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FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ANALISI ENZIMATICA L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni: determinazione.

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2 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ANALISI ENZIMATICA L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni: determinazione dell’ attività catalitica di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze per mezzo di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze mediante reattivi marcati con enzimi

3 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Gli enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica, con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze Svolgono una funzione di catalizzatori (biologici), cioè accelerano le reazioni chimiche o fanno avvenire reazioni che altrimenti non avrebbero luogo Sono caratterizzati da: -altissima specificità -elevato potere catalitico ENZIMI E + S ES E + P

4 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ENZIMI Gli Enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze. Gli Enzimi sono catalizzatori biologici. Gli Enzimi non modificano l’equilibrio di una reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto. X G GG Y Reazione non catalizzata  G* Reazione catalizzata

5 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA REVERSIBILITA’ DELLE REAZIONI ENZIMATICHE L’enzima favorisce il raggiungimento dell’equilibrio, quindi catalizza anche la reazione inversa A B Ma, se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione diventa praticamente irreversibile A -----> B C Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene enzimatiche)

6 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Gli Enzimi differiscono dai catalizzatori chimici per: – Le velocità delle reazioni catalizzate da enzimi sono generalmente da 10 6 a più veloci di quelle non catalizzate. – Gli Enzimi catalizzano reazioni in condizioni relativamente blande, condizioni fisiologiche. – Gli Enzimi spesso hanno un’elevata specificità verso substrati e prodotti. – L’attività degli Enzimi può essere regolata da altri fattori oltre che da substrato e prodotti. ENZIMI

7 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Enzimi (“nel lievito”): un po’ di storia : prima teoria della catalisi chimica (Jöns Jacob Berzelius, chimico svedese) 1836: estrazione dal succo gastrico della pepsina 1860: fermentazione causata da sostanze termolabili (Louis Pasteur, microbilogo francese) 1877: primo uso del termine enzima 1897: estrazione dal lievito degli enzimi che catalizzano la fermentazione alcoolica; fermentazione in assenza in assenza di (Eduard Buchner, tedesco, premio Nobel per la chimica) - enzimologia 1894: Fischer propose il modello “lock and key” per descrivere la specifictà enzimatica 1926: cristallizzazione dell’ureasi (James Sumner, chimico americano) 1930: cristallizzazione di pepsina, tripsina e chimotripsina: tutti gli enzimi sono proteine (John Howard Northrop, americano, premio Nobel per la chimica) 1960: teoria dell’allosterismo (François Jacob, Jacques Monod, francesi, premio Nobel per la Medicina, Jan Pierre Changeaux, genetista francese)

8 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA CARATTERISTICHE DEGLI ENZIMI OTTIMIZZARE LA RESA: –Svolgere solo le reazioni necessarie –Impedire reazioni indesiderate (specificità di substrato) –Portare a termine le reazioni in tempi brevi –Indipendenza dall’ambiente (temperatura, pressione) –Riutilizzo della stessa “macchina” per molte volte MINIMIZZARE GLI SPRECHI: –Non produrre sottoprodotti (specificità di reazione) –Minimizzare il dispendio energetico

9 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA STRUTTURA DEGLI ENZIMI Alcuni enzimi sono delle oloproteine, costituiti solo da amminoacidi Altri enzimi sono eteroproteine: costituiti da una parte proteica (apoenzima) e parte non proteica (cofattori) APOENZIMA (Parte proteica) OLOENZIMA coenzima ione metallico gruppo prostetico (legato covalentemente)

10 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA COFATTORI: COENZIMI Nicotinamide Adenina Dinucleotide (NAD + ) Coenzima di deidrogenasi lattato + NAD +  piruvato + NADH + H + Esiste una forma fosforilata NADP +

11 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA COFATTORI: COENZIMI Adenosin trifosfato (ATP)  Coenzima delle chinasi  Esempio: Glucosio + ATP  Glucosio-6-fosfato + AD

12 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA VITAMINE: precursori di coenzimi COFATTORI

13 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Elementi alcalini (Na + K + ) Alcalino terrosi (Ca ++, Mg ++ ) Elementi bivalenti (Zn ++, Mn ++ ) COFATTORI COFATTORI METALLICI: GRUPPI PROSTETICI: FMN, FAD eme

14 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA COFATTORI Coenzima di deidrogenasi Derivato da riboflavina (vit. B 6 ) Trasferisce due protoni da/a substrati Esempio: Succinato + FAD  Fumarato + FADH 2 Flavina adenina dinucleotide (FAD)

15 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Una delle caratteristiche principali degli enzimi è la specificità verso il substrato SPECIFICITA’ DI SUBSTRATO Gli enzimi sono altamente specifici sia nel legare molecole chirali che nel catalizzare le loro reazioni.

16 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA NOMENCLATURA Ogni Enzima è identificato con un nome comune ed un nome sistematico Il nome sistematico consiste nel nome del substrato seguito dalla parola terminante in –asi che indica la reazione specifica Gli enzimi sono stati divisi in 6 classi in base alla chimica della reazione che catalizzano 1.ossidoreduttasi 2.transferasi 3.idrolasi 4.liasi 5.isomerasi 6.ligasi

17 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Dalla Commissione Internazionale per la nomenclatura e la classificazione degli enzimi è stato adottato un sistema di identificazione che fa uso di un codice a 4 cifre: – I cifra corrisponde alla classe dell’enzima – II cifra corrisponde alla sottoclasse – III cifra indica la sottoclasse di appartenenza dell’enzima – IV cifra specifica ulteriormente l’enzima in rapporto al tipo di substrato che viene trasformato dall’enzima Classificazione Internazionale Enzimi

18 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione –1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore –1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore –1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore –1.4 agisce sul gruppo CH-NH 2 del donatore –1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore –1.6 agisce su NADH o NADPH. –1.7 agisce su altri composti azotati –1.8 agisce su gruppi solforati –1.9 agisce sui gruppi eme Classificazione Internazionale Enzimi

19 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - trasferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra –2.1 gruppi ad una unità di carbonio –2.2 gruppi chetonici o aldeidici –2.3 gruppi acilici –2.4 gruppi glicosidici –2.5 gruppi alchilici –2.6 gruppi azotati –2.7 gruppi fosforici –2.8 gruppi contenenti zolfo Classificazione Internazionale Enzimi

20 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA 1 - ossidoreduttasi: 2 - trasferasi 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi –3.1 legami esterei: esterasi idrolasi esteri carbossilici idrolasi monoesteri fosforici –3.2 legami glicosidici: glicosidasi –3.3 altri legami –3.4 legami peptidici –3.5 legami C-N non peptidici –3.6 legami anidridici –3.7 legami C-C Classificazione Internazionale Enzimi

21 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA 1 - ossidoreduttasi 2 - trasferasi 3 - idrolasi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami –4.1 legami C = C –4.2 legami C = O –4.3 legami C = N –4.4 legami C = S Classificazione Internazionale Enzimi

22 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA 1 - ossidoreduttasi 2 - trasferasi 3 - idrolasi 4 - liasi 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero –5.1 racemasi –5.2 cis-trans isomerasi Classificazione Internazionale Enzimi

23 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA 1 - ossidoreduttasi 2 - transferasi 3 - idrolasi 4 - liasi 5 - isomerasi 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami (con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi) –6.1 legami C-O –6.2 legami C-S –6.3 legami C-N –6.4 legami C-C Classificazione Internazionale Enzimi

24 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempi: ATP + Creatina creatina-fosfato + ADP ATP : Creatina fosfotrasferasi EC Alcool + NAD + aldeide (o chetone) + NADH Alcool: NAD + ossidoreduttasi EC NOMENCLATURA

25 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA NOMENCLATURA

26 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA UNITÀ DI MISURA Un enzima può essere misurato in termini di concentrazione come qualunque altra proteina Da un punto di vista analitico interessa invece la misura dell’attività catalitica (o attività enzimatica) che si esprime in Unità Internazionali (U.I.) ed è definita come: Una unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in grado di catalizzare la trasformazione di una micromole di substrato in condizioni standardizzate. Si definisce inoltre costante catalitica o numero di turnover l’attività enzimatica per mole di enzima. Si definisce la specificità di un enzima l’attività enzimatica per mg di proteina (espressione di purezza di una preparazione).

27 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA CONCENTRAZIONE CATALITICA Nel 1972 la commissione per la nomenclatura degli enzimi e la Federazione Nazionale di Chimica Clinica (IFCC) introducono l’unità katal (kat) che misura la velocità di reazione in mols -1 L’unità di misura fu aggiunta all’International System al “21th General Conference of Weights and Measures” nel Per un dato metodo analitico vale la relazione: 1 U = 1  mol/min = mol/min = nmol/s  nKat

28 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA G6125 Glucose Oxidase Aspergillus niger Type II 15,000-25,000 units/g solid (without added oxygen) Synonyms -D-Glucose: oxygen 1-oxidoreductase GOx G.Od. CAS Number Enzyme Commission (EC) Number EG/EC NumberEINECS MDL numberMFCD Analysis NoteProtein determined by Biuret method. CautionSome loss of activity may occur after more than 3 days at room temperature. This product may be shipped with or without dry ice. LinkageThis preparation is formulated from Type VII, G 2133, by addition of potassium gluconate. Unit Definition One unit will oxidize 1.0µmole of -D-glucose to D-gluconolactone and H 2 O 2 per min at pH 5.1 at 35° C, equivalent to an O 2 uptake of 22.4µl per min. If the reaction mixture is saturated with oxygen, the activity may increase by up to 100%. Properties storage temp. 20°C foreign activity Catalase2 Sigma units/mg solid foreign activityamylase, invertase and glycogenase, and maltase and galactose oxidase ~2 % References MerckMerck13, 4473 Safety Information Hazard CodesXn Risk Statements42 Safety Statements22-45 RTECSRQ

29 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA P6782 Peroxidase horseradish Type VI-A ~1000 units/mg solid (using ABTS) units/mg solid (using pyrogallol) essentially salt-free, lyophilized powder SynonymsHorseradish peroxidase Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase CAS Number Enzyme Commission (EC) Number EG/EC Number MDL numberMFCD Analysis NoteThis product is assayed using ABTS for easy comparison to other suppliers'unit: approx. 1,000 units per mg solid LinkageSimilar to P8375 PackagingPackaged in mg solid Unit DefinitionOne ABTS unit will oxidize 1µmole of ABTS per minute at 25°C at pH 5.0 Analysis NoteUsing 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) tablets (Prod. No. A 9941) as substrate, approx. four times the activity is observed. Analysis NoteThe RZ ( Reinheitszahl) is the absorbance ratio A 403 /A 275 determined at mg/ml in deionized water. It is a measure of hemin content, not enzymatic activity. Even preparations with high RZ may have low enzymatic activity. Unit DefinitionOne unit will form 1.0 mg purpurogallin from pyrogallol in 20 sec at pH 6.0 at 20°C, unless otherwise indicated in the listing. This purpurogallin (20 sec) unit is equivalent to approx. 18µM units per min at 25°C. Description

30 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Related Products SubstrateA0156 N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol minimum 90 %A0156 SubstrateA1661 N-(6-Aminohexyl)-N-ethylisoluminolA1661 SubstrateA1888 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt ~ 98 % TLCA1888 SubstrateA Aminosalicylic acid ~ 99 %A3537 SubstrateA Aminoantipyrine Reagent GradeA4382 SubstrateA4685 Luminol sodium saltA4685 SubstrateA Amino-9-ethylcarbazole ~ 90 %A5754 SubstrateA Aminophthalhydrazide monohydrateA8264 SubstrateA8511 Luminol minimum 97 % HPLCA8511 SubstrateD5907 Dicarboxidine dihydrochlorideD5907 SubstrateD9143 o-DianisidineD9143 SubstrateG5502 GuaiacolG5502 SubstrateH (4-Hydroxyphenyl)propionic acidH6386 SubstrateP2923 Pyrogallol ACS ReagentP2923 InhibitorQ0125 Quercetin dihydrate minimum 98 % HPLC, PowderQ0125 InhibitorS2002 Sodium azide Reagent Plus,>= 99.5 %S2002 Related Products

31 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA C5421 Cholesterol Oxidase from Cellulomonas sp. buffered aqueous solution units/mg protein (biuret) SynonymsCholesterol: oxygen oxidoreductase CAS Number Enzyme Commission (EC) Number MDL numberMFCD Unit DefinitionOne unit will convert 1.0µmole of cholesterol to 4-cholesten-3-one per min at pH 7.5 at 25 °C. Note: 4-cholesten-3-one may undergo isomerization. Physical formSolution in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 storage temp. 20°C LiteratureSmith, A.G. and Brooks, C.J.W.,Biochem. Soc. Trans. 5, 1088 (1977) Identifiers Description Properties References

32 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Glucose Dehydrogenase Bacillus megaterium BioChemika ~33 units/mg Identifiers Synonyms -D-Glucose: NAD[P] + 1-oxidoreductase CAS Number Enzyme Commission (EC) Number EG/EC Number MDL numberMFCD Description MiscellaneousNADH-regenerating enzyme. Valine manufacture from ketoisovalerate Unit Definition 1 U corresponds to the amount of enzyme which will oxidize 1µmol-D-glucose to D- glucono--lactone per minute at pH 7.6 and 25°C Properties mol wtM r ~ storage temp. 20°C References LiteratureA. Honorat-Pascal et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 236 (1990) 49165

33 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA SITO ATTIVO sito di legame sito catalitico lisozima

34 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA SITO ATTIVO Sito catalitico: sito dove avviene la reazione Sito di legame: - zona dove il substrato si lega - il substrato si lega all’enzima con interazioni deboli - la forma è complementare al substrato - sono cavità o fenditure

35 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA Inizialmente si forma il complesso enzima (E)/substrato (S) Il complesso ES va verso lo stato di transizione Si forma un complesso tra enzima (E) e prodotto (P) E e P si separano Tutti questi passaggi sono equilibri

36 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA

37 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA Formazione del complesso ES

38 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Formazione dello stato di transizione ES * PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA

39 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Formazione del complesso EP PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA

40 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA Formazione del prodotto P

41 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA CARATTERISTICHE DEL SITO ATTIVO “Lock and key model” - proposto da Emil Fischer nel solo il substrato con la forma appropriata si adatta al sito attivo “Induced-fit model” - proposto da Daniel Koshland nel la forma del sito attivo cambia profondamente quando si lega il substrato

42 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA “Lock and key model” Esempio: proteasi

43 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA “Induced- fit model” Esempio: esochinasi

44 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA

45 ISOENZIMI Gli enzimi non hanno una struttura omogenea Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano diverse proprietà molecolari (diversa carica elettrica, diversa solubilità, diversa resistenza ad agenti chimici e fisici) e/o diverse proprietà funzionali presentano differenze in termini di pH ottimale, affinità per substrato e coenzima….. Es. Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH: LDH 1 4 subunità H LDH 2 3 subunità H e da una M (H 3 M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone) LDH 3 (H 2 M 2 ) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi) LDH 4 (HM 3 ) LDH 5 (M 4 ) (fegato e muscoli scheletrici)

46 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONE L’energia libera di attivazione  G è la quantità di energia necessaria per portare tutte le molecole di 1 mole di una sostanza, ad una data temperatura, allo stato di transizione stato iniziale stato finale stato di transizione energia libera di attivazione della reazione in avanti (catalizzata) energia libera di attivazione della reazione in avanti (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione inversa (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione inversa (catalizzata) cambiamento totale di energia libera durante la reazione direzione della reazione energia libera Gli enzimi esercitano la loro attività catalitica abbassando l’energia libera di attivazione Di conseguenza, in presenza di enzima sarà maggiore la concentrazione della specie allo stato di transizione La velocità di reazione è proporzionale alla concentrazione della specie allo stato di transizione Quindi, gli enzimi esercitano la loro attività catalitica aumentando la velocità delle reazioni chimiche

47 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Gli enzimi: abbassano la barriera dell’energia di attivazione inserendo stati di transizione più bassi stabilizzano lo stato di transizione CATALISI ENZIMATICA

48 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ATTIVITÀ ENZIMATICA L’attività di un enzima viene misurata come velocità della reazione da esso catalizzata La velocità di reazione viene misurata in termini di quantità di substrato trasformato, o di prodotto che si forma, nell’unità di tempo La velocità delle reazioni chimiche è soggetta a leggi chimico- fisiche ben definite che consentono di ricavare delle equazioni della velocità diverse a seconda del tipo di reazione Queste equazioni mettono in relazione la velocità di reazione con la concentrazione dei reagenti

49 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Cinetiche chimiche (A  P) Equilibrio V iniziale VtVt Concentrazione di prodotto Tempo k=costante di velocità n=numero intero 1-3

50 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA La velocità di reazione viene misurata in termini di quantità di substrato trasformato, o di prodotto che si forma, nell’unità di tempo Entrambi gli approcci sono corretti, tuttavia è consigliabile misurare il prodotto che si forma perché è più “facile” misurare un piccolo incremento di concentrazione a partire da un valore 0, piuttosto che un piccolo decremento a partire da un valore elevato Per utilizzare la misura del prodotto bisogna conoscere la stechiometria della reazione, perchè la definizione di unità di attività enzimatica è riferita alla trasformazione di substrato Se il rapporto stechiometrico tra substrato e prodotto non è 1:1 bisogna tenerne conto

51 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Conc. di prodotto Tempo Velocità V iniziale V finale Conc. di substrato Tempo Cinetiche chimiche (A  P)

52 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA CINETICA CHIMICA Le reazioni chimiche vengono classificate su base cinetica per mezzo dell’ordine di reazione L’ordine di reazione indica come la velocità di reazione dipende dalla concentrazione dei reagenti Reazioni di 1° ordine A P A + B P 2 A P Reazioni di 2° ordine Reazioni di ordine 0 La velocità di reazione non dipende dalla concentrazione dei reagenti

53 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA [prodotto] Tempo A1 [A] Velocità iniziale A2 A1 A3 A4 Effetto della concentrazione di A (A  P) A4 > A3 > A2 > A1

54 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Il grafico velocità-concentrazione per una reazione enzimatica è un’iperbole rettangolare, descritta da un’equazione del tipo dove la velocità v e la concentrazione di substrato [s] sono le due variabili, mentre V e K m sono due costanti Velocità iniziale [A] Cinetica enzimatica Cinetica chimica Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche

55 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA VELOCITÀ MASSIMA (V max ) La costante V rappresenta la velocità massima (V max ) o limitante della reazione e si raggiunge ad alte concentrazioni di substrato All’aumentare di [s], la velocità aumenta e tende asintoticamente al valore massimo, che non può essere superato indipendentemente dall’aumento di [s], perché ad alte concentrazioni di s l’enzima è saturato In queste condizioni la velocità di reazione non dipende da [s] ed è quindi di ordine 0 [substrato] velocità V max ½ V max KmKm Ad elevata [s] lo stadio limitante della reazione è la conversione del complesso attivato ES a prodotto P + E V max rappresenta la velocità a [s] infinita, quindi è la velocità dello stadio limitante Di conseguenza, V max rappresenta una misura diretta dell’abilità dell’enzima di convertire il substrato in prodotto, cioè della attività enzimatica k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 k 1 k 2 E + S ES E + P k -1

56 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA COSTANTE DI MICHAELIS (K m ) La costante di Michaelis (K m ) è definita come la concentrazione di substrato alla quale la velocità di reazione è uguale alla metà della velocità massima (1/2 V max ) Substrato, enzima e complesso enzima-substrato si trovano in uno stato di equilibrio. Ad alte concentrazioni di substrato l’equilibrio è tutto spostato verso destra, quindi l’enzima è saturato e la velocità raggiunge il valore massimo. Nel punto in cui metà delle molecole di enzima sono saturate la velocità sarà metà della V max La posizione dell’equilibrio dipende anche dalla forza dei legami tra substrato ed enzima. Più essi sono deboli, più alta è la concentrazione di substrato necessaria per avere il 50% di saturazione dell’enzima, quindi più alto sarà il valore di K m K m è una espressione della affinità dell’enzima per il substrato: basso valore di K m alta affinità alto valore di K m bassa affinità k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 [substrato] velocità V max ½ V max KmKm

57 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Ipotesi v 0 =V max /2 K M = [S] quando v 0 =V max /2 E’ una concentrazione (dimensioni moli/litro) E’ indipendente da [E]

58 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Trasformazione di Lineweaver-Burk Y X

59 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche 1/K M 1/[S] 1/v 0 1/V max

60 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche 1/[S] 1/V 0 1/K M 1/V max V max [S] KMKM V max /2 Grafico di Lineweaver-Burk V0V0

61 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN L’equazione vista in precedenza, che descrive la relazione velocità- concentrazione di substrato in una reazione enzimatica, è l’equazione di Michaelis-Menten Come già detto, V max è la velocità dello stadio limitante della reazione enzimatica ad alte concentrazioni di substrato, quindi V max = k 2 [ES] Ad alte concentrazioni di substrato l’enzima è saturato, perciò [ES] = [E], da cui V max = k 2 [E] L’equazione può essere scritta in una forma diversa che evidenzia la dipendenza della velocità, oltre che dalla concentrazione di substrato, dalla concentrazione di enzima k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 k 1 k 2 E + S ES E + P k -1

62 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni: Regione 1 CINETICA ENZIMATICA  La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S]  Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato 1° ordine >> Velocità della reazione

63 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA CINETICA ENZIMATICA Regione 2  Regione non utile dal punto di vista analitico intermedieordine misto v  Regione 3  Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica ordine 0 << Velocità della reazione

64 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN In condizioni di eccesso di substrato la velocità delle reazioni enzimatiche dipende solo dalla concentrazione di enzima La V max sarà proporzionale alla concentrazione di E, quindi sarà una misura di attività enzimatica >> Velocità della reazione [s]

65 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA VELOCITÀ INIZIALE Una reazione enzimatica è un processo cinetico, perciò un parametro importante nella misura di attività enzimatica è il tempo La velocità è definita come variazione di concentrazione del prodotto nel tempo Quindi, la velocità è data dalla pendenza di questa curva La pendenza della curva (velocità) varia nel tempo temp o veloc ità tempo [P] La misura di velocità deve essere effettuata ad un tempo ben preciso, nell’intervallo in cui si osserva una relazione lineare tra [P] e tempo, quindi nelle fasi iniziali della reazione La misura di attivita’ enzimatica e’ una misura di velocita’ iniziale della reazione La velocità iniziale si indica con v 0 oppure v i 1 2

66 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA APPROCCIO ALTERNATIVO ALLA MISURA DI VELOCITÀ INIZIALE Teoricamente sarebbe possibile misurare l’attività enzimatica anche nella fase di plateau, quando la velocità di reazione è nulla Bisognerebbe misurare il tempo necessario per raggiungere il plateau Maggiore è l’attività enzimatica, minore sarà il tempo necessario per raggiungerlo Inconvenienti: –difficoltà di effettuare una misura accurata del tempo (elevato errore sulla misura) –tempi lunghi di esecuzione del metodo, in particolare per la misura di attività enzimatiche basse tempo [P]

67 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA VELOCITÀ INIZIALE La misura della velocità iniziale della reazione enzimatica assicura che: si sta misurando la velocità massima V max l’enzima è in buone condizioni, cioè non è ancora andato incontro a possibili fenomeni di denaturazione non si sono ancora verificati eventuali fenomeni di inibizione da prodotto è possibile distinguere tra attività enzimatiche diverse (procedendo nel tempo campioni con attività enzimatiche diverse consumerebbero tutto il substrato, anche se in tempi diversi, quindi produrrebbero la stessa quantità di prodotto e la stessa intensità di segnale, come nel caso dell’accumulo di un prodotto colorato della reazione) il metodo analitico è rapido

68 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ASPETTI PRATICI DELLA MISURA DI VELOCITÀ INIZIALE In linea teorica bisognerebbe seguire la cinetica della reazione per un certo tempo, poi tracciare la tangente alla curva al tempo 0 (per essere certi di misurare la velocità iniziale) e calcolare la pendenza della tangente, che rappresenta la velocità iniziale della reazione Questo approccio è dispendioso in termini di tempo Dal punto di vista del disegno sperimentale la principale variabile è il numero di misure da effettuare per determinare l’attività enzimatica Metodi ad un punto, a due punti, multipunto

69 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI AD UN PUNTO Affinchè la misura sia accurata: –il segnale al tempo 0 deve essere 0 oppure, se diverso da 0, deve essere costante e bisogna misurarlo (bianco della reazione) per poi sottrarlo –ci deve essere linearità di risposta dal tempo 0 al tempo x al quale viene eseguita la misura Si effettua una sola misura di segnale (ad es. assorbanza) ad un tempo prestabilito dopo l’inizio della reazione Si risale all’attività enzimatica tramite una curva di calibrazione o un fattore di conversione tempo segnale txtx SxSx La condizione di linearità si verifica se la misura viene effettuata il prima possibile dopo l’inizio della reazione In questo caso si misura una piccola variazione di segnale, che sarà accompagnata da un maggiore errore relativo

70 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI AD UN PUNTO La linearità della risposta nel tempo tra l’inizio della reazione ed il tempo di misura non è ovvia In condizioni ideali c’è linearità per un tempo relativamente lungo In pratica la cinetica può essere diversa Inibizione da prodotto Teorica Insufficienza di substrato Reazione autocatalizzante tempo segnale N.B.La scala dei tempi è dilatata per evidenziare ciò che accade nei primi istanti della reazione Linearità di risposta

71 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI AD UN PUNTO Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi ad un punto Metodi manuali e metodi automatizzati basati su analizzatori automatici discreti -Per effettuare la misura ad un tempo prestabilito la reazione enzimatica viene bloccata (variazione di pH o temperatura, aggiunta di un inibitore) Metodi automatizzati basati su analizzatori automatici a flusso continuo -Campione e reagenti fluiscono attraverso un sistema di tubi mentre avviene la reazione e passano di fronte o attraverso il sistema di rivelazione -Il tempo al quale raggiungono il rivelatore viene definito regolando il flusso e la posizione del rivelatore lungo il sistema Approccio tecnico

72 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI A DUE PUNTI Affinchè la misura sia accurata: ci deve essere linearità di risposta tra i due tempi t 1 e t 2 ai quali viene eseguita la misura Si effettuano due misure di segnale (ad es. assorbanza) a due tempi prestabiliti dopo l’inizio della reazione Si potrebbero anche misurare i tempi necessari per raggiungere due valori prestabiliti di segnale, ma sarebbe più difficile automatizzare il sistema Questi metodi presentano il vantaggio di non richiedere la misura del bianco della reazione perché l’attività enzimatica viene calcolata come  S /  t tempo segnale t1t1 S1S1 t2t2 S2S2

73 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI A DUE PUNTI Affinchè sia realizzata la condizione di linearità 2° punto -la linearità deve mantenersi per un tempo relativamente lungo 1° punto -bisogna sapere se c’è un ritardo nel raggiungimento della linearità dovuto, ad esempio, ad interferenti della matrice biologica -o se c’è una falsa velocità iniziale elevata dovuta a componenti del campione che autocatalizzano la reazione Linearità di risposta Nel caso di attività enzimatiche elevate per aumentare l’intervallo di linearità si diluisce il campione Ciò potrebbe creare problemi perché molti enzimi sono più stabili quando ad alta concentrazione

74 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI A DUE PUNTI Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi a due punti Metodi automatizzati basati su analizzatori automatici discreti -Ovviamente non si può bloccare la reazione al primo tempo di misura -A tempi prestabiliti vengono prelevate due aliquote di miscela di reazione in cui la reazione viene bloccata e si misura il segnale Metodi automatizzati basati su analizzatori automatici a flusso continuo -La miscela di reazione fluisce attraverso due rivelatori posti ad una certa distanza fissa -Il flusso deve essere regolato accuratamente perché da esso dipendono i tempi ai quali vengono effettuate le misure Approccio tecnico

75 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI Gli enzimi non sono l’oggetto dell’analisi, ma vengono utilizzati come “strumenti” analitici per determinare la concentrazione degli analiti di interesse Vantaggi –L’elevata specificità degli enzimi per i loro substrati consente spesso l’analisi diretta dei campioni biologici, senza o con poche e semplici fasi di estrazione e purificazione –L’elevato potere catalitico degli enzimi fa sì che i metodi enzimatici siano caratterizzati da bassi limiti di rivelazione, il che rende sufficienti volumi molto piccoli di campione Maggiore rapiditàMaggiore accuratezza Risparmio di reagenti Prelievo di piccoli volumi di fluidi biologici

76 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Per la determinazione quantitativa di numerosi analiti sono disponibili diversi metodi I metodi enzimatici sono entrati nella routine di molti laboratori per la loro efficienza, rapidità, costi relativamente bassi e possibilità di automazione Metaboliti quali glucosio, colesterolo, trigliceridi, etanolo, urea, acido urico e molti altri vengono comunemente determinati per via enzimatica Per effettuare un’analisi quantitativa, cioè per risalire dalla concentrazione del prodotto misurato alla concentrazione dell’analita, è necessario che tutto il substrato (analita) venga trasformato in prodotto Perciò questi metodi enzimatici vengono detti a punto finale È inoltre necessario conoscere il rapporto molare tra substrato e prodotto DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI

77 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni: Regione 1 CINETICA ENZIMATICA  La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S]  Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato 1° ordine >> Velocità della reazione

78 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI A PUNTO FINALE SEMPLICI È sufficiente una sola reazione enzimatica per la determinazione della concentrazione dell’analita di interesse S E ind. P –Queste condizioni non sono sufficienti per garantire che il substrato venga consumato completamente  Condizioni sperimentali –Enzima indicatore in eccesso –pH e Temperatura ottimali

79 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI A PUNTO FINALE SEMPLICI Esempio: acido lattico Per spostare la reazione dall’equilibrio e spostarla verso destra è necessario rimuovere i prodotti di reazione man mano che si formano –Accoppiamento con una seconda reazione enzimatica –Aggiunta di un reagente chimico che si leghi ai prodotti di reazione Nell’esempio riportato si può usare idrazina, che si lega al piruvato e lo rimuove Nei metodi a punto finale semplice l’eventuale accoppiamento con un’altra reazione enzimatica ha il solo scopo di rimuovere i prodotti Acido lattico + NAD + Acido piruvico + NADH + H + LDH

80 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI È necessario accoppiare alla prima reazione enzimatica una o più reazioni enzimatiche per la determinazione della concentrazione dell’analita di interesse –La reazione indicatrice svolge anche la funzione di rimuovere continuamente i prodotti di reazione man mano che si formano, garantendo lo spostamento verso destra della reazione ed il consumo completo del substrato  Condizioni sperimentali –Enzimi indicatore ed ausiliario in eccesso –pH e Temperatura ottimali S E aus. P1P1 E ind. P2P2

81 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI Esempio: fosfolipidi Fosfatidilcolina Acido fosfatidico + Colina Fosfolipasi D Colina Betaina + H 2 O 2 Colina ossidasi 2H 2 O 2 + Cromogeno Prodotto colorato + 2H 2 O + O 2 Perossidasi 2H 2 O 2 + Luminolo Ione aminoftalato + 2H 2 O + O 2 + h Perossidasi OPPUREOPPURE

82 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ASPETTI QUANTITATIVI interpolazione del valore di segnale su una curva di calibrazione costruita con degli standard a concentrazione nota di analita confronto con un’unico standard, quando si presuppone linearità di risposta su un certo intervallo, attraverso la relazione derivante dalla legge di Lambert-Beer La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata mediante: Quando non si dispone di uno standard puro, la concentrazione dell’analita viene ricavata mediante il coefficiente di estinzione molare  del prodotto colorato, sfruttando la legge di Lambert-Beer

83 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ASPETTI QUANTITATIVI La concentrazione dell’analita viene determinata nella miscela di reazione, non nel campione di partenza Perciò bisogna tenere conto del volume V della miscela di reazione e del volume v del campione: Gli analizzatori automatici vengono programmati in modo da applicare funzioni che tengono conto di questi fattori

84 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ENZIMI IMMOBILIZZATI Vantaggi Possibilità di recuperare e riutilizzare gli enzimi al termine della reazione (riduzione dei costi) Stabilità (risultati molto accurati e riproducibili) Possibilità di automazione, ad esempio immobilizzando gli enzimi su gel di poliacrilammide e formando con esso delle colonne Riproduzione più fedele della situazione che si verifica nelle cellule, specialmente per quegli enzimi che sono fissati su organuli cellulari Nel caso della determinazione della concentrazione di analiti mediante enzimi, gli enzimi possono essere immobilizzati su supporti insolubili quali cellulosa, polipeptidi, polimeri sintetici

85 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ENZIMI IMMOBILIZZATI “Carrier binding” Entrapment Cross-linking

86 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ENZIMI IMMOBILIZZATI SU ELETTRODI Un elettrodo specifico per gli ioni ammonio viene rivestito con un gel impregnato di ureasi L’urea permea il gel dove viene idrolizzata dall’enzima formando ioni ammonio Gli enzimi possono essere immobilizzati su un elettrodo specifico per il composto che viene modificato o prodotto nel corso della reazione enzimatica, ottenendo così un biosensore enzimatico CO(NH 2 ) 2 + 2H 2 O + H + 2NH HCO 3 - Ureasi Esempio In alternativa, un normale elettrodo per pH viene rivestito con un gel impregnato di ureasi e si misura il cambiamento di pH conseguente all’idrolisi enzimatica dell’urea

87 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA L’organismo è in grado di regolare l’attività catalitica dei suoi enzimi controllando la quantità di enzima nella cellula mediante regolazione dell’espressione genica delle proteine per la sintesi degli enzimi e per la degradazione degli enzimi controllando l’attività enzimatica mediante: - controllo diretto dell’attività enzimatica mediante l’uso di inibitori e attivatori che spesso causano modifiche strutturali all’enzima influenzando l’abilità del substrato di legarsi all’enzima - controllo mediante modifica reversibile covalente dell’enzima REGOLAZIONE DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA

88 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA REGOLAZIONE DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA Temperatura, pH, concentrazione substrato, concentrazione enzima Processi biologici di regolazione: - Inibitori - “Endpoint inibition” - “Feedback inibition” - Allosterismo - Regolazione proteolitica

89 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA EFFETTO DEL pH

90 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA EFFETTO DEL pH Il profilo a campana è il più comune 6810 tripsina 6810 colinesterasi 468 papaina 246 pepsina pH attività enzimatica relativa

91 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Per ogni enzima, esiste una temperatura ottimale La temperatura ottimale può non corrispondere con la temperatura in cui si trova l’enzima (37°C) Aumento dovuto alla temperatura ( ogni 10°C) Diminuzione dovuta alla denaturazione della proteina Risultato Attività Temperatura EFFETTO DELLA TEMPERATURA

92 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA INIBITORI ENZIMATICI Diverse sostanze possono inibire l’attività enzimatica: Analoghi del substrato, Tossine, Farmaci, Complessi di metalli Informazioni sul percorso metabolico Informazioni su come tossine o farmaci esercitano il loro effetto Migliore comprensione del meccanismo di catalisi enzimatica

93 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Due grandi classi di inibitori sono stati individuati in base all’entità dell’interazione: Inibitori irreversibili formano legami covalenti o forti non covalenti. Il sito di attacco è un gruppo amminoacidico che partecipa alla normale reazione enzimatica inibitore reversibili Formano legami deboli, non covalenti. L’enzima è Inattivo solamente quando l’inibitore è presente Gli inibitori si dividono poi in: competitivo, non competitivo, acompetitivo INIBITORI ENZIMATICI

94 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Inibitori competitivi Sono analoghi al substrato con cui competono per il legame al sito attivo Inibitori non competitivi Si legano ad un sito diverso dal sito attivo causando l’inattivazione dell’enzima INIBITORI ENZIMATICI

95 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA INIBIZIONE COMPETITIVA V max 1/[S] 1/v 0  1/K M 1/V max [S] v0v0  inibitore  inibitore  KM KM V max /2

96 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA INIBIZIONE COMPETITIVA Substrati suicidi o antimetaboliti, prevengono la reazione col substrato e/o disattivano l’enzima Penicillina inibisce transpeptidasi che stabilizza le membrane batteriche

97 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA INIBIZIONE NON COMPETITIVA 1/K M 1/[S] 1/v 0  1/V max [S] v0v0  inibitore  inibitore  V max KMKM  V max /2

98 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Degradazione proteica (temperatura, estremi di pH) Molti veleni e composti mercuriali (reagiscono con -SH dei residui di Cys) INIBIZIONE NON COMPETITIVA

99 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA INIBIZIONE NON COMPETITIVA Diisopropil fluorofosfato (Sarin), gas nervino, inibisce gli enzimi contenenti Ser (acetilcolinesterasi)

100 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA INIBIZIONE ENZIMATICA Inibitori acompetitivi

101 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA INIBIZIONE ACOMPETITIVA 1/K M V max [S]KMKM 1/[S] 1/V 0 1/V max V0V0 + inibitore

102 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Endproduct inibition Feedback inibition In questo caso P è l’attivatore della molecola enzimatica INIBITORI/ATTIVATORI ENZIMATICI

103 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA

104 REGOLAZIONE ALLOSTERICA Enzimi che regolano la tappa più lenta dell’intero processo enzimatico sono a loro volta regolati da un effettore=molecola o cofattore Processi (positivi e negativi) reversibili Esempio di allosterismo positivo

105 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA REGOLAZIONE ALLOSTERICA Esochinasi (HK) Glucosio + ATP  glucosio-6-fosfato + ADP Quando HK lega glucosio, l’affinità per ATP aumenta Quando HK lega ATP, l’affinità per glucosio aumenta

106 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA REGOLAZIONE PROTEOLITICA Con la regolazione proteolitica un enzima inattivo viene convertito irreversibilmente nella sua forma attiva. Alcuni enzimi vengono sintetizzati come zimogeni (enzima inattivo) e attivati per rottura di uno o più legami peptidici specifici

107 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA proinsulina  insulina

108 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Chimotripsinogeno  chimotripsina

109 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Attivazione degli zimogeni pancreatici mediante taglio proteolitico

110 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempio: ACETILCOLINESTERASI

111 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempio: FIBRINA

112 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempio: FIBRINA

113 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempio: FIBRINA

114 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempio: FIBRINA

115 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempio: FIBRINA

116 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempio: FIBRINA

117 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempio: PEROSSIDASI

118 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempio: PEROSSIDASI

119 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempio: PEROSSIDASI

120 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA

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128 METODI DI MISURA La possibilità di “vedere” una reazione enzimatica è legata al fatto che i substrati e i prodotti hanno proprietà chimico-fisiche diverse Tali proprietà devono poter essere misurabili I metodi di rivelazione più comuni in enzimologia sono: –spettrofotometrici –spettrofluorimetrici

129 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Determinazione spettrofotometrica fotocellula (luce trasmessa: T% o A) fotocellula (luce diffusa: NTU) fonte luminosa (lampada al tungsteno) luce bianca monocromatore (filtro, prisma, reticolo) luce monocromatica cuvette o tubo contenente la coltura La lampada emette luce con intensità I 0. A causa della diffusione, della rifrazione e dell’assorbimento arriva alla fotocellula per luce trasmessa un’intensità I. I/I 0 è la trasmittanza (0-100%). L’assorbanza è log(I/I 0 ) e varia in genere fra 0 e 3. Per un intervallo limitato (0-0,6) esiste una relazione lineare fra assorbanza e numero di cellule o biomassa.

130 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI SPETTROFOTOMETRICI Misura diretta Misura mediante derivati chimici Misura mediante derivati generati enzimaticamente

131 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI SPETTROFOTOMETRICI- MISURA DIRETTA Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nel Vis (metodi colorimetrici) –Esempio: fosfatasi alcalina rivelata mediante il substrato cromogenico p- nitrofenilfosfato, idrolizzato enzimaticamente a p-nitrofenolo che in ambiente basico assorbe a 405 nm (giallo) Misura diretta

132 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA uricasi 3. L’allantoina non assorbe a 290 nm quindi la concentrazione dell’acido urico si ottiene per differenza 1. Misura di assorbanza a 290 nm: assorbono altri costituenti 2. Aggiunta di uricasi: decomposizione del solo acido urico  Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nell’UV (gruppi ciclici e doppi legami) Esempio: uricasi rivelata mediante l’assorbimento a 293 nm dell’acido urico che viene trasformato dall’enzima in allantoina METODI SPETTROFOTOMETRICI- MISURA DIRETTA

133 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA N + R NH 2 O N R NH 2 O.. + H + + 2e - + H NADNADH L’attività enzimatica delle ossidoreduttasi che utilizzano (consumano o producono) NAD(P)H come cofattore può essere determinata direttamente perché il NAD(P)H ha un massimo di assorbimento caratteristico a 340 nm che non si trova nel cofattore in forma ossidata NAD(P) + Il NAD(P)H può essere misurato anche in fluorescenza, con un massimo di eccitazione a 340 nm ed un massimo di emissione a 460 nm Vantaggi: più basso limite di rivelazione teorico Svantaggi: interferenze della matrice che producono un alto segnale di fondo METODI SPETTROFOTOMETRICI- MISURA DIRETTA

134 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Inconvenienti della misura di assorbimento nell’UV: lampada a idrogeno per generare l nm cuvette di quarzo costose proteine ed acidi nucleici nel campione che assorbono nell’UV METODI SPETTROFOTOMETRICI - UV/Vis

135 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI SPETTROFOTOMETRICI - DERIVATI CHIMICI Sali di tetrazolio Composti cromogenici che vengono ridotti a formazani caratterizzati da valori elevati del coefficiente di assorbività molare  Misura mediante derivati chimici N R3CR3C NR 2 N+R1N+R1 N Cl - N CR 3 R2NR2N + N N N R3CR3C NR 2 N+N+ N RxRx RyRy 2Cl - Sale monotetrazolicoSale ditetrazolico R = gruppi aromatici

136 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Sali di tetrazolio Esempio: alcol deidrogenasi Misura mediante derivati chimici Il valore di  dei formazani è 2-4 volte più alto di quello del NAD(P)H, perciò si ottengono limiti di rivelazione 2-3 volte più bassi (A =  bc) Etanolo Acetaldeide NAD + NADH + H + PMS PMSH Prodotto di riduzione (formazano) Sale di tetrazolio PMS = fenazina metasolfato Alcol deidrogenasi METODI SPETTROFOTOMETRICI - DERIVATI CHIMICI

137 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Misura mediante derivati generati enzimaticamente Accoppiamento con ossidoreduttasi YH 2 + NAD(P) + Y + NAD(P)H + H + X + NAD(P)H + H + XH 2 + NAD(P) + Esempio: alanina aminotrasferasi (ALT) mediante lattato deidrogenasi (LDH) 2-Oxoglutarato Glutammato Alanina Piruvato Lattato NADH + H + NAD + ALTLDH METODI SPETTROFOTOMETRICI - DERIVATI ENZIMATICAMENTE

138 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Accoppiamento con perossidasi Esempio: glucosio ossidasi Glucosio Acido gluconico H 2 O + O 2 H2O2H2O2 Accettore cromogenico o luminogenico Prodotto colorato o fotoni Glucosio ossidasi Perossidasi Misura mediante derivati generati enzimaticamente METODI SPETTROFOTOMETRICI - DERIVATI ENZIMATICAMENTE

139 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Esempio: fosfolipasi Fosfatidilcolina + 2H 2 O Acido fosfatidico + Colina Fosfolipasi Colina + 2O 2 Betaina + 2H 2 O 2 Colina ossidasi 2H 2 O 2 + Accettore Prodotto colorato + 2H 2 O + O 2 Perossidasi Accoppiamento con perossidasi Misura mediante derivati generati enzimaticamente METODI SPETTROFOTOMETRICI - DERIVATI ENZIMATICAMENTE

140 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI NON SPETTROSCOPICI Misure conduttimetriche CO(NH 2 ) 2 + H 2 O 2NH CO 3 2- Ureasi Esempio Utilizzo di elettrodo specifico per NH 4 + Misure polarografiche glucosio + O 2 acido gluconico + H 2 O 2 Glucosio ossidasi Esempio Utilizzo di elettrodo selettivo per O 2 È disponibile un analizzatore automatico commerciale per la determinazione del glucosio basato su questo principio

141 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA METODI NON SPETTROSCOPICI Misure potenziometriche triacilgliceroli + H 2 O diacilgliceroli + monoacilgliceroli + ac. grassi - + H + Lipasi Esempio Utilizzo di elettrodo per H + (misura di pH) Misure microcalorimetriche Utilizzo di un termistore che consente di misurare le microvariazioni di calore che accompagnano le reazioni enzimatiche

142 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA Reazioni enzimatiche semplici  Condizioni sperimentali –Substrato ed eventuali Cofattori in eccesso –pH e Temperatura controllati rigorosamente –Attenzione alla inibizione da substrato S E P

143 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA Reazioni enzimatiche accoppiate  Condizioni sperimentali –Substrato, eventuali Cofattori ed Enzimi indicatori ed ausiliari in eccesso –pH e Temperatura controllati rigorosamente S E prim. P1P1 E ind. P2P2 S E prim. P1P1 E ind. P3P3 E aus. P2P2

144 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA Reazioni enzimatiche accoppiate La reazione primaria deve essere l’unico fattore limitante Le reazioni indicatrici ed ausiliarie devono essere molto più veloci della reazione primaria, perché se P 1 non viene rimosso rapidamente –può spostare il primo equilibrio verso sinistra e ritardare la reazione primaria –può seguire una via metabolica diversa Per misure di almeno il 96% dell’attività enzimatica primaria k 2 / k 1 ≥ 100 S E prim. P1P1 E ind. P3P3 E aus. P2P2 S E prim. P1P1 E ind. P2P2 k1k1 k2k2

145 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA PRINCIPI DI RIVELAZIONE Oltre ai principi di rivelazione convenzionali quali: –spettrofotometria –spettrofluorimetria un altro principio di rivelazione si è affermato, in particolare nel settore dei metodi immunoenzimatici (utilizzo di reattivi marcati con enzimi): –Chemiluminescenza –Bioluminescenza

146 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA BIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZA La luminescenza è l’emissione di radiazione elettromagnetica nell’UV, visibile o IR da parte di atomi o molecole come risultato della transizione da uno stato elettronicamente eccitato ad un livello energetico più basso, solitamente lo stato fondamentale La chemiluminescenza (CL) è un fenomeno di luminescenza in cui l’energia per generare lo stato elettronicamente eccitato deriva da una reazione chimica La bioluminescenza (BL) è un fenomeno di chemiluminescenza nel visibile che si verifica in organismi viventi

147 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA SISTEMI CHEMILUMINESCENTI Sono stati definiti due tipi principali di reazioni CL: dirette ed indirette Le reazioni indirette sono dette CL a trasferimento di energia Prodotto + [Accettore]* Substrato CL [Prodotto]* Prodotto + h Accettore + h + Accettore DirettaIndiretta

148 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA SISTEMI CHEMILUMINESCENTI Reaz A: emissione costante Reaz B: rapido decadimento  BL/CL = n. fotoni emessi n. molecole reagenti Efficienza quantica Per reazioni CL :  Per reazioni BL: 

149 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA SISTEMI CHEMILUMINESCENTI Luminolo/H 2 O 2 /Perossidasi luminolo NH 2 NH NH O O H 2 O 2, OH - NH 2 COO - COO-O- NH 2 COO - COO-O- + h aminoftalato perossidasi

150 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA SISTEMI CHEMILUMINESCENTI Luminolo/H 2 O 2 /Perossidasi/Enhancer Relative photons/sec/pixel Time (min) enhanced conventional Conventional chemiluminescence Enhanced chemiluminescence (luminol) compound I peroxid ase (endoperoxi de) compound II LIGHT ( excited state of 3-aminoftalate- dianion ) (luminol) compound I peroxid ase compound II (endopero xide) LIGHT ( excited state of 3-aminoftalate- dianion ) Two possible sites of peroxidase amplification induced by the enhancers (superoxide radical)

151 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA SISTEMI CHEMILUMINESCENTI 1,2-Diossietani-fenil-fosfato/Fosfatasi alcalina HPO 4 2- O + O - O OCH 3 * + F F + h OO OCH 3 OPO 3 2- AMPPD O - O OCH 3 * + F fosfatasi alcalina OCH 3 O - AMP - D OO

152 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA SISTEMI CHEMILUMINESCENTI 1,2-Diossietani-fenil-  -D-galattopiranoside/  -Galattosidasi OO OCH 3 O O OH HO OH OH O OO OCH 3 o - O OCH 3 o - O h +  -galattosidasi + OCH 3 o - O *

153 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA SISTEMI BIOLUMINESCENTI Luciferina/luciferasi da lucciola, in particolare da Photinus pyralis (lucciola nord-americana) L’efficienza quantica F di questa reazione è vicina a 1 luciferina + ATP + O 2 ossiluciferina + CO 2 + AMP + P~P + luce luciferasi Mg 2+ + AMP + + luce N S S N HO COOH H N S S N HO O + ATP O 2, Mg 2+ luciferina luciferasi pirofosfato  BL/CL = n. fotoni emessi n. molecole reagenti

154 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA SISTEMI BIOLUMINESCENTI Luciferina/luciferasi da diverse specie di batteri marini quali Vibrio fischeri, V. harvei, Photobacterium phosphoreum Il sistema batterico luciferina/luciferasi in vivo è accoppiato ad una ossidoreduttasi che produce FMNH 2 O 2 NAD(P)H + H + + FMN NAD(P) + + FMNH 2 FMNH 2 + R-CHO + O 2 FMN + R-COOH + H 2 O + luce ossidoreduttasi luciferasi CH 3 (CH 2 ) 12 CHO + FMNH 2 CH 3 (CH 2 ) 12 COOH + FMN + luciferina batterica luciferasi batterica luce

155 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA ASPETTI QUANTITATIVI La maggior parte delle reazioni BL e CL coinvolge enzimi In presenza di un eccesso di substrato l’intensità del segnale luminoso è proporzionale all’attività enzimatica Al contrario, in presenza di un eccesso di enzima l’intensità dell’emissione luminosa è proporzionale alla concentrazione di substrato La bio- e chemiluminescenza rappresentano quindi un principio di rivelazione adatto all’analisi quantitativa

156 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA APPLICAZIONI ANALITICHE Determinazione dell’attività della perossidasi endogena in fluidi biologici, omogenati di tessuto, latte, singole cellule, sezioni di tessuto Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono ossidasi ed il sistema H 2 O 2 /H 2 O Luminolo/H 2 O 2 /Perossidasi

157 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA APPLICAZIONI ANALITICHE Luminolo/H 2 O 2 /Perossidasi colesterolo ossidasi colesterolo H 2 O 2 perossidasi luminolo aminoftalato + N 2 + H 2 O + h H 2 O 2 /OH - fosfolipasi D colina ossidasi fosfolipidi colina H 2 O 2 perossidasi luminolo aminoftalato + N 2 + H 2 O + h H 2 O 2 /OH -

158 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA CL from HRBC: CL from HRBC: Heme-catalyzed CL Heme-catalyzed oxidation of luminol H 2 O luminol intermediate products excited 3-aminophthalate light 3-aminophthalate + light 2 H 2 OHeme HRBC luminol NH 2 NH NH O O H 2 O 2, OH - Heme NH 2 COO - COOH NH 2 COO - CO + light

159 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA APPLICAZIONI ANALITICHE Luciferina/Luciferasi da lucciola Determinazione della concentrazione di ATP ed altri nucleotidi adeninici in campioni biologici Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono chinasi e la formazione o degradazione di ATP

160 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA APPLICAZIONI ANALITICHE Luciferina/Luciferasi da lucciola Le seguenti reazioni enzimatiche accoppiate vengono utilizzate, in diverse condizioni analitiche, per determinare la creatinina o la creatina chinasi nel sangue Tutte le chinasi, che producono o consumano ATP, possono essere accoppiate al sistema luciferina/luciferasi da lucciola creatinina creatina creatina + ATP creatina-fosfato + ADP ATP + luciferina + O 2 AMP + P~P + CO 2 + ossiluciferina + h creatinina ammide idrolasi creatina chinasi luciferasi Mg ++

161 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA APPLICAZIONI ANALITICHE Luciferina/Luciferasi batterica Determinazione della concentrazione di NADH e NADPH, con maggiore sensibilità per il NADH (fmoli) Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono deidrogenasi e la formazione o degradazione di NAD(P)H

162 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA APPLICAZIONI ANALITICHE Luciferina/Luciferasi batterica Le seguenti reazioni enzimatiche accoppiate vengono utilizzate per determinare gli acidi biliari nel sangue o nella bile Tutte le ossidoreduttasi, che producono o consumano FMNH 2, e le deidrogenasi ad esse accoppiate possono essere accoppiate al sistema luciferina/luciferasi da lucciola R-OH + NAD + R=O + NADH NADH + H + + FMN NAD + + FMNH 2 FMNH 2 + R-CHO + O 2 FMN + R-COOH + H 2 O + h 7  -idrossisteroide-deidrogenasi ossidoreduttasi luciferasi

163 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA CARATTERISTICHE ANALITICHE Rivelabilità superiore a quella delle reazioni colorimetriche e comparabile a quella dei radioisotopi Alta specificità Ampio intervallo dinamico Rapidità di risposta Costi ridotti e minori rischi rispetto all’uso di marcatori radioattivi

164 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA Fluorimetro SorgenteRivelatore Monocromatore o filtro Ottica Monocromatore o filtro Ottica Rivelatore ad elevata sensibilità (di solito basato su un tubo fotomoltiplicatore) Non sono necessari filtri o monocromatori (l’emissione BL/CL è specifica, ed ogni selezione di lunghezza d’onda ridurrebbe l’intensità del segnale) tranne che per particolari applicazioni (BRET, “dual reporter assays”…) Non è richiesta la sorgente di eccitazione Luminometro Comparto portacampioni ed ottiche ridisegnate per ottenere la massima efficienza di raccolta della luce Accessori specifici per misure di bio- e chemiluminescenza (es. dispensatore di reagenti) MISURE DI CL e BL LUMINOMETRI

165 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA MISURE DI CL e BL LUMINOGRAFI Imaging microscopico Imaging macroscopico

166 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA MISURE DI CL e BL analita prodotto eccitato (instabile) reagente (eccesso) prodotto finale (stabile) emissione Tempo Segnale misura

167 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA MISURE DI CL e BL enzima prodotto eccitato (instabile) substrato (eccesso) prodotto finale (stabile) emissione Tempo Segnale misura 1-5 minuti per HRP minuti per AP

168 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA CARATTERISTICHE ANALITICHE The enzyme kit produced by Boehringer and Mannheim allows the determination of D-glucose and D-fructose in food samples in three simple steps. Step 1: Primary Reaction 1 Hexokinase D-Glucose + ATP > G-6-P + ADP D-Fructose + ATP > F-6-P + ADP Step 2: Detection of D-Glucose G-6-P + G-6-P Dehydrogenase Gluconate-6-phosphate + NADP > NADPH + H + The production of NADPH is stoichiometric with the amount of glucose in sample. The determination of glucose content can be done by measuring the increase in absorbance of NADPH at 334, 340, or 365 nm. Step 3: Detection of D-Fructose Phosphoglucose isomerase F-6-P > G-6-P G-6-P reacts with NADP+ again and forms NADPH. The level of NADPH present can be detected by measuring the increase in absorbance at 334, 340, or 365 nm. The amount of NADPH is stoichiometric with the amount of fructose.

169 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA CARATTERISTICHE ANALITICHE Rapid Enzymatic Tests for Glucose Introduction: Reagent strips have been designed to perform rapid and semi-quantitative analysis for glucose. They are easy to use and require no addition laboratory equipment of reagents. Three reagent strips, Clinistix, Dextrostix and Diastix, will be used. The enzymatic reactions involved are as described below. Step 1: Glucose Glucose Oxidase Glucose > Gluconic Acid + H2O2 Step 2: Clinistix and Dextrostix: H2O2 + chromogen orthotolidine- Peroxidase H2O2 + chromogen orthotolidine > oxidized orhotolidine Diastix: H2O2 + Potassium iodide ---Peroxidase H2O2 + Potassium iodide > iodine complex The intensity of the color gives a semi-quantitative analysis of the level of glucose in the samples. Materials: Please refer to class notes and p b of the Laboratory Manual. Bottles of Reagent Strips Instead of blood and urine samples, Sample Solutions A, B, and C will be used Procedure: Clinistix: · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 10 seconds, compare to colour chart provided Dextrostix: · Add a drop of sample solution to the test strip · After exactly 60 seconds, wash with water for 2 second (water bottle) · Blot once gently · Compare to colour chart immediately Diastix: · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 30 seconds, compare to colour chart

170 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA

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