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EFFETTI BIOLOGICI DELLE RADIAZIONI IONIZZANTI LNF 7-9 Ottobre 2009 Ubaldo Bottigli Università di Siena & Sezione INFN di Pisa Incontri.

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1 EFFETTI BIOLOGICI DELLE RADIAZIONI IONIZZANTI LNF 7-9 Ottobre 2009 Ubaldo Bottigli Università di Siena & Sezione INFN di Pisa Incontri di Fisica 2009

2 CSN5 Ricerche Tecnologiche di avanguardia CSN5 – Fisica Applicata Ricerche Tecnologiche di avanguardia mirate ai temi scientifici ed agli esperimenti dellINFN campo della strumentazioneI progetti finanziati dalla CNS5 si collocano nel campo della strumentazione dedicata agli esperimenti di fisica nucleare, sub-nucleare ed astro-particellare: Rivelatori elettronica software Rivelatori di particelle, sviluppi di elettronica e software Acceleratori elettronica software Acceleratori di particelle, sviluppi di elettronica e software Applicazioni di tecniche davanguardia nei settori inter-disciplinari e delle scienze della vita

3 CSN5 – Fisica Applicata La CSN5 esiste fin dalla nascita dellINFN e quindi ben prima della attuale presunta richiesta governativa di applicazione. I padri fondatori hanno pensato che una Ottima Buona Sufficiente Pessima Ricerca Fondamentale Ottima Buona Sufficiente Pessima Ricerca Applicata

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5 Dose La dose è lenergia assorbita per unità di massa: Gy = J/Kg = m 2 /s 2 1 Gy = 100 rad

6 Equivalente di dose Lequivalente di dose è un fattore (w R ) moltiplicativo che indica il danno biologico relativo a parità di dose fisica: Unità: Sievert, (Sv). Se wR = 1, allora 1 Gy = 1 Sv Vecchie unità = 100 rem = 1 Sv Radiation Radiation Weighting Factor (w R ) X and rays, electrons (*) 1 Protons (E>2MeV)5 Neutrons (energy dependent) 5÷20 particles and other multi-caharged 20 (*) w R =1 for electrons of all energies except for Auger electrons emitted by nuclei bound to DNA From ICRP n. 60 (1991)

7 Meccanismo cellulare di base del danno da radiazione Le radiazioni ionizzanti possono danneggiare direttamente il bersaglio molecolare, oppure ionizzare lacqua e quindi produrre radicali liberi che aggrediscono a loro volta le molecole. Le radiazioni ionizzanti producono i danni sia direttamente, colpendo la cellula, sia indirettamente, ionizzando lacqua, la quale a sua volta, genera dei radicali liberi che attaccano il bersaglio cellulare.

8 Modelli di sopravvivenza cellulare Un grafico della frazione di sopravvivenza vs la dose, mostra due tipi di meccanismo di danneggiamento: il tipo-A (curva tratteggiata) ed il tipo-B (curva intera).

9 Meccanismo cellulare di base del danno da radiazione Le radiazioni ionizzanti possono danneggiare direttamente il bersaglio molecolare, oppure ionizzare lacqua e quindi produrre radicali liberi che aggrediscono a loro volta le molecole.

10 Effetti sulla molecola del DNA La irradiazione può produrre vari tipi di alterazioni nella struttura della molecola del DNA per effetto diretto o indiretto –alterazioni delle basi pirimidiniche (T, C ) o puriniche (A, G ) –alterazioni del desossiribosio –rottura di legami con distacco di frammenti e formazione di nuovi legami nello stesso filamento o crociati –rottura di un singolo filamento dellelica (Single Strand Break) –rottura di entrambi i filamenti (Double Strand Break) per effetto di una singola traccia o di due tracce contemporanee (hot spots)

11 Effetti del danno del DNA (End-point biologici) Riparazione completa con restitutio –avviene per la grande maggioranza delle alterazioni minori –la cellula riprende la sua normale attività Riparazione erronea (misrepair) –la cellula muore dopo alcune divisioni (morte mitotica ritardata) –la cellula muore senza dividersi per accelerazione della morte programmata (apoptosi) –la cellula non muore ma presenta mutazioni che possono modificare alcune funzioni Fissazione non riparabile del danno –la cellula muore subito nel giro di ore per liberazione di enzimi litici indipendentemente dalla mitosi (morte interfasica); riguarda alcune specie cellulari specifiche (linfociti, ovociti, cell. salivari sierose) –la cellula muore in occasione del primo evento mitotico (morte mitotica) o dopo alcune mitosi (morte mitotica ritardata) Il danno non riparabile è sostanzialmente rappresentato dalle doppie rotture (DSB)

12 La risposta delle cellule dipende… 1.dal rate di dose 2.dal tipo di cellula 3.dalla fase del ciclo cellulare 4.dalla presenza dellossigeno

13 Come se non bastasse…….la Dosimetria Gli effetti biologici delle radiazioni ionizzanti dipendono, come abbiamo visto, da molteplici fattori fisici e biologici e riguardo a questultimi possiamo individuare tre bersagli interessanti: la cellula lorganolorganismo Non è immediata la generalizzazione dei risultati ottenuti su di un bersaglio rispetto agli altri.

14 Il problema delle basse dosi Dosi non letali dal cGy al Gy in funzione del bersaglio

15 Il problema delle basse dosi Negli Stati Uniti sono state eseguite 62 milioni di Tac nel 2006, contro i tre milioni del 1980 [the New England Journal of Medicine (NEJM) Nov. 2007]

16 Il problema delle basse dosi

17 ForumForum Forum europeo ( ) sul problema degli effetti sulla popolazione delle dosi dovute ad esami di imaging biomedico. Presidenza italiana del forum ISS Il problema delle basse dosi

18 Studio degli effetti biologici indotti a seguito di esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti Un Programma di lavoro Contributo alla valutazione del rischio Comprensione degli effetti non-lineari

19 EXCALIBUR (EXposure effeCts At Low-doses of Ionizing- radiation in Biological cultURes) BOCA/SSLNFLNGSLNLPVPI/SIRoma3

20 Dose dallambiente Equivalente di dose annuale media è ~3 mSv

21 G. Moschini, G. Pavarin, M. Pelliccioni, E. Righi Dose media per irraggiamento esterno (mSv/y) da fondo naturale

22 22 Esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti Contributo delle varie sorgenti naturali di radiazioni ionizzanti alla dose annuale media alluomo negli U.S.A. Contributo relativo delle varie sorgenti di radiazioni ionizzanti alla dose annuale media alluomo nel mondo. Principali sorgenti naturali Terrestri e loro vite medie Potassio K1.3x10 9 a Rudio Rb5x10 10 a Torio Th1.4x10 10 a Uranio U4.5x10 10 a Potassio K17 mrem/a Carbonio C 10mrem/a Polonio-210 sino a Piombo Po 210 Pb 12 mrem/a Totale39mrem/a Contributo alla dose media annuale delle principali sorgenti di irraggiamento interno F.A. Mettler et al, 1995 S.C. Bushong, 1998

23 Valutazione di rischio alle basse dosi Studi a dosi medio-alte : - studi in vitro: irraggiamenti a fascio largo - studi epidemiologici: sopravvissuti di Hiroshima e Nagasaki, minatori di uranio, Chernobyl, popolazione medicalmente esposta + Estrapolazione alle basse dosi andamento lineare alle basse dosi assunzione cautelativa in radioprotezione: andamento lineare alle basse dosi Studi epidemiologici diretti a basse dosi - misura dellesposizione indoor di radon e correlazione con lincidenza di cancro ai polmoni problemi metodologici nella determinazione dellesposizione dellindividuo (E.J. Hall, Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., Vol. 65, No. 1, pp. 1–7, 2006) ?

24 Obiettivi Studio degli effetti biologici indotti a seguito di esposizione a basse dosi di radiazioni ionizzanti, con particolare riguardo agli effetti non- lineari (ipersensibilità, radioresistenza indotta, risposta adattativa, effetti di bystander..) 1. Studio dei meccanismi di induzione e trasmissione del danno a basse dosi di radiazioni, in colture cellulari, in funzione della qualità della radiazione (raggi γ/X; protoni, alfa e ioni pesanti di varie energie) 2. Studio dellinfluenza dello stato di crioconservazione sulla risposta cellulare alle radiazioni ionizzanti (raggi γ) di sistemi biologici in-vitro e in- vivo, esposti al fondo naturale di radiazioni. 3. Contributo alla valutazione di rischio per esposizioni alle basse dosi di R.I. 4. Sistematica di effetti biologici indotti in diversi sistemi cellulari di mammifero, in coltura o crio-conservati, in funzione della qualità della radiazione e della dose(nel regime delle basse dosi), inclusi sistemi in-vivo (embrioni di pecora)

25 Stato dellarte (1) Per esposizioni alle basse dosi di R.I. (<0.5 Gy) in radioprotezione, in via cautelativa, la valutazione di rischio è effettuata estrapolando i dati delle alte dosi, mediante una relazione lineare senza soglia (LNT, Linear No-Threshold cancer risk model), con lassunzione a prioristica che gli organismi viventi rispondano allo stesso modo alle basse come alle alte dosi. In effetti, evidenze sperimentali accumulate negli ultimi 15 anni hanno mostrato la presenza di effetti non-lineari specifici alle basse dosi, non riscontrati alle alte dosi, quali: lipersensibilità e la radioresistenza indotta (HRS/IRR); leffetto bystander (BE); linstabilità genomica.

26 Stato dellarte (2) Ipersensibilità e Radioresistenza indotta (HRS/IRR) Fenomeni di ipersensibilità e radioresistenza indotta sono stati riscontrati in più di 40 linee cellulari in vitro (umane, normali e tumorali, e di roditore), in seguito a irraggiamenti con basse dosi di radiazioni di raggi X/. In esperimenti di sopravvivenza cellulare, tali effetti si traducono in una deviazione per dosi < 1 Gy dal convenzionale andamento lineare o lineare-quadratico delle curve dose-risposta, con una mortalità maggiore (HRS) alle dosi più basse e radioresistenza (IRR) successiva al crescere delle dosi.

27 Effetti delle basse dosi: Ipersensibilità (HRS) e Radioresistenza indotta (IRR) (Marples and Joiner,Int. J. Radiat. Biol. 2001, vol. 77, ) Irraggiamenti cellulari con RX Irraggiamenti cellulari con RX: Cellule normali e tumorali di radiosensibilità Iper-sensibilità alle basse dosiIper-sensibilità alle basse dosi Radioresistenza indottaRadioresistenza indotta Meccanismo protettivo indotto da basse dosi di radiazioni Con neutroni e pioni di alto LET: Andamento lineare (no HRS/IRR)

28 Stato dellarte (3) Ipersensibilità e Radioresistenza indotta (HRS/IRR) Più recentemente HRS/IRR sono stati osservati anche con radiazioni densamente ionizzanti (ioni pesanti) in cellule di roditore, in contrasto però con quanto osservato con neutroni, pioni nel picco di Bragg e protoni di alta e bassa energia.

29 … Effetti delle basse dosi: Ipersensibilità e Radioresistenza indotta (E.Tsoulou et al., Int. J. Rad. Biol. (2001),vol. 77, ) at LNL: broad ion beam cell irradiations: 60 Co rays and 4 He 2+ ions of different energies (59, 79 and 102 keV/ m LET) Chinese hamster V79 cells Iper-sensibilità alle basse dosi (HRS)Iper-sensibilità alle basse dosi (HRS) Radioresistenza indotta (IRR)Radioresistenza indotta (IRR)

30 …Effetti delle basse dosi (studi in vitro) G. Borhnsen et al., Radiat. Prot. Dos.(2001),vol. 99, Tsoulou,..,Cherubini et al., Radiat. Prot. Dosim. 99(2002) GSI SIS facilty scanned pencil beam and LNL broad ion beam cell irradiations: 6MV photons and 12 C 6+ ions of 92.5 MeV/amu on target (27.5 keV/ m LET) 60 Co rays and 4 He 2+ ions of different energies (59, 79 and 102 keV/ m LET) Chinese hamster V79 cells Low dose hyper-radiosensitivity Induced radioresistance Effetto Lazzaro

31 Stato dellarte (4) Effetto bystander (BE) In esperimenti in vitro è stato osservato che il danno da radiazione è espresso anche in cellule non direttamente interessate dal deposito energetico, ma vicine (a contatto o non) a cellule irradiate. Tale effetto è stato riscontrato, in molte linee cellulari (di roditore, umane normali e tumorali), per diversi end-point biologici (scambi di cromatidi fratelli, aberrazioni cromosomiche, micronuclei, apoptosi, morte clonogenica, trasformazioni oncogeniche, mutazioni) e con diversi approcci sperimentali (irraggiamenti con micro fasci di RX o ioni; irraggiamenti con fasci larghi di ioni o con sorgenti con mascheramento di parte della popolazione cellulare esposta; esperimenti di trasferimento del terreno di coltura da una popolazione irraggiata a una non irraggiata; esperimenti di co-cultura tra popolazione irraggiata e non).

32 1 cellula colpita allinterno di una popolazione Danno (morte cellulare, apoptosi, induzione di micronuclei, trasformazioni oncogeniche) espresso in più di 1 cellula (..evidenze sperimentali..) Quali meccanismi di induzione e trasmissione del danno?... secrezione di fattori citotossici nel mezzo di coltura da parte delle cellule irraggiate comunicazione diretta tra cellule attraverso gap-junction …. ROS/RNS (NO); …. By gap-junction? By soluble molecules? Effetti delle basse dosi: Bystander effect

33 Mitocondrio produce energia (possiede il suo DNA - mtDNA) Citoplasm a Nucleo = sede del materiale Genetico (DNA) Citoplasma N = Nucleo ( 8 μm ) Radiazione Interazione diretta (e - ) e indiretta (ROS) Modificato da L.E. Feinendegen,2005 ©SG2008

34 Signaling between Tissue Cells and Matrix Tissue Cells Matrix Gap Junction Hit Cell = Bystander Effects Ulteriore Open problem: Qual è il target della radiazione? L.E. Feinendegen, 2005

35 Riassunto effetti delle basse dosi 1)Priming dose: 5-40 cGy RX qualche h prima dellirraggiamento 2) Irraggiamento (Challenging dose) Osservato: in vivo e in vitro (protozoi, alghe, cell vegetali e di mammifero) per diverse linee cellulari per diversi end-point biologici (mutazioni, trasformazioni oncog., micronuclei, danno cromosomico e sopravvivenza cellulare)

36 Stato dellarte (5) Instabilità genomica Lesposizione a radiazioni può dare inizio ad una cascata di eventi che produce un aumento del rateo di alterazioni nel genoma delle progenie di cellule irraggiate che non hanno manifestato un danno immediatamente dopo lirraggiamento (effetti tardivi). Linstabilità è stata misurata in termini di una molteplicità di end-point biologici, ma con particolare attenzione al danno cromosomico. Anche tale effetto è stato evidenziato per diverse linee cellulari (cellule umane normali, linfociti umani, etc..) nonché per radiazioni sia a basso che ad alto LET. Linstabilità genomica è stata anche riscontrata nella progenie di cellule non direttamente irraggiate, ma in comunicazione, attraverso gap-junction o terreno di coltura, con cellule irraggiate, evidenziando una possibile relazione di tale effetto col BE.

37 Effetti delle basse dosi: Instabilità Genomica Lesposizione a radiazioni produce un aumento del ritmo di mutazioni con danno cromosomico nella progenie di cellule irraggiate Alterazioni nel cariotipo (numero e morfologia cromosomica) di cell esposte a dosi di particelle α corrispondenti (in media) a 1 ione/cell Instabilità cromosomica nel: 3% di cloni di cell ibride umane/criceto per 1 Gy di RX; 4% di cloni per 1 Gy di ioni ferro.

38 Stato dellarte (6) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Il metodo di conservazione per lunghi periodi di tempo di sistemi biologici è la cosiddetta crio-conservazione, ovvero il loro mantenimento, con opportuni trattamenti preparatori, mediante congelamento, vitrificazione o ibernazione in opportune installazioni di laboratorio (dewar per azoto liquido, -196°C, 77 K). Alle temperature criogeniche i processi biochimici cellulari sono inibiti e quindi si impedisce la senescenza cellulare e la degradazione del materiale biologico. La tecnica è ben conosciuta e praticata (30÷40 anni) ed è ben misurato il danno prodotto nelle cellule da la procedura congelamento-scongelamento.

39 Stato dellarte (7) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Dipendendo dallambiente in cui i sistemi biologici crio-conservati vengono depositati, essi subiranno un irraggiamento protratto per anni e spesso per decine di anni, come nel caso delle banche di colture cellulari o delle banche di cellule staminali e/o germinali, a causa del fondo naturale di radiazioni.

40 Stato dellarte (8) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Dipendendo dal tempo di conservazione e mancando lazione antagonista continua dei meccanismi di riparazione, i danni prodotti dallesposizione delle cellule crio-conservate al fondo di radiazioni, in principio andranno accumulandosi, trasformando lesposizione a dose protratta (bassissimo rateo di dose del fondo ambientale) in esposizione a dose acuta, al momento dello scongelamento e rivitalizzazione delle cellule. (CRIORAD EXP.)

41 Stato dellarte (9) Effetti della radiazione di fondo su Sistemi Crio-conservati Recenti risultati sperimentali ottenuti confrontando la risposta a raggi- di diversi sistemi biologici in condizioni criogeniche e a temperature ambiente, in termini di vari end-point biologici, hanno mostrato un effetto protettivoeffetto protettivo della crio-conservazione rispetto allazione delle R.I (raggi- )

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43 Attività sperimentale di EXCALIBUR a Settembre Esperimenti EPR (Electron Paramagnetic Resonance) 2.Irraggiamenti raggi-X, e particelle cariche su cromosomi ed analisi genomica 3.Irraggiamenti raggi-X, e particelle cariche su cellule ed analisi membranica

44 Attività EPR (1) Esperimenti EPR (Electron Paramagnetic Resonance) per misurare la concentrazione di radicali liberi prodotti da irraggiamento, allo scopo di: 1.determinare gli effetti dello stato di crioconservazione sulla natura e distribuzione dei prodotti radicalici; 2.confronto con la radiolisi in fase liquida; 3.effetti della dose, del rateo di dose e della natura delle radiazioni.

45 Attività EPR (2) Metodologia: 1.preparazione dei campioni di cellule V79, dei terreni di coltura e di irraggiamento e dei loro componenti; 2.irraggiamenti a 77 o K con radiazioni da 60 Co, raggi X, H+, D+ ed ; 3.spettroscopia EPR in matrice e in fase liquida con agenti di spin trapping

46 Attività EPR (3) Campioni A1-A9: A1 : H2O Pura A2: H2O + DMSO* ( 10%) A3 : terreno di coltura DMEM completo A4 : Terreno di coltura DMEM completo + DMSO A5 : Terreno di coltura DMEM completo + FBS A6 : Terreno di coltura completo + FBS** + DMSO = terreno di congelamento A7 : Cellule in terreno di coltura completo + FBS (1.5x10 7 cellule totali) A8 : Cellule in terreno di congelamento(1.5x10 7 cellule totali) A9: H2O + FBS *Dimetilsolfossido (DMSO) per crioprotezione cellulare **Fetal bovine serum (FBS) da aggiungere al medium di coltura per far crescere le cellule

47 Attività EPR (4) Area Totale (U.A.) Tempo di irraggiamento ( h, 0.35 kGy/h ) A4 Terreno di coltura DMEM completo + DMSO A8 cellule in terreno di congelamento A5 Terreno di coltura DMEM completo + FBS A1 acqua pura A9 acqua + FBS A3 terreno di coltura DMEM completo

48 Attività EPR (5) ANALISI PARZIALE EFFETTUATA: 1.la presenza di DMSO aumenta la produzione di radicali liberi (metilici), la cui dinamica deve essere studiata; 2.i radicali OH (in misura minore anche i radicali HO 2 ) sono dominanti in H 2 O pura e sono presenti in tutti i sistemi irraggiati. I radicali OH decadono a 140 o K senza generare nuove specie per reazione con gli altri componenti presenti; 3.il fenomeno descritto riduce drasticamente il danno mediato dalla radiolisi dellacqua sulle cellule e costituisce una differenza sostanziale rispetto alla radiolisi in fase liquida; 4.non cè, per ora, evidenza chiara del danno radicalico diretto o indiretto sulle cellule. Gli spettri EPR sono sostanzialmente gli stessi ottenuti dai sistemi senza cellule; 5.dobbiamo aumentare la popolazione di cellule nei campioni e si devono eseguire misure preliminari con sospensioni delle cellule in acqua pura.

49 Attività genomica (1) Il telomero è la regione terminale del cromosoma, da cui deriva il nome stesso, composta di DNA altamente ripetuto, che non codifica per alcun prodotto proteico. Ha un ruolo determinante nell'evitare la perdita di informazioni durante la duplicazione dei cromosomi. La DNA polimerasi, infatti, non è in grado di replicare il cromosoma fino alla sua terminazione; se non ci fossero i telomeri, che quindi vengono accorciati ad ogni replicazione, la replicazione del DNA comporterebbe in ogni occasione una significativa perdita di informazione genetica. Vi sono prove che questo progressivo accorciamento dei telomeri sia associato all'invecchiamento della cellula e dell'intero organismo. I telomeri (in giallo) sono evidenziati sui cromosomi attraverso una Fluorescent in situ hybridization (FISH) Elizabeth Blackburn, Carol Greider e Jack Szostak, Nobel per la Medicina 2009, per aver individuato l'esistenza dei telomeri e delle telomerasi, correlandone laccorciamento con linvecchiamento cellulare.

50 Attività genomica (2) Il telomero è composto da sequenze ripetute di DNA e da alcune proteine ed ha la funzione di proteggere le terminazioni dei cromosomi. Ciò impedisce da una parte la degradazione progressiva con rischio di perdita di informazione, dall'altra che tale regione, non presentando una corretta struttura a doppia elica, sia processata come estremità di filamento spezzato, con il rischio di fusione tra due regioni telomeriche di cromosomi diversi. ciò significa che, ad ogni replicazione, i telomeri umani si accorciano di un certo numero di paia di basi. I telomeri sono estesi dall'enzima telomerasi, che rappresenta una classe di retrotrascrittasi specializzate, presenti in numerosi organismi (tra cui l'uomo), ma non in tutti (e soprattutto non in tutte le fasi dello sviluppo). In particolare, nell'uomo le telomerasi (così come nella maggior parte degli eucarioti multicellulari) sono attive solo nelle cellule della linea germinale: ciò significa che, ad ogni replicazione, i telomeri umani si accorciano di un certo numero di paia di basi.

51 Attività genomica (3) Esistono teorie che associano il continuo accorciarsi dei telomeri con la senescenza delle cellule della linea somatica e con la prevenzione del cancro. Questo perché i telomeri agirebbero come una sorta di orologio biologico, legato cioè ad un numero massimo di mitosi (e di replicazioni del DNA), al termine del quale la cellula sarebbe troppo vecchia per essere mantenuta in vita e prenderebbe la via dell'apoptosi. Per garantire un efficace ricambio cellulare, in ogni caso, in molti tessuti dell'organismo sono presenti cellule staminali, che mantengono la corretta lunghezza dei telomeri attraverso la presenza di telomerasi attive. Il meccanismo molecolare attraverso cui i telomeri troppo corti possono portare alla morte cellulare sembra essere legato alla perdita del loro corretto ripiegamento naturale (evento legato ad una loro dimensione troppo ristretta). Secondo alcune teorie comunemente accettate, la cellula è infatti in grado di riconoscere questo diverso ripiegamento come danno al DNA, avviando il processo dell'apoptosi sulla base dell'attività di molecole come p53. Tale processo di morte cellulare può anche essere avviato da una fusione tra cromosomi.

52 Attività genomica (4) Nell'uomo, la sequenza ripetuta nei telomeri è composta di sei nucleotidi TTAGGG, ripetuti per una lunghezza che va da 3 a 20 kilobasi. Sono presenti kilobasi addizionali di ripetizioni telomero-associate, che si dispongono tra il telomero ed il resto del cromosoma. La sequenza telomerica varia da specie a specie. Tipo di organismoSequenza telomerica VertebratiTTAGGG Piante SuperioriTTTAGGG Alghe VerdiTTTTAGGG InsettiTTAGG

53 Attività genomica (5) Le misure finora effettuate (4 Gy) mostrano che: 1.i fibroblasti, di uomo e di topo, esibiscono differenti comportamenti, per quanto riguarda la lunghezza del telomero, per iraggiamenti con radiazioni di basso od alto LET: accorciamento per basso LET, allungamento per alto LET; 2.la qualità della radiazione e la conseguente complessità del danno indotto a livello del DNA, sembrano giocare un ruolo nellattivazione dei processi di ricombinazione a livello del telomero; 3.è del tutto sconosciuto, a nostra conoscenza, il significato radiobiologico di questo allungamento del telomero (genomic instability??).

54 Attività genomica (6) 0 Gy 4 Gy X rays Number of Telomeres = 2204 Mean length = 25,65 St. Dev. = 17,03 Number of Telomeres = 1818 Mean length = 29,58 St. Dev. = 18,07 28,5 keV/um protons X-rays 3 MeV protons Doses (Gy) Telomere length (T/C%) 24 hrs 96 hrs * * * Number of Telomeres = 1808 Mean length = 25,51 St. Dev. = 15,45 Number of Telomeres = 1810 Mean length = 17,87 St. Dev. = 11,79 ISIS Software Metasystems T/C% = Tel fluo Cen 2 fluo

55 Attività membranica (1) La risposta cellulare allirraggiamento, è stata analizzata in termini di misure di correnti ioniche (il canale del K + ) con la tecnica del patch clamp, cioè bloccando la differenza di potenziale elettrico in una piccola area della membrana cellulare o dell'intera cellula. L'estremità di una pipetta di vetro ( 1 m e ) viene fatta aderire perfettamente alla membrana cellulare permettendo così di isolare una piccola area della membrana stessa e i canali ionici in essa presenti. A questo punto è possibile modificare e manipolare chimicamente o elettricamente i canali stessi in modo da studiarne le proprietà.

56 Attività membranica (2) Curve I-V ottenute in seguito ad irraggiamenti con diversi valori di dose, registrate tramite la tecnica del patch clamp in cellule V79

57 Attività membranica (3) Curve I-V ottenute in seguito ad irraggiamenti con p da 3 MeV, registrate tramite la tecnica del patch clamp in cellule V79


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