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ANALISI ENZIMATICA L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni: determinazione dell’ attività catalitica di enzimi determinazione.

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1 ANALISI ENZIMATICA L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni: determinazione dell’ attività catalitica di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze per mezzo di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze mediante reattivi marcati con enzimi

2 ENZIMI Gli enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica, con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze Svolgono una funzione di catalizzatori (biologici), cioè accelerano le reazioni chimiche o fanno avvenire reazioni che altrimenti non avrebbero luogo Sono caratterizzati da: altissima specificità elevato potere catalitico E + S ES E + P

3 ENZIMI Gli Enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze. Gli Enzimi sono catalizzatori biologici. Gli Enzimi non modificano l’equilibrio di una reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto. X G DG Y Reazione non catalizzata DG* DG* Reazione catalizzata

4 REVERSIBILITA’ DELLE REAZIONI ENZIMATICHE
L’enzima favorisce il raggiungimento dell’equilibrio, quindi catalizza anche la reazione inversa A <====> B Ma, se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione diventa praticamente irreversibile A -----> B <====> C Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene enzimatiche)

5 Gli Enzimi differiscono dai catalizzatori chimici per:
Le velocità delle reazioni catalizzate da enzimi sono generalmente da 106 a 1012 più veloci di quelle non catalizzate. Gli Enzimi catalizzano reazioni in condizioni relativamente blande, condizioni fisiologiche. Gli Enzimi spesso hanno un’elevata specificità verso substrati e prodotti. L’attività degli Enzimi può essere regolata da altri fattori oltre che da substrato e prodotti.

6 Enzimi (“nel lievito”): un po’ di storia...
1835: prima teoria della catalisi chimica (Jöns Jacob Berzelius, chimico svedese) 1836: estrazione dal succo gastrico della pepsina 1860: fermentazione causata da sostanze termolabili (Louis Pasteur, microbilogo francese) 1877: primo uso del termine enzima 1897: estrazione dal lievito degli enzimi che catalizzano la fermentazione alcoolica; fermentazione in assenza in assenza di (Eduard Buchner, tedesco, premio Nobel per la chimica) - enzimologia 1894: Fischer propose il modello “lock and key” per descrivere la specifictà enzimatica 1926: cristallizzazione dell’ureasi (James Sumner, chimico americano) 1930: cristallizzazione di pepsina, tripsina e chimotripsina: tutti gli enzimi sono proteine (John Howard Northrop, americano, premio Nobel per la chimica) 1960: teoria dell’allosterismo (François Jacob, Jacques Monod, francesi, premio Nobel per la Medicina , Jan Pierre Changeaux, genetista francese)

7 CARATTERISTICHE DEGLI ENZIMI
OTTIMIZZARE LA RESA: Svolgere solo le reazioni necessarie Impedire reazioni indesiderate (specificità di substrato) Portare a termine le reazioni in tempi brevi Indipendenza dall’ambiente (temperatura, pressione) Riutilizzo della stessa “macchina” per molte volte MINIMIZZARE GLI SPRECHI: Non produrre sottoprodotti (specificità di reazione) Minimizzare il dispendio energetico

8 STRUTTURA DEGLI ENZIMI
Alcuni enzimi sono delle oloproteine, costituiti solo da amminoacidi Altri enzimi sono eteroproteine: costituiti da una parte proteica (apoenzima) e parte non proteica (cofattori) ione metallico coenzima gruppo prostetico (legato covalentemente) OLOENZIMA APOENZIMA (Parte proteica)

9 Nicotinamide Adenina Dinucleotide (NAD+)
COFATTORI: COENZIMI Nicotinamide Adenina Dinucleotide (NAD+) Coenzima di deidrogenasi lattato + NAD+  piruvato + NADH + H+ Esiste una forma fosforilata NADP+

10 Adenosin trifosfato (ATP)
COFATTORI: COENZIMI Adenosin trifosfato (ATP) Coenzima delle chinasi Esempio: Glucosio + ATP  Glucosio-6-fosfato + AD

11 VITAMINE: precursori di coenzimi
COFATTORI VITAMINE: precursori di coenzimi

12 COFATTORI METALLICI: GRUPPI PROSTETICI:
Elementi alcalini (Na+ K+) Alcalino terrosi (Ca++, Mg++) Elementi bivalenti (Zn++, Mn ) GRUPPI PROSTETICI: FMN, FAD eme

13 Flavina adenina dinucleotide (FAD)
COFATTORI Flavina adenina dinucleotide (FAD) Coenzima di deidrogenasi Derivato da riboflavina (vit. B6) Trasferisce due protoni da/a substrati Esempio: Succinato + FAD  Fumarato + FADH2

14 SPECIFICITA’ DI SUBSTRATO
Una delle caratteristiche principali degli enzimi è la specificità verso il substrato Gli enzimi sono altamente specifici sia nel legare molecole chirali che nel catalizzare le loro reazioni.

15 NOMENCLATURA Ogni Enzima è identificato con un nome comune ed un nome sistematico Il nome sistematico consiste nel nome del substrato seguito dalla parola terminante in –asi che indica la reazione specifica Gli enzimi sono stati divisi in 6 classi in base alla chimica della reazione che catalizzano ossidoreduttasi transferasi idrolasi liasi isomerasi ligasi Recommended name is usually the trivial name and is easier to use.

16 Classificazione Internazionale Enzimi
Dalla Commissione Internazionale per la nomenclatura e la classificazione degli enzimi è stato adottato un sistema di identificazione che fa uso di un codice a 4 cifre: I cifra corrisponde alla classe dell’enzima II cifra corrisponde alla sottoclasse III cifra indica la sottoclasse di appartenenza dell’enzima IV cifra specifica ulteriormente l’enzima in rapporto al tipo di substrato che viene trasformato dall’enzima

17 Classificazione Internazionale Enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore 1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore 1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore 1.4 agisce sul gruppo CH-NH2 del donatore 1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore 1.6 agisce su NADH o NADPH. 1.7 agisce su altri composti azotati 1.8 agisce su gruppi solforati 1.9 agisce sui gruppi eme

18 Classificazione Internazionale Enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - trasferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 2.1 gruppi ad una unità di carbonio 2.2 gruppi chetonici o aldeidici 2.3 gruppi acilici 2.4 gruppi glicosidici 2.5 gruppi alchilici 2.6 gruppi azotati 2.7 gruppi fosforici 2.8 gruppi contenenti zolfo

19 Classificazione Internazionale Enzimi
1 - ossidoreduttasi: 2 - trasferasi 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 3.1 legami esterei: esterasi idrolasi esteri carbossilici idrolasi monoesteri fosforici 3.2 legami glicosidici: glicosidasi 3.3 altri legami 3.4 legami peptidici 3.5 legami C-N non peptidici 3.6 legami anidridici 3.7 legami C-C

20 Classificazione Internazionale Enzimi
1 - ossidoreduttasi 2 - trasferasi 3 - idrolasi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 4.1 legami C = C 4.2 legami C = O 4.3 legami C = N 4.4 legami C = S

21 Classificazione Internazionale Enzimi
1 - ossidoreduttasi 2 - trasferasi 3 - idrolasi 4 - liasi 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 5.1 racemasi 5.2 cis-trans isomerasi

22 Classificazione Internazionale Enzimi
1 - ossidoreduttasi 2 - transferasi 3 - idrolasi 4 - liasi 5 - isomerasi 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami (con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi) 6.1 legami C-O 6.2 legami C-S 6.3 legami C-N 6.4 legami C-C

23 NOMENCLATURA Esempi: ATP + Creatina < > creatina-fosfato + ADP ATP : Creatina fosfotrasferasi EC Alcool + NAD+ < > aldeide (o chetone) + NADH Alcool: NAD+ ossidoreduttasi EC

24 NOMENCLATURA

25 UNITÀ DI MISURA Un enzima può essere misurato in termini di concentrazione come qualunque altra proteina Da un punto di vista analitico interessa invece la misura dell’attività catalitica (o attività enzimatica) che si esprime in Unità Internazionali (U.I.) ed è definita come: Una unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in grado di catalizzare la trasformazione di una micromole di substrato in condizioni standardizzate. Si definisce inoltre costante catalitica o numero di turnover l’attività enzimatica per mole di enzima. Si definisce la specificità di un enzima l’attività enzimatica per mg di proteina (espressione di purezza di una preparazione).

26 CONCENTRAZIONE CATALITICA
Nel 1972 la commissione per la nomenclatura degli enzimi e la Federazione Nazionale di Chimica Clinica (IFCC) introducono l’unità katal (kat) che misura la velocità di reazione in mols-1 L’unità di misura fu aggiunta all’International System al “21th General Conference of Weights and Measures” nel 1999. Per un dato metodo analitico vale la relazione: 1 U = 1 mmol/min = 10-6 mol/min = nmol/s  nKat

27 G6125   Glucose  Oxidase Aspergillus niger   Type II 15,000-25,000 units/g solid (without added oxygen) Synonyms b-D-Glucose: oxygen 1-oxidoreductase GOx G.Od. CAS Number Enzyme Commission (EC) Number EG/EC Number EINECS MDL number MFCD Analysis Note Protein determined by Biuret method. Caution Some loss of activity may occur after more than 3 days at room temperature. This product may be shipped with or without dry ice. Linkage This preparation is formulated from Type VII, G 2133, by addition of potassium gluconate. Unit Definition One unit will oxidize 1.0µmole of b-D-glucose to D-gluconolactone and H2O2per min at pH 5.1 at 35° C, equivalent to an O2uptake of 22.4µl per min. If the reaction mixture is saturated with oxygen, the activity may increase by up to 100%. Properties storage temp. -20°C foreign activity Catalase£2 Sigma units/mg solid amylase, invertase and glycogenase, and maltase and galactose oxidase ~2 % References Merck Merck13, 4473 Safety Information Hazard Codes Xn Risk Statements 42 Safety Statements 22-45 RTECS RQ

28 P6782   Peroxidase horseradish   Type VI-A ~1000 units/mg solid (using ABTS)  units/mg solid (using pyrogallol) essentially salt-free, lyophilized powder Synonyms Horseradish peroxidase Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase CAS Number Enzyme Commission (EC) Number EG/EC Number MDL number MFCD Analysis Note This product is assayed using ABTS for easy comparison to other suppliers'unit: approx. 1,000 units per mg solid Linkage Similar to P8375 Packaging Packaged in mg solid Unit Definition One ABTS unit will oxidize 1µmole of ABTS per minute at 25°C at pH 5.0 Using 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) tablets (Prod. No. A 9941) as substrate, approx. four times the activity is observed. The RZ ( Reinheitszahl) is the absorbance ratio A403/A275determined at mg/ml in deionized water. It is a measure of hemin content, not enzymatic activity. Even preparations with high RZ may have low enzymatic activity. One unit will form 1.0 mg purpurogallin from pyrogallol in 20 sec at pH 6.0 at 20°C, unless otherwise indicated in the listing. This purpurogallin (20 sec) unit is equivalent to approx. 18µM units per min at 25°C. Description

29 Related Products Related Products
SubstrateA0156 N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol minimum 90 % SubstrateA1661 N-(6-Aminohexyl)-N-ethylisoluminol SubstrateA1888 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt ~ 98 % TLC SubstrateA Aminosalicylic acid ~ 99 % SubstrateA Aminoantipyrine Reagent Grade SubstrateA4685 Luminol sodium salt SubstrateA Amino-9-ethylcarbazole ~ 90 % SubstrateA Aminophthalhydrazide monohydrate SubstrateA8511 Luminol minimum 97 % HPLC SubstrateD5907 Dicarboxidine dihydrochloride SubstrateD9143 o-Dianisidine SubstrateG5502 Guaiacol SubstrateH (4-Hydroxyphenyl)propionic acid SubstrateP2923 Pyrogallol ACS Reagent InhibitorQ0125 Quercetin dihydrate minimum 98 % HPLC, Powder InhibitorS2002 Sodium azide Reagent Plus,>= 99.5 %

30 C5421   Cholesterol Oxidase from Cellulomonas sp.   buffered aqueous solution 20-60 units/mg protein (biuret) Synonyms Cholesterol: oxygen oxidoreductase CAS Number Enzyme Commission (EC) Number MDL number MFCD Unit Definition One unit will convert 1.0µmole of cholesterol to 4-cholesten-3-one per min at pH 7.5 at 25 °C. Note: 4-cholesten-3-one may undergo isomerization. Physical form Solution in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 storage temp. -20°C Literature Smith, A.G. and Brooks, C.J.W.,Biochem. Soc. Trans. 5, 1088 (1977) Identifiers Description Properties References

31   Glucose  Dehydrogenase Bacillus megaterium   BioChemika ~33 units/mg
49165 Identifiers Synonyms b-D-Glucose: NAD[P]+1-oxidoreductase CAS Number Enzyme Commission (EC) Number EG/EC Number MDL number MFCD Description Miscellaneous NADH-regenerating enzyme. Valine manufacture from ketoisovalerate Unit Definition 1 U corresponds to the amount of enzyme which will oxidize 1µmolb-D-glucose to D-glucono-d-lactone per minute at pH 7.6 and 25°C Properties mol wt Mr~120000 storage temp. -20°C References Literature A. Honorat-Pascal et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 236 (1990)

32 SITO ATTIVO SITO ATTIVO sito di legame sito catalitico lisozima

33 Sito catalitico: sito dove avviene la reazione
SITO ATTIVO Sito catalitico: sito dove avviene la reazione Sito di legame: - zona dove il substrato si lega il substrato si lega all’enzima con interazioni deboli - la forma è complementare al substrato - sono cavità o fenditure

34 PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA
Inizialmente si forma il complesso enzima (E)/substrato (S) Il complesso ES va verso lo stato di transizione Si forma un complesso tra enzima (E) e prodotto (P) E e P si separano Tutti questi passaggi sono equilibri

35 PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA

36 PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA
Formazione del complesso ES

37 PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA
Formazione dello stato di transizione ES*

38 PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA
Formazione del complesso EP

39 PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA
Formazione del prodotto P

40 CARATTERISTICHE DEL SITO ATTIVO
“Lock and key model” - proposto da Emil Fischer nel 1890 - solo il substrato con la forma appropriata si adatta al sito attivo “Induced-fit model” - proposto da Daniel Koshland nel 1958 - la forma del sito attivo cambia profondamente quando si lega il substrato

41 “Lock and key model” Esempio: proteasi

42 “Induced- fit model” Esempio: esochinasi

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44 ISOENZIMI Gli enzimi non hanno una struttura omogenea
Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano diverse proprietà molecolari (diversa carica elettrica, diversa solubilità, diversa resistenza ad agenti chimici e fisici) e/o diverse proprietà funzionali presentano differenze in termini di pH ottimale, affinità per substrato e coenzima….. Es. Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH: LDH1 4 subunità H LDH2 3 subunità H e da una M (H3M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone) LDH3 (H2M2) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) (fegato e muscoli scheletrici)

45 ENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONE
L’energia libera di attivazione DG è la quantità di energia necessaria per portare tutte le molecole di 1 mole di una sostanza, ad una data temperatura, allo stato di transizione Gli enzimi esercitano la loro attività catalitica abbassando l’energia libera di attivazione Di conseguenza, in presenza di enzima sarà maggiore la concentrazione della specie allo stato di transizione La velocità di reazione è proporzionale alla concentrazione della specie allo stato di transizione Quindi, gli enzimi esercitano la loro attività catalitica aumentando la velocità delle reazioni chimiche stato iniziale stato finale stato di transizione energia libera di attivazione della reazione in avanti (catalizzata) energia libera di attivazione della reazione in avanti (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione inversa (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione inversa (catalizzata) cambiamento totale di energia libera durante la reazione direzione della reazione energia libera

46 stabilizzano lo stato di transizione
CATALISI ENZIMATICA Gli enzimi: abbassano la barriera dell’energia di attivazione inserendo stati di transizione più bassi stabilizzano lo stato di transizione

47 ATTIVITÀ ENZIMATICA L’attività di un enzima viene misurata come velocità della reazione da esso catalizzata La velocità di reazione viene misurata in termini di quantità di substrato trasformato, o di prodotto che si forma, nell’unità di tempo La velocità delle reazioni chimiche è soggetta a leggi chimico-fisiche ben definite che consentono di ricavare delle equazioni della velocità diverse a seconda del tipo di reazione Queste equazioni mettono in relazione la velocità di reazione con la concentrazione dei reagenti

48 Cinetiche chimiche (AP)
Concentrazione di prodotto Tempo Vt Equilibrio V iniziale k=costante di velocità n=numero intero 1-3

49 MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA
La velocità di reazione viene misurata in termini di quantità di substrato trasformato, o di prodotto che si forma, nell’unità di tempo Entrambi gli approcci sono corretti, tuttavia è consigliabile misurare il prodotto che si forma perché è più “facile” misurare un piccolo incremento di concentrazione a partire da un valore 0, piuttosto che un piccolo decremento a partire da un valore elevato Per utilizzare la misura del prodotto bisogna conoscere la stechiometria della reazione, perchè la definizione di unità di attività enzimatica è riferita alla trasformazione di substrato Se il rapporto stechiometrico tra substrato e prodotto non è 1:1 bisogna tenerne conto

50 Cinetiche chimiche (AP)
Conc. di prodotto Tempo Conc. di substrato Tempo Tempo Velocità V iniziale V finale

51 CINETICA CHIMICA Le reazioni chimiche vengono classificate su base cinetica per mezzo dell’ordine di reazione L’ordine di reazione indica come la velocità di reazione dipende dalla concentrazione dei reagenti Reazioni di 1° ordine A P Reazioni di 2° ordine A + B P 2 A P Reazioni di ordine 0 La velocità di reazione non dipende dalla concentrazione dei reagenti

52 Effetto della concentrazione di A (A  P)
[prodotto] Tempo A1 [A] Velocità iniziale A4 > A3 > A2 > A1 A1 A4 A4 A3 A2 A3 A2

53 Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche
Il grafico velocità-concentrazione per una reazione enzimatica è un’iperbole rettangolare, descritta da un’equazione del tipo dove la velocità v e la concentrazione di substrato [s] sono le due variabili, mentre V e Km sono due costanti Velocità iniziale [A] Cinetica enzimatica Cinetica chimica

54 VELOCITÀ MASSIMA (Vmax)
La costante V rappresenta la velocità massima (Vmax) o limitante della reazione e si raggiunge ad alte concentrazioni di substrato All’aumentare di [s], la velocità aumenta e tende asintoticamente al valore massimo, che non può essere superato indipendentemente dall’aumento di [s], perché ad alte concentrazioni di s l’enzima è saturato In queste condizioni la velocità di reazione non dipende da [s] ed è quindi di ordine 0 k k2 E + S ES E + P k-1 [substrato] velocità Vmax ½ Vmax Km Ad elevata [s] lo stadio limitante della reazione è la conversione del complesso attivato ES a prodotto P + E Vmax rappresenta la velocità a [s] infinita, quindi è la velocità dello stadio limitante Di conseguenza, Vmax rappresenta una misura diretta dell’abilità dell’enzima di convertire il substrato in prodotto, cioè della attività enzimatica

55 COSTANTE DI MICHAELIS (Km)
La costante di Michaelis (Km) è definita come la concentrazione di substrato alla quale la velocità di reazione è uguale alla metà della velocità massima (1/2 Vmax) Substrato, enzima e complesso enzima-substrato si trovano in uno stato di equilibrio. Ad alte concentrazioni di substrato l’equilibrio è tutto spostato verso destra, quindi l’enzima è saturato e la velocità raggiunge il valore massimo. Nel punto in cui metà delle molecole di enzima sono saturate la velocità sarà metà della Vmax k k2 E + S ES E + P k-1 La posizione dell’equilibrio dipende anche dalla forza dei legami tra substrato ed enzima. Più essi sono deboli, più alta è la concentrazione di substrato necessaria per avere il 50% di saturazione dell’enzima, quindi più alto sarà il valore di Km Km è una espressione della affinità dell’enzima per il substrato: basso valore di Km alta affinità alto valore di Km bassa affinità [substrato] velocità Vmax ½ Vmax Km

56 E’ una concentrazione (dimensioni moli/litro)
Ipotesi v0=Vmax/2 KM = [S] quando v0=Vmax/2 E’ una concentrazione (dimensioni moli/litro) E’ indipendente da [E]

57 Trasformazione di Lineweaver-Burk
X Y

58 Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
1/Vmax 1/[S] 1/v0 1/KM

59 Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
Grafico di Lineweaver-Burk V0 1/V0 Vmax Vmax/2 1/Vmax KM [S] 1/KM 1/[S]

60 EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
L’equazione vista in precedenza, che descrive la relazione velocità-concentrazione di substrato in una reazione enzimatica, è l’equazione di Michaelis-Menten Come già detto, Vmax è la velocità dello stadio limitante della reazione enzimatica ad alte concentrazioni di substrato, quindi Vmax = k2[ES] Ad alte concentrazioni di substrato l’enzima è saturato, perciò [ES] = [E], da cui Vmax = k2[E] L’equazione può essere scritta in una forma diversa che evidenzia la dipendenza della velocità, oltre che dalla concentrazione di substrato, dalla concentrazione di enzima k k2 E + S ES E + P k-1

61 Velocità della reazione
CINETICA ENZIMATICA Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni: Regione 1 1 2 3 Velocità della reazione 1° ordine > La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato

62 Velocità della reazione
CINETICA ENZIMATICA Regione 2 Regione non utile dal punto di vista analitico intermedie ordine misto v 1 2 3 Velocità della reazione Regione 3 << ordine 0 Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica

63 EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
> Velocità della reazione [s] In condizioni di eccesso di substrato la velocità delle reazioni enzimatiche dipende solo dalla concentrazione di enzima La Vmax sarà proporzionale alla concentrazione di E, quindi sarà una misura di attività enzimatica

64 VELOCITÀ INIZIALE Una reazione enzimatica è un processo cinetico, perciò un parametro importante nella misura di attività enzimatica è il tempo La velocità è definita come variazione di concentrazione del prodotto nel tempo Quindi, la velocità è data dalla pendenza di questa curva tempo [P] 1 2 La pendenza della curva (velocità) varia nel tempo La misura di velocità deve essere effettuata ad un tempo ben preciso, nell’intervallo in cui si osserva una relazione lineare tra [P] e tempo, quindi nelle fasi iniziali della reazione tempo velocità La misura di attivita’ enzimatica e’ una misura di velocita’ iniziale della reazione La velocità iniziale si indica con v0 oppure vi

65 APPROCCIO ALTERNATIVO ALLA MISURA DI VELOCITÀ INIZIALE
Teoricamente sarebbe possibile misurare l’attività enzimatica anche nella fase di plateau, quando la velocità di reazione è nulla Bisognerebbe misurare il tempo necessario per raggiungere il plateau tempo [P] Maggiore è l’attività enzimatica, minore sarà il tempo necessario per raggiungerlo Inconvenienti: difficoltà di effettuare una misura accurata del tempo (elevato errore sulla misura) tempi lunghi di esecuzione del metodo, in particolare per la misura di attività enzimatiche basse

66 VELOCITÀ INIZIALE La misura della velocità iniziale della reazione enzimatica assicura che: si sta misurando la velocità massima Vmax l’enzima è in buone condizioni, cioè non è ancora andato incontro a possibili fenomeni di denaturazione non si sono ancora verificati eventuali fenomeni di inibizione da prodotto è possibile distinguere tra attività enzimatiche diverse (procedendo nel tempo campioni con attività enzimatiche diverse consumerebbero tutto il substrato, anche se in tempi diversi, quindi produrrebbero la stessa quantità di prodotto e la stessa intensità di segnale, come nel caso dell’accumulo di un prodotto colorato della reazione) il metodo analitico è rapido

67 ASPETTI PRATICI DELLA MISURA DI VELOCITÀ INIZIALE
In linea teorica bisognerebbe seguire la cinetica della reazione per un certo tempo, poi tracciare la tangente alla curva al tempo 0 (per essere certi di misurare la velocità iniziale) e calcolare la pendenza della tangente, che rappresenta la velocità iniziale della reazione Questo approccio è dispendioso in termini di tempo Dal punto di vista del disegno sperimentale la principale variabile è il numero di misure da effettuare per determinare l’attività enzimatica Metodi ad un punto, a due punti, multipunto

68 METODI AD UN PUNTO Si effettua una sola misura di segnale (ad es. assorbanza) ad un tempo prestabilito dopo l’inizio della reazione Si risale all’attività enzimatica tramite una curva di calibrazione o un fattore di conversione Affinchè la misura sia accurata: il segnale al tempo 0 deve essere 0 oppure, se diverso da 0, deve essere costante e bisogna misurarlo (bianco della reazione) per poi sottrarlo ci deve essere linearità di risposta dal tempo 0 al tempo x al quale viene eseguita la misura tempo segnale tx Sx La condizione di linearità si verifica se la misura viene effettuata il prima possibile dopo l’inizio della reazione In questo caso si misura una piccola variazione di segnale, che sarà accompagnata da un maggiore errore relativo

69 Linearità di risposta METODI AD UN PUNTO
La linearità della risposta nel tempo tra l’inizio della reazione ed il tempo di misura non è ovvia In condizioni ideali c’è linearità per un tempo relativamente lungo In pratica la cinetica può essere diversa Inibizione da prodotto Teorica Insufficienza di substrato Reazione autocatalizzante tempo segnale N.B. La scala dei tempi è dilatata per evidenziare ciò che accade nei primi istanti della reazione

70 Approccio tecnico METODI AD UN PUNTO
Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi ad un punto Metodi manuali e metodi automatizzati basati su analizzatori automatici discreti Per effettuare la misura ad un tempo prestabilito la reazione enzimatica viene bloccata (variazione di pH o temperatura, aggiunta di un inibitore) Metodi automatizzati basati su analizzatori automatici a flusso continuo Campione e reagenti fluiscono attraverso un sistema di tubi mentre avviene la reazione e passano di fronte o attraverso il sistema di rivelazione Il tempo al quale raggiungono il rivelatore viene definito regolando il flusso e la posizione del rivelatore lungo il sistema

71 METODI A DUE PUNTI Si effettuano due misure di segnale (ad es. assorbanza) a due tempi prestabiliti dopo l’inizio della reazione Si potrebbero anche misurare i tempi necessari per raggiungere due valori prestabiliti di segnale, ma sarebbe più difficile automatizzare il sistema Affinchè la misura sia accurata: ci deve essere linearità di risposta tra i due tempi t1 e t2 ai quali viene eseguita la misura tempo segnale t1 S1 t2 S2 Questi metodi presentano il vantaggio di non richiedere la misura del bianco della reazione perché l’attività enzimatica viene calcolata come DS / Dt

72 Linearità di risposta METODI A DUE PUNTI
Affinchè sia realizzata la condizione di linearità 2° punto la linearità deve mantenersi per un tempo relativamente lungo 1° punto bisogna sapere se c’è un ritardo nel raggiungimento della linearità dovuto, ad esempio, ad interferenti della matrice biologica o se c’è una falsa velocità iniziale elevata dovuta a componenti del campione che autocatalizzano la reazione Nel caso di attività enzimatiche elevate per aumentare l’intervallo di linearità si diluisce il campione Ciò potrebbe creare problemi perché molti enzimi sono più stabili quando ad alta concentrazione

73 Approccio tecnico METODI A DUE PUNTI
Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi a due punti Metodi automatizzati basati su analizzatori automatici discreti Ovviamente non si può bloccare la reazione al primo tempo di misura A tempi prestabiliti vengono prelevate due aliquote di miscela di reazione in cui la reazione viene bloccata e si misura il segnale Metodi automatizzati basati su analizzatori automatici a flusso continuo La miscela di reazione fluisce attraverso due rivelatori posti ad una certa distanza fissa Il flusso deve essere regolato accuratamente perché da esso dipendono i tempi ai quali vengono effettuate le misure

74 DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI
Gli enzimi non sono l’oggetto dell’analisi, ma vengono utilizzati come “strumenti” analitici per determinare la concentrazione degli analiti di interesse Vantaggi L’elevata specificità degli enzimi per i loro substrati consente spesso l’analisi diretta dei campioni biologici, senza o con poche e semplici fasi di estrazione e purificazione L’elevato potere catalitico degli enzimi fa sì che i metodi enzimatici siano caratterizzati da bassi limiti di rivelazione, il che rende sufficienti volumi molto piccoli di campione Maggiore rapidità Maggiore accuratezza Risparmio di reagenti Prelievo di piccoli volumi di fluidi biologici

75 DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI
Per la determinazione quantitativa di numerosi analiti sono disponibili diversi metodi I metodi enzimatici sono entrati nella routine di molti laboratori per la loro efficienza, rapidità, costi relativamente bassi e possibilità di automazione Metaboliti quali glucosio, colesterolo, trigliceridi, etanolo, urea, acido urico e molti altri vengono comunemente determinati per via enzimatica Per effettuare un’analisi quantitativa, cioè per risalire dalla concentrazione del prodotto misurato alla concentrazione dell’analita, è necessario che tutto il substrato (analita) venga trasformato in prodotto Perciò questi metodi enzimatici vengono detti a punto finale È inoltre necessario conoscere il rapporto molare tra substrato e prodotto

76 Velocità della reazione
CINETICA ENZIMATICA Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni: Regione 1 1 2 3 Velocità della reazione 1° ordine > La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato

77 METODI A PUNTO FINALE SEMPLICI
È sufficiente una sola reazione enzimatica per la determinazione della concentrazione dell’analita di interesse S Eind. P Condizioni sperimentali Enzima indicatore in eccesso pH e Temperatura ottimali Queste condizioni non sono sufficienti per garantire che il substrato venga consumato completamente

78 METODI A PUNTO FINALE SEMPLICI
Esempio: acido lattico Acido lattico + NAD Acido piruvico + NADH + H+ LDH Per spostare la reazione dall’equilibrio e spostarla verso destra è necessario rimuovere i prodotti di reazione man mano che si formano Accoppiamento con una seconda reazione enzimatica Aggiunta di un reagente chimico che si leghi ai prodotti di reazione Nell’esempio riportato si può usare idrazina, che si lega al piruvato e lo rimuove Nei metodi a punto finale semplice l’eventuale accoppiamento con un’altra reazione enzimatica ha il solo scopo di rimuovere i prodotti

79 METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI
È necessario accoppiare alla prima reazione enzimatica una o più reazioni enzimatiche per la determinazione della concentrazione dell’analita di interesse S Eaus. P1 Eind. P2 Condizioni sperimentali Enzimi indicatore ed ausiliario in eccesso pH e Temperatura ottimali La reazione indicatrice svolge anche la funzione di rimuovere continuamente i prodotti di reazione man mano che si formano, garantendo lo spostamento verso destra della reazione ed il consumo completo del substrato

80 METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI
Esempio: fosfolipidi Fosfolipasi D Fosfatidilcolina Acido fosfatidico + Colina Colina Betaina + H2O2 Colina ossidasi 2H2O2 + Cromogeno Prodotto colorato + 2H2O + O2 Perossidasi OPPURE 2H2O2 + Luminolo Ione aminoftalato + 2H2O + O2 + hn Perossidasi

81 ASPETTI QUANTITATIVI La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata mediante: interpolazione del valore di segnale su una curva di calibrazione costruita con degli standard a concentrazione nota di analita confronto con un’unico standard, quando si presuppone linearità di risposta su un certo intervallo, attraverso la relazione derivante dalla legge di Lambert-Beer Quando non si dispone di uno standard puro, la concentrazione dell’analita viene ricavata mediante il coefficiente di estinzione molare e del prodotto colorato, sfruttando la legge di Lambert-Beer

82 ASPETTI QUANTITATIVI La concentrazione dell’analita viene determinata nella miscela di reazione, non nel campione di partenza Perciò bisogna tenere conto del volume V della miscela di reazione e del volume v del campione: Gli analizzatori automatici vengono programmati in modo da applicare funzioni che tengono conto di questi fattori

83 ENZIMI IMMOBILIZZATI Nel caso della determinazione della concentrazione di analiti mediante enzimi, gli enzimi possono essere immobilizzati su supporti insolubili quali cellulosa, polipeptidi, polimeri sintetici Vantaggi Possibilità di recuperare e riutilizzare gli enzimi al termine della reazione (riduzione dei costi) Stabilità (risultati molto accurati e riproducibili) Possibilità di automazione, ad esempio immobilizzando gli enzimi su gel di poliacrilammide e formando con esso delle colonne Riproduzione più fedele della situazione che si verifica nelle cellule, specialmente per quegli enzimi che sono fissati su organuli cellulari

84 ENZIMI IMMOBILIZZATI “Carrier binding” Cross-linking Entrapment

85 ENZIMI IMMOBILIZZATI SU ELETTRODI
Gli enzimi possono essere immobilizzati su un elettrodo specifico per il composto che viene modificato o prodotto nel corso della reazione enzimatica, ottenendo così un biosensore enzimatico CO(NH2)2 + 2H2O + H NH4+ + HCO3- Ureasi Esempio Un elettrodo specifico per gli ioni ammonio viene rivestito con un gel impregnato di ureasi L’urea permea il gel dove viene idrolizzata dall’enzima formando ioni ammonio In alternativa, un normale elettrodo per pH viene rivestito con un gel impregnato di ureasi e si misura il cambiamento di pH conseguente all’idrolisi enzimatica dell’urea

86 REGOLAZIONE DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA
L’organismo è in grado di regolare l’attività catalitica dei suoi enzimi controllando la quantità di enzima nella cellula mediante regolazione dell’espressione genica delle proteine per la sintesi degli enzimi e per la degradazione degli enzimi controllando l’attività enzimatica mediante: - controllo diretto dell’attività enzimatica mediante l’uso di inibitori e attivatori che spesso causano modifiche strutturali all’enzima influenzando l’abilità del substrato di legarsi all’enzima - controllo mediante modifica reversibile covalente dell’enzima

87 REGOLAZIONE DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA
Temperatura, pH, concentrazione substrato, concentrazione enzima Processi biologici di regolazione: - Inibitori - “Endpoint inibition” - “Feedback inibition” - Allosterismo - Regolazione proteolitica

88 EFFETTO DEL pH

89 Il profilo a campana è il più comune
EFFETTO DEL pH 6 8 10 tripsina colinesterasi 4 papaina 2 pepsina pH attività enzimatica relativa Il profilo a campana è il più comune

90 EFFETTO DELLA TEMPERATURA
Aumento dovuto alla temperatura ( ogni 10°C) 10 20 30 40 50 Attività Temperatura Diminuzione dovuta alla denaturazione della proteina Risultato Per ogni enzima, esiste una temperatura ottimale La temperatura ottimale può non corrispondere con la temperatura in cui si trova l’enzima (37°C)

91 INIBITORI ENZIMATICI Informazioni sul percorso metabolico
Diverse sostanze possono inibire l’attività enzimatica: Analoghi del substrato, Tossine, Farmaci, Complessi di metalli Informazioni sul percorso metabolico Informazioni su come tossine o farmaci esercitano il loro effetto Migliore comprensione del meccanismo di catalisi enzimatica

92 Inibitori irreversibili inibitore reversibili
INIBITORI ENZIMATICI Due grandi classi di inibitori sono stati individuati in base all’entità dell’interazione: Inibitori irreversibili formano legami covalenti o forti non covalenti. Il sito di attacco è un gruppo amminoacidico che partecipa alla normale reazione enzimatica inibitore reversibili Formano legami deboli, non covalenti. L’enzima è Inattivo solamente quando l’inibitore è presente Gli inibitori si dividono poi in: competitivo, non competitivo, acompetitivo

93 Inibitori competitivi Inibitori non competitivi
INIBITORI ENZIMATICI Inibitori competitivi Sono analoghi al substrato con cui competono per il legame al sito attivo Inibitori non competitivi Si legano ad un sito diverso dal sito attivo causando l’inattivazione dell’enzima

94 INIBIZIONE COMPETITIVA
[S] v0 1/[S] 1/v0 Vmax  inibitore  inibitore  KM Vmax/2  1/KM 1/Vmax

95 INIBIZIONE COMPETITIVA
Substrati suicidi o antimetaboliti, prevengono la reazione col substrato e/o disattivano l’enzima Penicillina inibisce transpeptidasi che stabilizza le membrane batteriche

96 INIBIZIONE NON COMPETITIVA
[S] v0 1/[S] 1/v0  inibitore  inibitore Vmax  1/Vmax KM Vmax/2 1/KM

97 INIBIZIONE NON COMPETITIVA
Degradazione proteica (temperatura, estremi di pH) Molti veleni e composti mercuriali (reagiscono con -SH dei residui di Cys)

98 INIBIZIONE NON COMPETITIVA
Diisopropil fluorofosfato (Sarin), gas nervino, inibisce gli enzimi contenenti Ser (acetilcolinesterasi)

99 INIBIZIONE ENZIMATICA Inibitori acompetitivi

100 INIBIZIONE ACOMPETITIVA
1/KM Vmax [S] KM 1/[S] 1/V0 1/Vmax V0 + inibitore + inibitore

101 INIBITORI/ATTIVATORI ENZIMATICI
Endproduct inibition Feedback inibition In questo caso P è l’attivatore della molecola enzimatica

102

103 REGOLAZIONE ALLOSTERICA
Enzimi che regolano la tappa più lenta dell’intero processo enzimatico sono a loro volta regolati da un effettore=molecola o cofattore Processi (positivi e negativi) reversibili Esempio di allosterismo positivo

104 REGOLAZIONE ALLOSTERICA
Esochinasi (HK) Glucosio + ATP  glucosio-6-fosfato + ADP Quando HK lega glucosio, l’affinità per ATP aumenta Quando HK lega ATP, l’affinità per glucosio aumenta

105 REGOLAZIONE PROTEOLITICA
Con la regolazione proteolitica un enzima inattivo viene convertito irreversibilmente nella sua forma attiva. Alcuni enzimi vengono sintetizzati come zimogeni (enzima inattivo) e attivati per rottura di uno o più legami peptidici specifici

106 proinsulina  insulina

107 Chimotripsinogeno  chimotripsina

108 Attivazione degli zimogeni pancreatici mediante taglio proteolitico

109 Esempio: ACETILCOLINESTERASI

110 Esempio: FIBRINA

111 Esempio: FIBRINA

112 Esempio: FIBRINA

113 Esempio: FIBRINA

114 Esempio: FIBRINA

115 Esempio: FIBRINA

116 Esempio: PEROSSIDASI

117 Esempio: PEROSSIDASI

118 Esempio: PEROSSIDASI

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127 METODI DI MISURA La possibilità di “vedere” una reazione enzimatica è legata al fatto che i substrati e i prodotti hanno proprietà chimico-fisiche diverse Tali proprietà devono poter essere misurabili I metodi di rivelazione più comuni in enzimologia sono: spettrofotometrici spettrofluorimetrici

128 Determinazione spettrofotometrica
monocromatore (filtro, prisma, reticolo) luce monocromatica luce bianca cuvette o tubo contenente la coltura fotocellula (luce trasmessa: T% o A) fonte luminosa (lampada al tungsteno) fotocellula (luce diffusa: NTU) La lampada emette luce con intensità I0. A causa della diffusione, della rifrazione e dell’assorbimento arriva alla fotocellula per luce trasmessa un’intensità I. I/I0 è la trasmittanza (0-100%). L’assorbanza è log(I/I0) e varia in genere fra 0 e 3. Per un intervallo limitato (0-0,6) esiste una relazione lineare fra assorbanza e numero di cellule o biomassa. Metodi spettrofotometrici: la relazione fra biomassa e OD o%T è lineare in un intervallo limitato. Metodi chimici: sono rapidi e sensibili ma il rapporto fra un dato componente e la biomassa non è costante.

129 METODI SPETTROFOTOMETRICI
Misura diretta Misura mediante derivati chimici Misura mediante derivati generati enzimaticamente

130 METODI SPETTROFOTOMETRICI- MISURA DIRETTA
Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nel Vis (metodi colorimetrici) Esempio: fosfatasi alcalina rivelata mediante il substrato cromogenico p-nitrofenilfosfato, idrolizzato enzimaticamente a p-nitrofenolo che in ambiente basico assorbe a 405 nm (giallo)

131 METODI SPETTROFOTOMETRICI- MISURA DIRETTA
Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nell’UV (gruppi ciclici e doppi legami) Esempio: uricasi rivelata mediante l’assorbimento a 293 nm dell’acido urico che viene trasformato dall’enzima in allantoina 1. Misura di assorbanza a 290 nm: assorbono altri costituenti 2. Aggiunta di uricasi: decomposizione del solo acido urico uricasi 3. L’allantoina non assorbe a 290 nm quindi la concentrazione dell’acido urico si ottiene per differenza

132 METODI SPETTROFOTOMETRICI- MISURA DIRETTA
N + R H 2 O .. + H+ + 2e- + H+ NAD NADH 260 340 L’attività enzimatica delle ossidoreduttasi che utilizzano (consumano o producono) NAD(P)H come cofattore può essere determinata direttamente perché il NAD(P)H ha un massimo di assorbimento caratteristico a 340 nm che non si trova nel cofattore in forma ossidata NAD(P)+ Il NAD(P)H può essere misurato anche in fluorescenza, con un massimo di eccitazione a 340 nm ed un massimo di emissione a 460 nm Vantaggi: più basso limite di rivelazione teorico Svantaggi: interferenze della matrice che producono un alto segnale di fondo

133 METODI SPETTROFOTOMETRICI - UV/Vis
Inconvenienti della misura di assorbimento nell’UV: lampada a idrogeno per generare l nm cuvette di quarzo costose proteine ed acidi nucleici nel campione che assorbono nell’UV

134 METODI SPETTROFOTOMETRICI - DERIVATI CHIMICI
Misura mediante derivati chimici Sali di tetrazolio Composti cromogenici che vengono ridotti a formazani caratterizzati da valori elevati del coefficiente di assorbività molare e N R3C NR2 N+R1 Cl- CR3 R2N + N N+ Rx Ry 2Cl- Sale monotetrazolico Sale ditetrazolico R = gruppi aromatici

135 METODI SPETTROFOTOMETRICI - DERIVATI CHIMICI
Misura mediante derivati chimici Sali di tetrazolio Esempio: alcol deidrogenasi Etanolo Acetaldeide NAD+ NADH + H+ PMS PMSH Prodotto di riduzione (formazano) Sale di tetrazolio PMS = fenazina metasolfato Alcol deidrogenasi Il valore di e dei formazani è 2-4 volte più alto di quello del NAD(P)H, perciò si ottengono limiti di rivelazione 2-3 volte più bassi (A = ebc)

136 METODI SPETTROFOTOMETRICI - DERIVATI ENZIMATICAMENTE
Misura mediante derivati generati enzimaticamente Accoppiamento con ossidoreduttasi X + NAD(P)H + H XH2 + NAD(P)+ YH2 + NAD(P) Y + NAD(P)H + H+ Esempio: alanina aminotrasferasi (ALT) mediante lattato deidrogenasi (LDH) 2-Oxoglutarato Glutammato Alanina Piruvato Lattato NADH + H+ NAD+ ALT LDH

137 METODI SPETTROFOTOMETRICI - DERIVATI ENZIMATICAMENTE
Misura mediante derivati generati enzimaticamente Accoppiamento con perossidasi Esempio: glucosio ossidasi Glucosio Acido gluconico H2O + O2 H2O2 Accettore cromogenico o luminogenico Prodotto colorato o fotoni Glucosio ossidasi Perossidasi

138 METODI SPETTROFOTOMETRICI - DERIVATI ENZIMATICAMENTE
Misura mediante derivati generati enzimaticamente Accoppiamento con perossidasi Esempio: fosfolipasi Fosfatidilcolina + 2H2O Acido fosfatidico + Colina Fosfolipasi Colina + 2O Betaina + 2H2O2 Colina ossidasi 2H2O2 + Accettore Prodotto colorato + 2H2O + O2 Perossidasi

139 METODI NON SPETTROSCOPICI
Misure conduttimetriche CO(NH2)2 + H2O NH4+ + CO32- Ureasi Esempio Utilizzo di elettrodo specifico per NH4+ Misure polarografiche glucosio + O acido gluconico + H2O2 Glucosio ossidasi Esempio Utilizzo di elettrodo selettivo per O2 È disponibile un analizzatore automatico commerciale per la determinazione del glucosio basato su questo principio

140 METODI NON SPETTROSCOPICI
Misure potenziometriche Esempio triacilgliceroli + H2O diacilgliceroli + monoacilgliceroli + ac. grassi- + H+ Lipasi Utilizzo di elettrodo per H+ (misura di pH) Misure microcalorimetriche Utilizzo di un termistore che consente di misurare le microvariazioni di calore che accompagnano le reazioni enzimatiche

141 MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA
Reazioni enzimatiche semplici S E P Condizioni sperimentali Substrato ed eventuali Cofattori in eccesso pH e Temperatura controllati rigorosamente Attenzione alla inibizione da substrato

142 MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA
Reazioni enzimatiche accoppiate S Eprim. P1 Eind. P2 S Eprim. P1 Eind. P3 Eaus. P2 Condizioni sperimentali Substrato, eventuali Cofattori ed Enzimi indicatori ed ausiliari in eccesso pH e Temperatura controllati rigorosamente

143 MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA
Reazioni enzimatiche accoppiate S Eprim. P1 Eind. P2 k1 k2 S Eprim. P1 Eind. P3 Eaus. P2 La reazione primaria deve essere l’unico fattore limitante Le reazioni indicatrici ed ausiliarie devono essere molto più veloci della reazione primaria, perché se P1 non viene rimosso rapidamente può spostare il primo equilibrio verso sinistra e ritardare la reazione primaria può seguire una via metabolica diversa Per misure di almeno il 96% dell’attività enzimatica primaria k2 / k1 ≥ 100

144 PRINCIPI DI RIVELAZIONE
Oltre ai principi di rivelazione convenzionali quali: spettrofotometria spettrofluorimetria un altro principio di rivelazione si è affermato, in particolare nel settore dei metodi immunoenzimatici (utilizzo di reattivi marcati con enzimi): Chemiluminescenza Bioluminescenza

145 BIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZA
La luminescenza è l’emissione di radiazione elettromagnetica nell’UV, visibile o IR da parte di atomi o molecole come risultato della transizione da uno stato elettronicamente eccitato ad un livello energetico più basso, solitamente lo stato fondamentale La chemiluminescenza (CL) è un fenomeno di luminescenza in cui l’energia per generare lo stato elettronicamente eccitato deriva da una reazione chimica La bioluminescenza (BL) è un fenomeno di chemiluminescenza nel visibile che si verifica in organismi viventi

146 SISTEMI CHEMILUMINESCENTI
Sono stati definiti due tipi principali di reazioni CL: dirette ed indirette Le reazioni indirette sono dette CL a trasferimento di energia Prodotto + [Accettore]* Substrato CL [Prodotto]* Prodotto + hn Accettore + hn + Accettore Diretta Indiretta

147 SISTEMI CHEMILUMINESCENTI
Reaz A: emissione costante Reaz B: rapido decadimento FBL/CL = n. fotoni emessi n. molecole reagenti Efficienza quantica Per reazioni CL: F  0.1 Per reazioni BL: F = (0.1  0.9)

148 SISTEMI CHEMILUMINESCENTI
Luminolo/H2O2/Perossidasi luminolo N H 2 O , - C O- + hn perossidasi aminoftalato

149 SISTEMI CHEMILUMINESCENTI
Luminolo/H2O2/Perossidasi/Enhancer Conventional chemiluminescence Enhanced chemiluminescence (luminol) compound I peroxidase (endoperoxide) compound II LIGHT (excited state of 3-aminoftalate- dianion) Two possible sites of peroxidase amplification induced by the enhancers (superoxide radical) Relative photons/sec/pixel 15 30 Time (min) enhanced conventional

150 SISTEMI CHEMILUMINESCENTI
1,2-Diossietani-fenil-fosfato/Fosfatasi alcalina HPO42- O + - C H 3 * F h n OPO32- A M P D fosfatasi alcalina

151 SISTEMI CHEMILUMINESCENTI
1,2-Diossietani-fenil-b-D-galattopiranoside/b-Galattosidasi O C H 3 o - h n + b -galattosidasi *

152 SISTEMI BIOLUMINESCENTI
Luciferina/luciferasi da lucciola, in particolare da Photinus pyralis (lucciola nord-americana) L’efficienza quantica F di questa reazione è vicina a 1 luciferina + ATP + O ossiluciferina + CO2 + AMP + P~P + luce luciferasi Mg2+ + A M P luce N S H O C T 2 , g luciferina pirofosfato FBL/CL = n. fotoni emessi n. molecole reagenti

153 SISTEMI BIOLUMINESCENTI
Luciferina/luciferasi da diverse specie di batteri marini quali Vibrio fischeri, V. harvei, Photobacterium phosphoreum Il sistema batterico luciferina/luciferasi in vivo è accoppiato ad una ossidoreduttasi che produce FMNH2 NAD(P)H + H+ + FMN NAD(P)+ + FMNH2 FMNH2 + R-CHO + O FMN + R-COOH + H2O + luce ossidoreduttasi luciferasi C H 3 ( 2 ) 1 O + F M N luciferina batterica luciferasi batterica luce O 2

154 ASPETTI QUANTITATIVI La maggior parte delle reazioni BL e CL coinvolge enzimi In presenza di un eccesso di substrato l’intensità del segnale luminoso è proporzionale all’attività enzimatica Al contrario, in presenza di un eccesso di enzima l’intensità dell’emissione luminosa è proporzionale alla concentrazione di substrato La bio- e chemiluminescenza rappresentano quindi un principio di rivelazione adatto all’analisi quantitativa

155 APPLICAZIONI ANALITICHE
Luminolo/H2O2/Perossidasi Determinazione dell’attività della perossidasi endogena in fluidi biologici, omogenati di tessuto, latte, singole cellule, sezioni di tessuto Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono ossidasi ed il sistema H2O2/H2O

156 APPLICAZIONI ANALITICHE
Luminolo/H2O2/Perossidasi colesterolo ossidasi colesterolo H2O2 perossidasi luminolo aminoftalato + N2 + H2O + hn H2O2/OH- fosfolipasi D colina ossidasi fosfolipidi colina H2O2

157 CL from HRBC: Heme-catalyzed CL
luminol N H 2 O , - Heme C OH + light 3-aminophthalate + light excited 3-aminophthalate intermediate products H 2 O Heme 2 H O HRBC luminol Heme-catalyzed oxidation of luminol

158 APPLICAZIONI ANALITICHE
Luciferina/Luciferasi da lucciola Determinazione della concentrazione di ATP ed altri nucleotidi adeninici in campioni biologici Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono chinasi e la formazione o degradazione di ATP

159 APPLICAZIONI ANALITICHE
Luciferina/Luciferasi da lucciola Le seguenti reazioni enzimatiche accoppiate vengono utilizzate, in diverse condizioni analitiche, per determinare la creatinina o la creatina chinasi nel sangue creatinina creatina creatina + ATP creatina-fosfato + ADP ATP + luciferina + O AMP + P~P + CO2 + ossiluciferina + hn creatinina ammide idrolasi creatina chinasi luciferasi Mg++ Tutte le chinasi, che producono o consumano ATP, possono essere accoppiate al sistema luciferina/luciferasi da lucciola

160 APPLICAZIONI ANALITICHE
Luciferina/Luciferasi batterica Determinazione della concentrazione di NADH e NADPH, con maggiore sensibilità per il NADH (fmoli) Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono deidrogenasi e la formazione o degradazione di NAD(P)H

161 APPLICAZIONI ANALITICHE
Luciferina/Luciferasi batterica Le seguenti reazioni enzimatiche accoppiate vengono utilizzate per determinare gli acidi biliari nel sangue o nella bile R-OH + NAD R=O + NADH NADH + H+ + FMN NAD+ + FMNH2 FMNH2 + R-CHO + O FMN + R-COOH + H2O + hn 7a-idrossisteroide-deidrogenasi ossidoreduttasi luciferasi Tutte le ossidoreduttasi, che producono o consumano FMNH2, e le deidrogenasi ad esse accoppiate possono essere accoppiate al sistema luciferina/luciferasi da lucciola

162 CARATTERISTICHE ANALITICHE
Rivelabilità superiore a quella delle reazioni colorimetriche e comparabile a quella dei radioisotopi Alta specificità Ampio intervallo dinamico Rapidità di risposta Costi ridotti e minori rischi rispetto all’uso di marcatori radioattivi

163 Non è richiesta la sorgente di eccitazione
MISURE DI CL e BL LUMINOMETRI Sorgente Rivelatore Monocromatore o filtro Ottica Accessori specifici per misure di bio- e chemiluminescenza (es. dispensatore di reagenti) Rivelatore ad elevata sensibilità (di solito basato su un tubo fotomoltiplicatore) Fluorimetro Non sono necessari filtri o monocromatori (l’emissione BL/CL è specifica, ed ogni selezione di lunghezza d’onda ridurrebbe l’intensità del segnale) tranne che per particolari applicazioni (BRET, “dual reporter assays”…) Non è richiesta la sorgente di eccitazione Comparto portacampioni ed ottiche ridisegnate per ottenere la massima efficienza di raccolta della luce Luminometro

164 Imaging microscopico Imaging macroscopico
MISURE DI CL e BL LUMINOGRAFI Rivelatore Obiettivo Box a tenuta di luce Imaging microscopico Imaging macroscopico

165 MISURE DI CL e BL analita reagente (eccesso)
misura reagente (eccesso) Segnale prodotto eccitato (instabile) emissione prodotto finale (stabile) Tempo

166 MISURE DI CL e BL substrato (eccesso) enzima
Segnale prodotto eccitato (instabile) 1-5 minuti per HRP 15-30 minuti per AP emissione misura prodotto finale (stabile) Tempo

167 CARATTERISTICHE ANALITICHE
The enzyme kit produced by Boehringer and Mannheim allows the determination of D-glucose and D-fructose in food samples in three simple steps. Step 1:         Primary Reaction         1                                             Hexokinase                     D-Glucose + ATP > G-6-P + ADP                     D-Fructose + ATP > F-6-P + ADP Step 2:         Detection of D-Glucose                       G-6-P +     G-6-P Dehydrogenase                    Gluconate-6-phosphate +                     NADP+     >     NADPH + H+   The production of NADPH is stoichiometric with the amount of glucose in sample. The determination of glucose content can be done by measuring the increase in absorbance of NADPH at 334, 340, or 365 nm. Step 3:         Detection of D-Fructose                Phosphoglucose isomerase F-6-P > G-6-P G-6-P reacts with NADP+ again and forms NADPH. The level of NADPH present can be detected by measuring the increase in absorbance at 334, 340, or 365 nm. The amount of NADPH is stoichiometric with the amount of fructose.

168 CARATTERISTICHE ANALITICHE
Rapid Enzymatic Tests for Glucose   Introduction: Reagent strips have been designed to perform rapid and semi-quantitative analysis for glucose. They are easy to use and require no addition laboratory equipment of reagents. Three reagent strips, Clinistix, Dextrostix and Diastix, will be used. The enzymatic reactions involved are as described below. Step 1: Glucose Glucose Oxidase Glucose > Gluconic Acid + H2O2 Step 2: Clinistix and Dextrostix: H2O2 + chromogen orthotolidine- Peroxidase H2O2 + chromogen orthotolidine > oxidized orhotolidine Diastix: H2O2 + Potassium iodide ---Peroxidase H2O2 + Potassium iodide > iodine complex     The intensity of the color gives a semi-quantitative analysis of the level of glucose in the samples. Materials: Please refer to class notes and p b of the Laboratory Manual  .   Bottles of Reagent Strips Instead of blood and urine samples, Sample Solutions A, B, and C will be used Procedure: Clinistix:  · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 10 seconds, compare to colour chart provided Dextrostix:  · Add a drop of sample solution to the test strip · After exactly 60 seconds, wash with water for 2 second (water bottle) · Blot once gently · Compare to colour chart immediately Diastix:  · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 30 seconds, compare to colour chart

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