie solide

4 NIK: NF-kB inducing kinase MEKK1: mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase kinase1 IRAK:interleukin-1 receptor associated kinase TRAF:tumour necrosis factor alpha receptor associated factors PKC:protein kinase C Ambiente extra e cellulare NF-KB compartimenti intracellulari

5 Sistema NF-kB È un sistema complesso Cerchiamo di renderlo semplice

6 Sistema NF-kB A. A.Parte centrale funzionalmente attiva (vari dimeri) se raggiunge il nucleo –DNA B. B.Molecole inibitorie- regolatorie-IkB bloccano il passaggio nel nucleo A+B sono legate in un unico complesso Dimeri interattivi con DNA IkB Fosforilazione IkB

7 Stimoli esterni: Funzionalmente complesso ed attivato da sistemi complessi ed attivato da sistemi complessi Ma cerchiamo di rendere il tutto più semplice Attivazione di varie vie di trasduzione del segnale che attivano IKK NF-kB Sistema NF-kB IKK Molecole ad attività chinasica –IKK Fosforilazione di IkB Fosforilazione di IkB rende possibile il legame con ubiquitina Degradazione di IkB Degradazione di IkB B si stacca da A A migra nel nucleo a svolgere il suo lavoro, A migra nel nucleo a svolgere il suo lavoro,

8 Sistema NF-kB È un sistema complesso Cerchiamo di renderlo semplice

9 Ogni parte del sistema è formato da proteine con funzioni diverse +/- Esame del sistema Sistema NF-kB Dimeri interattivi con DNA

10 Sistema NF-kB + = c Rel; Rel A/p65; Rel B / - = p 50 (NFkB 1 ) e p52 (NFkB 2 ) A. A.Parte centrale dimeri P50/P65 (NF-kB) P50(NF-kB 1 ) P50/c-rel P52 (NF-kB 2 ) P65/P65 P65/c rel trascrizione

11 Sistema NF-kB Funzione + Bcl-3 nucleo Funzione - IkB, IkB, IkB, IkB Citoplasma Dimeri interattivi con DNA B. Complesso centrale : molecole regolatorie IKB IkB Bcl-3

12 Sistema NF-kB C. Molecole ad attività chinasica IKK Funzione + catalitica IKK e IKK Funzione – regolatrice IKK (NEMO) Funzione + di reclutamento (delle chinasi che fosforilano il sist. IKK,, ) IKK

13 CITOPLASMA p65 p50 NUCLEO p65 p50 IKK IkB p65 p50 IkB p65 p50 UB PROTEOSOMA IkB UB Citochine, ROS, Tat, Tax, LPS… IkB UB SCF- β-TrCP Β-catenina, cicline, Vpu TAK, PKC, PKR, Cot… Akt, NIK, MAPKKK antigeni, p53 cicline molecole di adesione Bcl-xL, c-IAP citochine Cox-2, iNOS ciclina D1… P NF-kB IkB p65 p50 MEMBRANA PLASMATICA

14 ATP E1 Ubiquitina E2 + E3 + Target

15 molecole di adesione Bcl-xL, c-IAP citochine Cox-2, iNOS ciclina D1… p65 p50 NUCLEO p65 p50 antigeni, p53 cicline NF-kB IkB p65 p50 UB MEMBRANA PLASMATICA Citochine, ROS, Tat, Tax, LPS… CITOPLASMA IKK IkB p65 p50 IkB p65 p50 PROTEOSOMA IkB UB IkB UB SCF- β-TrCP Β-catenina, cicline, Vpu TAK, PKC, PKR, Cot… Akt, NIK, MAPKKK P

16 Ruolo di NF-kB nella vita cellulare SOPRAVVIVENZA CELLULARE E FACILITATA Trascrizione di geni Enzimi di risposta allo stress Molecole di adesione Citochine pro- infiammatorie Proteine anti-apoptotiche Bcl-2, cIaP1, cIaP2 Molecole direttamente coinvolte nel ciclo cellulare

17 NF-kB-APOPTOSI Proteineanti-apoptotiche Bcl-2, cIaP1, cIaP2

18 Cit. C AIF CASPASI-9 CASPASI-8 CASPASI-3,7 Bcl-x, Bcl-2 Fas, FasL MITOCONDRIO p53 cIAPs, XIAP Diabo/Smac Bax, Noxa, pig3 APOPTOSI NF-kB VIA INTRINSECA VIA ESTRINSECA Apaf1 VIA ESTRINSECA E INTRINSECA DELLAPOPTOSI INIBITE DA NF-KB

19 NF-kB-CICLO CELLULARE Molecole direttamente coinvolte nel ciclo cellulare

20 p53 p21 waf1 NF-kB GADD45 CICLINA B CDC2 CICLINA D CDK4/6 G1 G2S xx M G1 NF-kB e regolazione del ciclo cellulare Chk1 e 2 CDC25 CDC25 P

21 Ruolo di NF-kB nella regolazione del ciclo cellulare Prove indirette: Il ruolo critico di NF-kB nel controllo del ciclo cellulare è dimostrato indirettamente attività NF-kB nella transizione G0-G1 livelli di NF-kB attivato correlano con i segnali che controllano il ciclo cellulare inibizione di NF-kB attivato determina un ritardo nella transizione G1-S

22 Ruolo di NF-kB nella regolazione del ciclo cellulare Prove dirette : siti di legame di NF-kB nella regione promoter del gene che codifica per la ciclina D1 ciclina D1 e ciclinochinasi (CDK4 e CDK6) G1 S attraverso la fosforilazione CDK-dipendente di pRb liberazione di E2F attivazione geni S-fase specifici

23 Linfomi NK-kB 1. 1.Varie componenti (una o più) del sistema sono danneggiate 2. 2.Come conseguenza di 1 si può realizzare o non attivazione costitutiva nucleare di NF-kB 3. 3.Attivazione di NF-kB si può realizzare anche attraverso altre vie

24 Ruolo di c-rel nelloncogenesi 1. 1.Modelli animali oncogenicità acuta del derivativo virale (oncoproteina v-Rel) 2. Amplificazione del gene umano c-rel 23% DLCL 75-85% presentazioni extranodali DLCL forma primitiva del mediastino alcune forme di L.follicolari (LF) 3. Riarrangiamento del gene umano c-rel alcuni (pochi) casi di LF ed alcuni DLCL

25 Ruolo di c-rel nelloncogenesi proteina ibrida c-rel Nrg DLCL (dominio N terminale RH di c-rel + sequenze di geni non correlati) transattivazione del dominio C-terminale induzione linfomi in modelli animali associazione con forme clinicamente avanzate di DLCL vantaggio selettivo di crescita

26 Amplificazione di Rel-A in sporadici casi di DLCL Alterazioni cromosomiche coinvolgenti Rel-A (11q-13) relativamente infrequenti Ruolo di Rel-A nelloncogenesi Sporadiche traslocazioni cromosomiche coinvolgenti il gene Rel-A in LNH e MM

27 Ruolo di NF-kB1 nelloncogenesi Rare alterazioni (strutturali e di espressione) del gene NF-kB1 (4q24) sono presenti nelle leucemie e nei linfomi

28 Traslocazioni e delezioni di nf-kb2(10p24) sono frequenti in diversi tipi di linfomi B e T cellulari Traslocazioni o delezioni di nf-kb2Traslocazioni o delezioni di nf-kb2 produzione di una p100 troncata con parziale delezione del dominio C-terminale Fusione in alcuni casi con sequenze eterologhe Fusione in alcuni casi con sequenze eterologhe Ruolo di NF-kB2 nelloncogenesi

29 La conseguenza funzionale della traslocazione o delezione è localizzazione nucleare constitutiva della p100 troncata e suo legame ai KB-DNA motifssenza formazione della p52 matura

30 Ruolo di NF-kB1 nelloncogenesi Rare alterazioni (strutturali e di espressione) del gene NF-kB1 (4q24) sono presenti nelle leucemie e nei linfomi

31 Traslocazioni e delezioni di nf-kb2(10p24) sono frequenti in diversi tipi di linfomi B e T cellulari Traslocazioni o delezioni di nf-kb2Traslocazioni o delezioni di nf-kb2 produzione di una p100 troncata con parziale delezione del dominio C-terminale Fusione in alcuni casi con sequenze eterologhe Fusione in alcuni casi con sequenze eterologhe Ruolo di NF-kB2 nelloncogenesi

32 La conseguenza funzionale della traslocazione o delezione è localizzazione nucleare constitutiva della p100 troncata e suo legame ai KB-DNA motifssenza formazione della p52 matura

33 Ruolo di NF-kB2 nelloncogenesi Modello proposto: p100 tumorali alterazione della trascrizione NF-kB mediata p100 troncata attiva da solala trascrizione genica p100 troncata agisce come transattivatore costitutivo

34 Ruolo di Bcl-3 nelloncogenesi Proteina Bcl-3 strutturalmente correlata alla famiglia dei regolatori IkB di Rel/NF-KB Bcl-3 è presente nel nucleo ove interagisce con omodimeri di p50 e p52 alterandone la loro attività DNA legante e modulando lespressione genica Bcl-3 è presente nel nucleo ove interagisce con omodimeri di p50 e p52 alterandone la loro attività DNA legante e modulando lespressione genica Bcl-3 favorisce la trascrizione NF-kB mediata rimuovendo dal DNA omodimeri p50 inattivi Bcl-3 favorisce la trascrizione NF-kB mediata rimuovendo dal DNA omodimeri p50 inattivi Bcl-3 agisce come co-attivatore per omodimeri p52 Bcl-3 agisce come co-attivatore per omodimeri p52

35 Ruolo di Bcl-3 nelloncogenesi Il gene bcl-3(19q 13.1) è coinvolto in una rara, ma ricorrente traslocazione t(14;19) (q32.3;q13.2) riscontrata nella LLC-B Le traslocazioni che coinvolgono bcl-3 determinano una iper-espressione della normale proteina Bcl-3 Iper-espressione di Bcl-3 step critico nel modello multisteps che determina la trasformazione cellulare

36 Ruolo della inattivazione di IkB nelloncogenesi IkB inibitore di NF-kB Iper-espressione antisenso di trascritti Ikb trasformazione di cellule murine NIH Iper-espressione antisenso di trascritti Ikb trasformazione di cellule murine NIH Ridotta attività di IkB correla persistente localizzazione nucleare di NF-kB e suo legame con il DNA ed attività transattivante Ridotta attività di IkB correla persistente localizzazione nucleare di NF-kB e suo legame con il DNA ed attività transattivante

37 Ruolo della inattivazione di IkB nelloncogenesi Linfoma di Hodgkin IkB = tumor-suppressor Gene ikb : localizzato sul cromosoma 14q13 Nel LH sono presenti mutazioni inattivanti in ikb e/o ikb Nel LH sono presenti mutazioni inattivanti in ikb e/o ikb con deregolazione funzionale del complesso NF-kB/IkB e conseguente attivazione di NF-KB. Nel LH esiste una correlazione inversa tra i livelli delle proteine IkB e IkB e lattivazione di chinasi IkB (IKK) Sebbene la regione cromosomica 14q13 non sia frequentemente coinvolta in riarrangiamenti o delezioni cromosomiche nel LH, non si può escludere che mutazioni non identificate siano presenti in molti casi di questa malattia.

38 Modulazione del sistema NF-kB nella strategia terapeutica delle neoplasie Attivazione NF-kB Alterazioni genetiche dei vari componenti del sistema Meccanismi diversi in assenza di mutazioni dirette nei geni di questa via Neoplasie ematologiche

39 Linfoma di Hodgkin: Lattivazione persistente di NF-kB è critica per Proliferazione Resistenza ad apoptosi Formazione di tumori c. RS in topi SCID Rilevanza patogenetica di NF-kB nel LH Attività costitutiva nucleare di NF-kB

40 1. 1.Attivazione NF-kB: diretta conseguenza di mutazioni dei geni IkB (IkB ) proteine IkB non funzionali per mancanza di varie porzioni del dominio centrale anKyrin e delle regioni C- terminali Linfoma di Hodgkin: Attività costitutiva nucleare di NF-kB

41 Linfoma di Hodgkin: Attività costitutiva nucleare di NF-kB 3. 3.Altri meccanismi anche correlati alla infezione da EBV 2. 2.Attivazione persistente della via di trasduzione del segnale Proteolisi di IkB Attivazione autocrina citochina-mediata da parte delle cellule di RS

42 network genico di tipo antiapoptotico : ciclina D2, CD40, CD86. NF-kB Mutazioni di IkBε Overespress. CD30 ed altri TNFR LMP1 Permanente attivaz. delle IKK (resistenza alle fosfatasi) Meccanismi che determinano la costitutiva attività di NF-kB Mutazioni di IkBα 1. 1.reclutamento background cellulare; 2. 2.localizzazione zona interfollicolare; 3. 3.deregolazione proliferazione. proteine coinvolte in:

43 Interazione tra CD 154 ectopica Interazione tra CD 154 ectopica e CD40 ancorato Linfoma mantellare: Attività costitutiva nucleare di NF-kB Attivazione NF-kB Cicline D1 per traslocazione t(11;14) Cicline D1 per traslocazione t(11;14) gene target di NF-kB

44 Del 10 t (1;14) attivazione NF-kB Citochine attivazione NF-kB Linfomi MALT e B-CLL: Attività costitutiva nucleare di NF-kB

45 Meccanismo TAX-dipendente Meccanismo TAX-dipendente Proteina TAX del HTLV-1 Attivazione IKK chinasi Attivazione NF-kB Meccanismo TAX-indipendente Meccanismo TAX-indipendente Degradazione di IkB Degradazione di IkB ATL: Attività costitutiva nucleare di NF-kB

46 Attivazione costitutiva di IKK chinasi Localizzazione nucleare NF-kB DLCL: Attività costitutiva nucleare di NF-kB

47 Modulazione dellattività di NF-kB Inibitori dellattività trascrizionale inclusi i glucocorticoidi Inibitori dellattività trascrizionale inclusi i glucocorticoidi Inibitori del proteosoma Inibitori del proteosoma Inibitori heat-shock protein 90 Inibitori heat-shock protein 90 Agenti che bloccano il complesso di attivazione IKKB: Agenti che bloccano il complesso di attivazione IKKB: Agenti che interferiscono con la formazione del complesso IKK: Agenti che interferiscono con la formazione del complesso IKK: Agenti che regolano lespressione delle proteine NF-KB ed il loro legame al DNA: Agenti che regolano lespressione delle proteine NF-KB ed il loro legame al DNA: molecole antisenso molecole antisenso composti NF-kB-decay composti NF-kB-decay nibitori RNA nibitori RNA NEMO binding-domain peptide Toll-IL-1 receptor adapter protein peptide

48 Omeostasi proteica è critica nei processi biologiciOmeostasi proteica è critica nei processi biologici fondamentali per la sopravvivenza cellulare fondamentali per la sopravvivenza cellulare Particolarmente rilevante è la modulazione dellomeostasi di quelle proteine critiche nella regolazione del ciclo cellulare Particolarmente rilevante è la modulazione dellomeostasi di quelle proteine critiche nella regolazione del ciclo cellulare La via ubiquitina-proteosoma (UPP) è il principale meccanismo di degradazione delle proteine,comprese quelle coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare.La via ubiquitina-proteosoma (UPP) è il principale meccanismo di degradazione delle proteine,comprese quelle coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare. Proteosoma è un bersaglio pertanto rilevante nella terapia biologica mirata delle neoplasie. Proteosoma è un bersaglio pertanto rilevante nella terapia biologica mirata delle neoplasie. Omeostasi proteica e proteosoma

49 DIVISIONE CELLULARE FATTORI PRO- E ANTI-APOPTOTICI PROGRESSIONE CICLO REGOLATORITRASCRIZIONALI ONCOSOPPRESSORI Topoisomerasi II svolgimento DNA Topoisomerasi I svolgimento DNA XIAP anti-apoptotico Bax pro-apoptotico Bcl2 anti-apoptotico Survivina anti-apoptotico Securina promozione anafase Ciclina E attivatore chinasi p27 KIP1 inibitore CDK p27 CIP1/WAF1 inibitore CDK Rec androgeni rec nucleari; fattore di trascrizione Fos/Jun fattori di trascrizione Id inibitore fattore di trascrizione ikB-α inibitore di NF-kB P53 fattore di trascrizione RB inibitore di E2F SUBSTRATIPROTEOSOMA

50 20S Proteasome26S Proteasome 19S A schematic of the 26S proteasome

51 Inibitori del proteosoma Inibitori del proteosoma Cinque classi diverse Cinque classi diverse Solo la classe peptide-boronato ha caratteristiche che la rendono clinicamente utile Utilità clinica Caratteristiche Stabilità metabolica, attività enzimatica, reversibilità del legame

52 Inibitori del proteosoma Inibitori del proteosoma Meccanismo dazione Acidi peptide boronico inibiscono le serine proteasi come la chemotripsina-imitando il substrato nel legame nel sito attivo.Acidi peptide boronico inibiscono le serine proteasi come la chemotripsina-imitando il substrato nel legame nel sito attivo. Queste molecole possono inibire il proteosoma legandosi al sito chemotripsina-simile della parte centrale 20SQueste molecole possono inibire il proteosoma legandosi al sito chemotripsina-simile della parte centrale 20S

53 Post-glutamyl Tryptic Bortezomib Cross-sectional view of the bortezomib binding site in the proteasome Chymo-tryptic

54 APOPTOSI STABILIZZAZIONE PROLIFERAZIONEMIGRAZIONE p21 p27 p53 Bid Bax Caveolina 1 APOPTOSI PROLIFERAZIONE ANGIOGENESI APOPTOSI JNK JNK NF-kB NF-kB PROTEOSOMA Inibitori del proteosoma Effetti biologici

55 Inibitori del proteosoma Effetti biologici Proteosoma degrada numerose proteine Proteosoma degrada numerose proteine Inibizione UPP determina una modulazione- alterazione di diversi momentidella vita cellulare Inibizione UPP determina una modulazione- alterazione di diversi momentidella vita cellulare Lattività del bortezomid si realizza nella modulazione dei meccanismi e vie molecolari multiple e diverseLattività del bortezomid si realizza nella modulazione dei meccanismi e vie molecolari multiple e diverse Leffetto finale del bortezomid, in differenti genotipi-fenotipi cellulari in differenti genotipi-fenotipi cellulari neoplastici è pertanto espressione neoplastici è pertanto espressione della sua azione preferenzialesu alcune della sua azione preferenzialesu alcune vie molecolari patogeneticamente critiche vie molecolari patogeneticamente critiche

56 Conclusioni Esiste il razionale patogenetico per luso degli inibitori del sistema NF-kB nelle malattie linfoproliferative Attuale iniziale provata efficacia clinica del Velcade nella terapia delle malattie linfoproliferative


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