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Citocromo P450 Prof. Giorgio Sartor Copyright © 2001-2007 by Giorgio Sartor. All rights reserved. Versione 3.5 – oct 2007.

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1 Citocromo P450 Prof. Giorgio Sartor Copyright © by Giorgio Sartor. All rights reserved. Versione 3.5 – oct 2007

2 gs © ver 3.5Citocromo P Enzima microsomiale, il più versatile tra gli enzimi di fase I. Inducibile. Anche conosciuto come ossidasi a funzioni miste (MFO). Proteina che contiene un gruppo eme –Il complesso formato dal Fe 2+ e CO ha uno spettro di assorbimento con massimo centrato a 450 nm ( ) nm. Citocromo P450 (CYP)

3 gs © ver 3.5Citocromo P CYP Ossida gli xenobiotici usando il NADPH come cofattore e O 2 La reazione procede come ciclo catalitico: RH+O 2 +H + +NADPH ROH+H 2 O+NADP + Non è attivo contro tutti i contaminanti (specialmente gli alogeni) In alcuni casi genera prodotti tossici (epossidi) Linduzione delle MFO è un sistema di biomarcatura

4 gs © ver 3.5Citocromo P Nature /09

5 gs © ver 3.5Citocromo P Assorbimento del gruppo eme Tipo I: ferro ad alto spin ( nm) Tipo II: ferro a basso spin, legame diretto al ferro ( nm), shiftato spesso a lunghezze donda maggiori (CO: 450 nm)

6 gs © ver 3.5Citocromo P Configurazione elettronica del Fe(II) Basso SpinAlto Spin Legame CO

7 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP (1PO5)

8 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP (1PO5)

9 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP (1PO5) AA basici

10 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP (1PO5) AA basici Cys436

11 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP (1PO5) AA basici Cys436 Cavità

12 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP (1PO5) Cavità

13 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP (1PO5) Cavità AA polari AA neutri

14 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP

15 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP

16 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP

17 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP

18 gs © ver 3.5Citocromo P Struttura del CYP

19 gs © ver 3.5Citocromo P Sito di legame

20 gs © ver 3.5Citocromo P Ciclo semplificato del CYP

21 gs © ver 3.5Citocromo P Meccanismo ciclico del CYP

22 gs © ver 3.5Citocromo P Meccanismo ciclico del CYP I.P450 acquo Fe 3+ (basso spin) Lega RH II.P450 canfora Fe 3+ (alto spin) entra 1e -, riduzione a Fe 2+ III.P450 canfora Fe 2+ Lega O 2 IV.P450 con O 2 legato, equivalente a Fe 3+ -O 2 - entra 1e -, riduzione a O 2 2- V.P450 perossido

23 gs © ver 3.5Citocromo P Meccanismo ciclico del CYP Entra 1H + VI.P450 idroperossido Entra 1H + esce H 2 O VII.P450 Fe 4+ O 2- catione radicale sulla proteina si forma ROH A.Lidroperossido VI si può formare per reazione di II con H 2 O 2

24 gs © ver 3.5Citocromo P Meccanismo ciclico del CYP

25 gs © ver 3.5Citocromo P Meccanismo ciclico del CYP

26 gs © ver 3.5Citocromo P Meccanismo Lossigeno è legato non ad angolo 180°. Il legame dellossigeno allontana il ligando (RH) solo dopo che I due atomi di ossigeno si sono ridotti il ligando si riavvicina. Ciò previene la formazione di ROS. Gli elettroni per la riduzione dellossigeno sono forniti da una proteina Fe-S (P450 batterica o mitocondriale) o da una NADPH-citocromo P450 ossidoreduttasi FAD/FMN dipendente (microsomi).

27 gs © ver 3.5Citocromo P Meccanismo generale del CYP NADPH + H + NADP + CYTP450 Reduttasi FMNH 2 /FADH 2 CYTP450 Reduttasi FMN/FAD CYP Fe 2+ CYP Fe 3+ RH ROH 2H + + O 2 H2OH2O

28 gs © ver 3.5Citocromo P Meccanismo Nel complesso con la NADPH- citocromo P450 ossidoredutta si lelettrone si muove attraverso lo scheletro della proteina

29 gs © ver 3.5Citocromo P Colesterolo monoossigenasi (CYTP450scc - EC CYP11A) NADPH + H + NADP + CYTP450 Reduttasi FMNH 2 CYTP450 Reduttasi FMN Colesterolo monoossigenasi Fe 2+ Colesterolo monoossigenasi Fe 3+ colesterolo 22-idrossi colesterolo 2H + + O 2 H2OH2O

30 gs © ver 3.5Citocromo P Reazioni catalizzate dal citocromo P450 Idrossilazione di aromatici Epossidazione di aromatici Idrossilazione di alifatici Epossidazione di alcheni N-dealchilazione O-dealchilazione S-sealchilazione N-ossidazione N-idrossilazione S-ossidazione Ossidazione di aldeidi Aromatizzazione di androgeni Ossidazione dellalotano Riduzione dellalotano Ossidazione dellarginina Taglio della catena laterale del colesterolo Deidrogenazione Dealogenazione Azoriduzione Deaminazione Desolforazione Idrolisi di ammidi Idrolisi di esteri Perossidazione Denitrazione Più almeno altre 20

31 gs © ver 3.5Citocromo P Idrossilazione di atomi di carbonio alifatici o aromatici –Da (S)-mefentoina a 4-idrossi-(S)- mefentoina (CYP2C19) –Da testosterone a 6-idrossitestosterone (CYP3A4) Reazioni catalizzate dal citocromo P450

32 gs © ver 3.5Citocromo P Idrossilazione di atomi di carbonio alifatici o aromatici –Da (S)-mefentoina a 4-idrossi-(S)- mefentoina (CYP2C19) –Da testosterone a 6-idrossitestosterone (CYP3A4) Reazioni catalizzate dal citocromo P450

33 gs © ver 3.5Citocromo P Idrossilazione di atomi di carbonio aromatici –Idrossilazione della linocaina Reazioni catalizzate dal citocromo P450

34 gs © ver 3.5Citocromo P Idrossilazione di atomi di carbonio alifatici –Idrossilazione del pentobarbitone Reazioni catalizzate dal citocromo P450

35 gs © ver 3.5Citocromo P Epossidazione –Formazione di benzo[]pirene-4,5,epossido Reazioni catalizzate dal citocromo P450

36 gs © ver 3.5Citocromo P Reazioni catalizzate dal citocromo P450 Epossidazione –Da 5-colestene a 5,6-epossi-5-colestano

37 gs © ver 3.5Citocromo P Dealchilazione –Meccanismo della dealchilazione Reazioni catalizzate dal citocromo P450

38 gs © ver 3.5Citocromo P Dealchilazione –N-demetilazione del diazepam Reazioni catalizzate dal citocromo P450

39 gs © ver 3.5Citocromo P Dealchilazione –O-demetilazione della codeina Reazioni catalizzate dal citocromo P450

40 gs © ver 3.5Citocromo P Dealchilazione –S-demetilazione della S-metiltiopurina Reazioni catalizzate dal citocromo P450

41 gs © ver 3.5Citocromo P Dealchilazione di eteroatomi –O-dealchilazione (da destrometorfano a destrorfano) –N-demetilazione della caffeina Reazioni catalizzate dal citocromo P450

42 gs © ver 3.5Citocromo P Deaminazione ossidativa –Meccanismo di deaminazione dellanfetamina Reazioni catalizzate dal citocromo P450

43 gs © ver 3.5Citocromo P Reazioni catalizzate dal citocromo P450 Trasferimento di gruppo per via ossidativa –N, S, X rimpiazzato con O Da parathion a paroxon (da S a O) Attivazione dellalotano a trifluoroacetilcloruro

44 gs © ver 3.5Citocromo P Reazioni catalizzate dal citocromo P450 Scissione di esteri –Scissione del gruppo funzionale con O nel gruppo uscente Da loratadina a lorantadina desacetilata (CYP3A4, 2D6) Deidrogenazione –Astrazione di due H con formazione di C=C Attivazione di acetaminofene al metabolita epatotossico N- acetilbenzochinoneimina

45 gs © ver 3.5Citocromo P Varietà Oltre 4000 isoforme di CYP sono state identificate nella biosfera. Il genoma umano contiene 60 distinti geni CYP che sono stati raggruppati in base alla similarità di sequenza in –18 famiglie geniche suddivise a loro volta in 42 sottofamiglie

46 gs © ver 3.5Citocromo P Varietà Le famiglie di CYP: 1-3: coinvolte nel metabolismo di xenobiotici –Delle 22 isoforme delle famiglie 1, 2 e 3 solo 6 isoforme sono interessate al metabolismo di fase I Le altre sono coinvolte nel metabolismo di composti endogeni: steroidi, eicosanoidi ecc. Spesso la stessa trasformazione è catalizzata da diverse isoforme, nel caso predomina quella con Km minore.

47 gs © ver 3.5Citocromo P La famiglia del Citocromo P450 Ha molti membri: –450 nel riso, 57 nelluomo, 84 nel topo, 10 nella Chlamodymonas Filogenesi

48 gs © ver 3.5Citocromo P Una classificazione degli isoenzimi ClasseCaratteristiche 1In mitocondri di cellule eucariote e batteriche. Associato con una proteina Fe-S e assistito da una reduttasi NADH dipendente che contiene FAD o FMN. 2Nel reticolo endoplasmatico (microsomi) di cellule eucariote. Implicato nel metabolismo di composti esogeni. Il partner redox di questa classe è una NADPH-citocromoP450 reduttasi. …

49 gs © ver 3.5Citocromo P Citocromo P450 classe 1

50 gs © ver 3.5Citocromo P Citocromo P450 classe 1

51 gs © ver 3.5Citocromo P Citocromo P450 classe 1

52 gs © ver 3.5Citocromo P Citocromo P450 classe 1

53 gs © ver 3.5Citocromo P Citocromo P450 classe 1

54 gs © ver 3.5Citocromo P Una classificazione degli isoenzimi ClasseCaratteristiche 1In mitocondri di cellule eucariote e batteriche. Associato con una proteina Fe-S e assistito da una reduttasi NADH dipendente che contiene FAD o FMN. 2Nel reticolo endoplasmatico (microsomi) di cellule eucariote. Implicato nel metabolismo di composti esogeni. Il partner redox di questa classe è una NADPH-citocromo P450 reduttasi. …

55 gs © ver 3.5Citocromo P Citocromo P450 classe 2

56 gs © ver 3.5Citocromo P Citocromo P450 classe 2

57 gs © ver 3.5Citocromo P Citocromo P450 classe 2 e dominio legante FMN della NADPH reduttasi

58 gs © ver 3.5Citocromo P Citocromo P450 Reduttasi (EC: ) FMN 1B1C

59 gs © ver 3.5Citocromo P Citocromo P450 Reduttasi (EC: )

60 gs © ver 3.5Citocromo P NADPH-Citocromo P450 Reduttasi (EC: ) NADPH FMN FAD 1AM0

61 gs © ver 3.5Citocromo P Gli isoenzimi A.Degradano xenobiotici: CYP1, CYP2A..2E, CYP3 B.Coinvolti nel metabolismo degli steroidi: CYP2G1, CYP7, CYP8B1, CYP11, CYP17, CYP19, CYP21, CYP27A1, CYP46, CYP51 C.Metabolismo degli acidi grassi (specialmente arachidonato e suoi metaboliti): CYP2J2, CYP4, CYP5, CYP8A1 D.Altri substrati: CYP2R1 (?), CYP2S1 (?), CYP24 (Vitamina D), CYP26 (acido retinoico), CYP27B1 (Vitamina D), CYP39 (?)

62 gs © ver 3.5Citocromo P Famiglie nelluomo 18 famiglie geniche suddivise a loro volta in –CYP1, CYP2, CYP3, CYP4, CYP5, CYP7, CYP8, CYP11, CYP17, CYP19, CYP21, CYP24, CYP26, CYP27, CYP39, CYP46 e CYP51 –42 sottofamiglie Table.htmhttp://www.ebi.ac.uk/interpro/potm/2006_10/ Table.htm Strutture

63 gs © ver 3.5Citocromo P Alcuni componenti nelluomo Denominazione Espresso in SubstratiInduttoriInibitori Polimorfismo genetico CYP1A1/2 Fegato Polmoni Pelle Placenta Caffeina Teofillina Fumo di sigarette Carne alle braci Furafilline -naftoflavone (reversibile) CYP2B6Fegato Diazepam Fenantrene ?Orfenandrina CYP2C19 Fenitoina Piroxicam Tolbutamide Warfarin RifampinSulfafenazoleSi

64 gs © ver 3.5Citocromo P Alcuni componenti nelluomo Denominazione Espresso in SubstratiInduttoriInibitori Polimorfismo genetico CYP2D6 Propafenone Desipramine Propanololo Codeine Destrometorf ano Nessuno conosciuto Fluoxetine Quinidine Si CYP2E1 Fegato Polmoni Rene Linfociti Etanolo Caffeine Teofilline Benzene Etanolo Isoniazide Disulfiram

65 gs © ver 3.5Citocromo P Alcuni componenti nelluomo DenominazioneSubstratiInduttoriInibitori CYP3A4 Acetaminofene, Carbamazepina Ciclosporina, Dapsone, Digitossina, Diltiazem, Diazepam, Eritromicina, Etoposide, Lidocaina, Loratadina, Midazolam, Lovasatina, Nifedipina, Rapamicina, Taxolo, Verapamil Rifampin Carbamazepine Fenobarbitale Fenitoina Fluoxetina Quinidina CYP4A9/11 Acidi grassi e derivati

66 gs © ver 3.5Citocromo P Nomenclatura CYP ed EC

67 gs © ver 3.5Citocromo P Nomenclatura CYP ed EC

68 gs © ver 3.5Citocromo P Nomenclatura CYP ed EC

69 gs © ver 3.5Citocromo P Nomenclatura CYP ed EC

70 gs © ver 3.5Citocromo P Induzione Meccanismo attraverso il quale uno stimolo esterno alla cellula provoca come risposta la produzione di una o più proteine o, comunque, una attivazione della sintesi proteica: –HSP –Stress –CYP

71 gs © ver 3.5Citocromo P Un gene PROMOTORE esone 1esone 2 esone 3 introne 1 introne 2 GENE (senso) filamento U (RNA) C T pirimidine ||| || G A purine

72 gs © ver 3.5Citocromo P Il DNA fa RNA che fa PROTEINA PROMOTOREGENE 53RNApol + (senso) filamento esone 1esone 2 esone 3 introne 1 introne 2 5 3

73 gs © ver 3.5Citocromo P Trascrizione 53 + filamento RNApol 5 Pre-mRNA3 Il filamento complementare dà una COPIA del GENE. esone 1esone 2 esone 3 introne 1 introne 2 53

74 gs © ver 3.5Citocromo P Splicing 5 3RNApol 5 Pre-mRNA 3 5 splicing 3 mRNA

75 gs © ver 3.5Citocromo P Traduzione 5 3 mRNA 5 3 TRADUZIONE M S G proteina NH 2 RNA Ribosomiale t RNA

76 gs © ver 3.5Citocromo P MAPK

77 gs © ver 3.5Citocromo P Il paradigma Xenobiotico Attivazione del gene per CYP Espressione di CYP… Metabolismo dello xenobiotico

78 gs © ver 3.5Citocromo P CYP1A1 e recettori per idrocarburi aromatici CYP1A1 non è espressa costitutivamente nel fegato di ratto. CYP1A1 è indotta da idrocarburi policiclici –Benzo(α)pirene, TCDD (diossine). –Farmaci (omeprazolo, inibitore delle pompe protoniche). Meccanismo – up-regulation trascrizionale.

79 gs © ver 3.5Citocromo P Induzione CYP1

80 gs © ver 3.5Citocromo P Induzione CYP2-4 (e 7) A/B C D E F Sito di legame del DNA (Zn 2+ fingers) Regione cardine Sito di legame del ligando Regolata da recettori nucleari I recettori nucleari sono una superfamiglia di proteine

81 gs © ver 3.5Citocromo P Dominio zinc-fingers

82 gs © ver 3.5Citocromo P Dominio zinc-fingers

83 gs © ver 3.5Citocromo P Dominio zinc-fingers

84 gs © ver 3.5Citocromo P Recettori nucleari NR1 Ligando NR2 NR Ligando GENI Elemento di risposta DNA espressione +/ - I recettori nucleari sono fattori di trascrizioni attivati dai ligandi

85 gs © ver 3.5Citocromo P Recettori nucleari Recettori per gli steroidi –GR: recettore per i glucocorticoidi –MR: recettore per i mineralocorticoidi –AR: recettore per glia androgeni –ER: recettore per gli estrogeni Recettori per altri ligandi –RXR: recettore per X retinoide –RAR: recettore per acido retinoico –TR: recettore per lormone tiroideo –VDR: recettore per la vitamina D ? PXR: recettore per X pregnano CAR: recettore constitutivo attivato

86 gs © ver 3.5Citocromo P Recettori nucleari I recettori nucleari si legano ad uno specifico elemento di risposta Generalmente 2 mezzi siti di legame correlati con AGGTCA Sono i recettori per gli ormoni steroidei (GR, MR ecc...) Si lega come omodimero Sequenza palindromica imperfetta Separati da 3bp AGGACANNNTGTACC TCCTGTNNNACATGG

87 gs © ver 3.5Citocromo P CYP2B e CAR Ratti – CYP2B1 e CYP2B2 Umani CYP2B6 Lespressione di CYP2B1 non è misurabile in ratti non trattati CYP2B1/2 è indotta da farmaci (fenobarbital) o da altre molecole (TCPOBOP) Meccanismo – up-regulation trascrizionale. fenobarbital TCPOBOP

88 gs © ver 3.5Citocromo P Xantina ossidasi Xantina ossidasi (EC ) –Catalizza la formazione di Xantina e acido urico nel metabolismo delle purine. –Coinvolto anche in altri sistemi ossidativi –Metallo proteina (Fe Mo) contiene un centro ferro zolfo 2Fe-2S –Produce H 2 O 2 –In alcuni casi può produrre anione superossido RH + H 2 O + 2 O 2 = ROH + 2 O 2 · -

89 gs © ver 3.5Citocromo P Referenze sul WEB Vie metaboliche –KEGG: Degradazione degli xenobiotici: Struttura delle proteine: –Protein data bank (Brookhaven): –Hexpasy Expert Protein Analysis System: Prosite (protein families and domains): Enzyme (Enzyme nomenclature database): –Scop (famiglie strutturali): Enzimi: –Nomenclatura - IUBMB: –Proprietà - Brenda: –Expasy (Enzyme nomenclature database): Database di biocatalisi e biodegradazione: Citocromo P450: Metallotioneine: Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry

90 Crediti e autorizzazioni allutilizzo Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da: Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto lautore usando questa frase: Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor Università di Bologna a Ravenna Giorgio Sartor -


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