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FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA ANALISI ENZIMATICA determinazione dell’ attività catalitica di enzimi determinazione della.

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2 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA ANALISI ENZIMATICA determinazione dell’ attività catalitica di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze per mezzo di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze mediante reattivi marcati con enzimi DOSAGGI ENZIMATICI

3 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA ENZIMA ATTIVO Ubiquitina Lisosomi degradazione Sito attivo Effettore allosterico Sito allosterico Zimogeno (precursore) DNA RNA ribosomi Apoenzima Parte non-proteica ione metallico o coenzima SubstratoProdotto Struttura generale degli enzimi

4 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA ENZIMI Gli Enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze. Gli Enzimi sono catalizzatori biologici. X G GG Y Reazione non catalizzata  G* Reazione catalizzata

5 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Cinetiche chimiche (A  P) Equilibrio V iniziale VtVt Concentrazione di prodotto Tempo k=costante di velocità n=numero intero 1-3

6 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA [prodotto] Tempo A1 [A] Velocità iniziale A2 A1 A3 A4 Effetto della concentrazione di A (A  P)

7 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche Velocità iniziale [A] Cinetica enzimatica Cinetica chimica

8 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Ipotesi per l’azione degli enzimi E + S  ES  EP  E + P 1/[S] 1/V 0 1/K M 1/V max V max [S] KMKM V max /2 Grafico di Lineweaver-Burk V0V0

9 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN L’equazione vista in precedenza, che descrive la relazione velocità- concentrazione di substrato in una reazione enzimatica, è l’equazione di Michaelis-Menten Come già detto, V max è la velocità dello stadio limitante della reazione enzimatica ad alte concentrazioni di substrato, quindi V max = k 2 [ES] Ad alte concentrazioni di substrato l’enzima è saturato, perciò [ES] = [E], da cui V max = k 2 [E] L’equazione può essere scritta in una forma diversa che evidenzia la dipendenza della velocità, oltre che dalla concentrazione di substrato, dalla concentrazione di enzima k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 k 1 k 2 E + S ES E + P k -1

10 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Regione 2  Regione non utile dal punto di vista analitico intermedieordine misto v  Regione 3  Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica ordine 0 << Velocità della reazione Regione 1  La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S]  Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato 1° ordine >>

11 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Nomenclatura degli enzimi Denominazione classica costituita da 3 parti: –Nome del substrato –Nome del coenzima –Nome della reazione catalizzata + “asi” Esempio: Lattico-NAD-deidrogenasi International Enzyme Commission, fondata nel 1956 da Prof. M. Florkin, International Union of Biochemistry: –Classificazione degli enzimi secondo il sistema delle classi EC Esempi: Creatin kinasi: EC , adenosintrifosfato : creatin N- fosfo trasferasi Lattato deidrogenasi: EC , lattato : NAD+ ossidoreduttasi –Ha funzionato bene fino agli anni ‘90 (circa 3200 enzimi) Progetto genoma umano (HUGO): –Esistono circa 20,000 geni, di cui almeno 1/4-1/3 sono enzimi

12 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Classificazione internazionale degli enzimi 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione –1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore –1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore –1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore –1.4 agisce sul gruppo CH-NH 2 del donatore –1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore –1.6 agisce su NADH 2 o NADPH 2 –1.7 agisce su altri composti azotati –1.8 agisce su gruppi solforati –1.9 agisce sui gruppi eme

13 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra –2.1 gruppi ad una unità di carbonio –2.2 gruppi chetonici o aldeidici –2.3 gruppi acilici –2.4 gruppi glicosidici –2.5 gruppi alchilici –2.6 gruppi azotati –2.7 gruppi fosforici –2.8 gruppi contenenti zolfo Classificazione internazionale degli enzimi

14 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi –3.1 legami esterei –3.2 legami glicosidici –3.3 altri legami –3.4 legami peptidici –3.5 legami C-N non peptidici –3.6 legami anidridici –3.7 legami C-C Classificazione internazionale degli enzimi

15 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami –4.1 legami C = C –4.2 legami C = O –4.3 legami C = N –4.4 legami C = S Classificazione internazionale degli enzimi

16 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero –5.1 racemasi –5.2 cis-trans isomerasi Classificazione internazionale degli enzimi

17 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi –6.1 legami C-O –6.2 legami C-S –6.3 legami C-N –6.4 legami C-C Classificazione internazionale degli enzimi

18 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi Classificazione internazionale degli enzimi

19 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Classificazione enzimi plasmatici Enzimi specifici del plasma Enzimi non specifici del plasma Enzimi della coagulazione Enzimi secretiEnzimi del Metabolismo intracellulare Enzimi presenti nei tessuti ENZIMI

20 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA

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22 NOMENCLATURA

23 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA CLASSIFICAZIONE EMPIRICA Significato della presenza di enzimi intracellulari nel plasma –Aumento del turnover cellulare –Proliferazione cellulare (neoplasia) –Aumento di sintesi enzimatica (induzione) –Lesione di un tessuto –Ostruzione della secrezione –Diminuzione della eliminazione (clearance) Concentrazione degli enzimi nel plasma dipende da: -sintesi dell’enzima -stato d’integrità delle membrane cellulari -fenomeni di distribuzione -velocità di eliminazione

24 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Alcuni enzimi del plasma EnzimaOrganoCause di aumentoNote Fosfatasi alcalina (ALP) Fegato, osso, placenta, epitelio intestinale Gravidanza, infanzia Osteomalacia, cirrosi epatica, Tumori ossei, iperparatiroidismo, fratture, infiammazione intestinale Isoenzimi identificabili per elettroforesi Fosfatasi acida ProstataTumore prostaticoEnzima labile Aspartato transami-nasi (AST o GOT) Fegato e miocardio Epatite/necrosi epatica, Infarto, traumi, malattie muscolari, epatite cronica Fisiologico in neonati Normale: ALTAST Gamma glutamil transferasi (GGT) Fegato, rene, pancreas Colestasi epatica Epatite, cirrosi, pancreatite Ingestione di alcool o farmaci, insufficienza cardiaca Marker di sindromi epatobiliari Creatin chinasi (CK) Distrofia muscolare, infarto del miocardioBB cervello MB cuore MM muscolo AmilasiGhiandole salivari, pancreas Pancreatite, ulcera duodenale, ostruzione intestinale, chetoacidosi diabetica, calcoli o infiammazione delle ghiandole salivari Lattato Deidrogenasi (LDH) Isoenzimi danno indicazioni più specifiche Alanina Transaminasi (ALT o GPT) FegatoAumenta in epatiti e cirrosi Colineste-rasiFegatoLivello basso indica disfunzione epatica

25 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA

26 UNITA’ DI MISURA

27 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA CONDIZIONI SPERIMENTALI DEL SAGGIO  Controllo del pH con una soluzione tampone  Controllo della temperatura  Assenza di inibitori (agenti chelanti, metalli) l Enzimi plasmatici a scopo diagnostico l Carenze/difetti enzimatici responsabili di sindromi biochimiche SAGGI ENZIMATICI IN CLINICA

28 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Metodi spettrofotometrici Metodi fluorimetrici Metodi potenziometrici (pH) Metodi manometrici Metodi radioisotopici Metodi continui Metodi discontinui Metodi accoppiati SAGGI DI ATTIVITA’ ENZIMATICA

29 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Una reazione enzimatica è un processo cinetico, perciò un parametro importante nella misura di attività enzimatica è il tempo La velocità è definita come variazione di concentrazione del prodotto nel tempo Quindi, la velocità è data dalla pendenza di questa curva La pendenza della curva (velocità) varia nel tempo temp o veloc ità tempo [P] La misura di velocità deve essere effettuata ad un tempo ben preciso, nell’intervallo in cui si osserva una relazione lineare tra [P] e tempo, quindi nelle fasi iniziali della reazione La misura di attivita’ enzimatica e’ una misura di velocita’ iniziale della reazione La velocità iniziale si indica con v 0 oppure v i 1 2

30 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA DETERMINAZIONE ATIVITA’ ENZIMATICA E= (  mol di substrato/V  t)=  c’/  t E=(  A/  l  t)10 3 Ecampione=E(V/v) v=volume campione Da misure di assorbanza: Al tempo t1 si avrà A1= ε l c1 A2 tempo t2 si avrà A2= ε l c2 Al–A2= ε l(c1– c2)  c=  A/ε l

31 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA SAGGI CONTINUI SAGGI DIRETTI E + S  E + P (prodotto colorato - cromoforo o fluorescente – fluoroforo) Esempio: +NADH + NAD + Lattato Deidrogenasi (LDH) Piruvato Lattato

32 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA TEST OTTICO DI WARBURG N + R NH 2 O N R NH 2 O.. + H + + 2e - + H NAD NADH E’ la reazione indicatrice piu’ impiegata in spettrofotometria indiretta per applicazioni cliniche: Massimi di assorbanza separati permettono misure cinetiche A + +B deidrogenasi

33 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA SAGGI ACCOPPIATI E 1 + S  E 1 + P (prodotto non colorato o fluorescente) E 2 + P  E 2 + Q (secondo prodotto, Q, colorato) Esempio: ACCOPPIAMENTO CON REAZIONE IRREVERSIBILE A B  C + L -treonina glicinaacetaldeide L -treonina aldolasi acetaldeide + NADH +NAD + alcol etilico alcol deidrogenasi E1E1 E2E2 SAGGI CONTINUI

34 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA

35 [E tot ] = 0,13  M K M = 0,19  0,01 mM V max = 26  0,3  M min -1 k cat = V max / [E tot ] = 26 / 0,13 = 206 min -1

36 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA L’attività enzimatica delle ossidoreduttasi che utilizzano (consumano o producono) NAD(P)H come cofattore può essere determinata direttamente perché il NAD(P)H ha un massimo di assorbimento caratteristico a 340 nm che non si trova nel cofattore in forma ossidata NAD(P) + Altrimenti si usano metodi colrimetrici che sfruttano la riduzione dei Sali ditetrazolio a formazani rossi porpora. Il NAD(P)H può essere misurato anche in fluorescenza, con un massimo di eccitazione a 340 nm ed un massimo di emissione a 460 nm –Vantaggi: più basso limite di rivelazione teorico –Svantaggi: interferenze della matrice che producono un alto segnale di fondo TEST OTTICO DI WARBURG Tra le deidrogenasi NAD e NADP dipendenti di interesse Clinico: sorbitolo deidrogenasi, malato deidrogenasi, Glucosio 6-fosfato deidrogenasi eritrocitaria, piruvato chinasi.

37 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Sali di tetrazolio Composti cromogenici che vengono ridotti a formazani caratterizzati da valori elevati del coefficiente di assorbività molare  Misura mediante derivati chimici N R3CR3C NR 2 N+R1N+R1 N Cl - N CR 3 R2NR2N + N N N R3CR3C NR 2 N+N+ N RxRx RyRy 2Cl - Sale monotetrazolicoSale ditetrazolico R = gruppi aromatici

38 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Sali di tetrazolio Esempio: alcol deidrogenasi Il valore di  dei formazani è 2-4 volte più alto di quello del NAD(P)H, perciò si ottengono limiti di rivelazione 2-3 volte più bassi (A =  bc) Etanolo Acetaldeide NAD + NADH + H + PMS PMSH Prodotto di riduzione (formazano) Sale di tetrazolio PMS = fenazina metasolfato Alcol deidrogenasi Misura mediante derivati chimici

39 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA ENZIMA + SUBSTRATO REAZIONE IN CORSO PRELIEVO DI ALIQUOTE AD INTERVALLI DI TEMPO E 1 + S  E 1 + P P-X metodi colorimetrici Quantificazione con HPLC Trasformazione in un composto che può essere quantificato colorimetricamente o in altro modo 1 a FASE 2 a FASE X E2E2 Metodi radioisotopici SAGGI DISCONTINUI

40 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA MISURE CINETICHE O END-POINT Determinazione di Plasminogeno nel sangue umano citralato 1.Plg + SK/Fib (eccesso) → (Plg Sk/Fib) (Plg Sk/Fib) 2. Substrato Plg → Peptide + pNA Rilascio di p-nitroanilina misurato a 405 nm è proporzionale al Plg nel plasma Aggiungere nei pozzetti della micropiastra: Campioni/controlli/standard diluiti 50 μL Incubare a 37°C per 3-4 minuti Reagente Streptochinasi (pre-riscaldato a 37°C) 50 μL Miscelare e incubare a 37°C per 3 minuti Substrato cromogenico (pre-riscaldato a 37°C) 50 μL A. Metodo cinetico: leggere il ΔA/min a 405 nm per secondi. B: Metodo end-point: procedere come seque: Miscelare e incubare a 37°C per 3 minuti Acido acetico al 20% o acido citrico al 2% 50 μL Miscelare

41 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA enzimi attivi nel plasma (fattori della coagulazione) enzimi attivi in fluidi extra-cellulari (ad esempio, enzimi digestivi) enzimi del metabolismo cellulare –ubiquitari –organo (tessuto)-specifici ENZIMI PLASMATICI DA DOSARE

42 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Alterata sintesi variazione della quantità di tessuto variazione nella permeabilità cellulare Alterazione nella velocità di inattivazione/ degradazione Ostruzione di una normale via di escrezione Altri fattori (inibitori, carenza di cofattori...) VARIAZIONE ENZIMI PLASMATICI DOVUTE A :

43 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA ISOENZIMI Gli enzimi non hanno una struttura omogenea Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano diverse proprietà molecolari e/o diverse proprietà funzionali -METODI NON SELETTIVI -METODI SELETTIVI

44 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI Metodi elettroforetici Metodi cromatografici Metodi di elettrofocalizzazione METODI NON SELETTIVI

45 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI METODI SELETTIVI Inibizione chimica Ioni metallici, fluoruri, etanolo, solventi organici,… Inibizione fisica Determinazione degli isoenzimi della fosfatasi alcalina e lattato deidrogenasi Inibizione immunologica Anticorpi Reattività selettiva verso un substrato Determinazione di LDH 1

46 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Infarto miocardico

47 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH: LDH1 4 subunità H LDH2 3 subunità H e da una M (H3M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone) LDH3 (H2M2) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) (fegato e muscoli scheletrici) ISOENZIMI

48 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Diagnosi differenziale di infarto del miocardio e epatite acuta ISOENZIMI

49 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Esochinasi (HK) e glucochinasi (GK) Glucosio + ATP  Glucosio-6-fosfato + ADP  glucosio  in sangue: 5 mM, intracellulare: mM Muscolo: HK –Inibita da Glucosio-6-fosfato –Utilizzo di glucosio indipendente da  glucosio  in sangue Epatociti: GK –Non inibita da Glucosio-6-fosfato –Trasformazione di glucosio in glicogeno dipendente da  glucosio  in sangue Pancreas: GK –Non inibita da Glucosio-6-fosfato –Sensore di  glucosio  in sangue per la produzione di insulina

50 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Isoenzimi della Fosfatasi Alcalina

51 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA

52 Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche 1/[S] 1/V 0 1/K M 1/V max V max [S] KMKM V max /2 Grafico di Lineweaver-Burk V0V0

53 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Inibizione competitiva I simile a S, compete con S per il sito attivo di E Inibizione reversibile all’aumentare di [S] V max non cambia, K M aumenta V max 1/[S] 1/v 0  1/K M 1/V max [S] v0v0  inibitore  inibitore  KM KM V max /2 INIBITORI

54 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Inibizione non competitiva INIBITORI I reagisce su un sito diverso dal sito attivo Tende a disattivare E Inibizione non reversibile all’aumentare di [S] K M non cambia, V max diminuisce 1/K M 1/[S] 1/v 0  1/V max [S] v0v0  inibitore  inibitore  V max KMKM  V max /2

55 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Inibizione uncompetitiva INIBITORI L’inibitore reagisce con il complesso ES Cambiamenti simultanei di K M e V max 1/K M V max [S]KMKM 1/[S] 1/V 0 1/V max V0V0 + inibitore

56 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI Gli enzimi non sono l’oggetto dell’analisi, ma vengono utilizzati come “strumenti” analitici per determinare la concentrazione degli analiti di interesse Vantaggi –L’elevata specificità degli enzimi per i loro substrati consente spesso l’analisi diretta dei campioni biologici, senza o con poche e semplici fasi di estrazione e purificazione –L’elevato potere catalitico degli enzimi fa sì che i metodi enzimatici siano caratterizzati da bassi limiti di rivelazione, il che rende sufficienti volumi molto piccoli di campione Maggiore rapiditàMaggiore accuratezza Risparmio di reagenti Prelievo di piccoli volumi di fluidi biologici

57 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI METODI A PUNTO FINALE Semplici accoppaiti

58 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA METODI A PUNTO FINALE SEMPLICI È sufficiente una sola reazione enzimatica per la determinazione della concentrazione dell’analita di interesse S E ind. P –Queste condizioni non sono sufficienti per garantire che il substrato venga consumato completamente  Condizioni sperimentali –Enzima indicatore in eccesso –pH e Temperatura ottimali

59 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI È necessario accoppiare alla prima reazione enzimatica una o più reazioni enzimatiche per la determinazione della concentrazione dell’analita di interesse –La reazione indicatrice svolge anche la funzione di rimuovere continuamente i prodotti di reazione man mano che si formano, garantendo lo spostamento verso destra della reazione ed il consumo completo del substrato  Condizioni sperimentali –Enzimi indicatore ed ausiliario in eccesso –pH e Temperatura ottimali S E aus. P1P1 E ind. P2P2

60 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA ANALISI ENZIMATICA DI SUBSTRATI Determinazione dell’etanolo nel siero del sangue: CH 3 -CH 2 -OH + NAD +  CH 3 CHO + NADH + H + ++ H2OH2O semicarbazidesemicarbazone Alta concentrazione di NAD +, un alto pH o si accoppia la reazione ad una reazione irreversibile:

61 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Tipo di campione Possono essere utilizzati siero, plasma (con EDTA, citrato, fluoruro/ossalato o eparina) oppure urina. Non utilizzare alcool come disinfettante durante la raccolta o la conservazione dei campioni ematici. Raccogliere campioni di urina in contenitori puliti di plastica o vetro. Centrifugare i campioni di urina che, prima dell’analisi, appaiono molto torbidi. Tappare ermeticamente i campioni per evitare l’evaporazione di alcool. Precauzioni Per i campioni di urina al di fuori del normale intervallo previsto per il pH urinario o al di sotto della normale concentrazione di creatinina nell’urina si deve sospettare un’adulterazione. Un’adulterazione del campione di urina può portare a risultati errati. Se si sospetta un’adulterazione del campione, prelevare un altro campione. I campioni umani devono essere maneggiati e smaltiti come campioni potenzialmente infetti. Conservazione I campioni di siero e di plasma possono essere conservati per 14 giorni a °C o a 2…8°C con o senza conservante, per periodi di conservazione superiori, congelati a –20°C. Si raccomanda di usare campioni di urina prelevati di recente. Se non vengono analizzati immediatamente, i campioni di urina possono essere conservati per almeno una settimana a 2…8 ー C, per periodi di conservazione superiori, congelati a –20 ー C. Tappare ermeticamente i campioni per evitare l’evaporazione di alcool. Misurare i campioni immediatamente dopo il loro inserimento nell’analizzatore. ANALISI ENZIMATICA DI SUBSTRATI FASE PRE-ANALITICA

62 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Per le procedure automatiche consultare il manuale d’uso e le note applicative dell'analizzatore Konelab. Tutte le applicazioni non esplicitamente approvate da Thermo Electron Oy, non possono essere garantite in termini di prestazioni e dovranno pertanto essere valutate dall'utilizzatore. Materiali inclusi nel kit I reagenti sopra descritti. Materiali necessari ma non inclusi nel kit Calibratori e controlli indicati di seguito. Calibrazione Il set contiene: 1 x 5 ml Livello E0, calibratore negativo 1 x 5 ml Livello E1, 1.0 g/l (100 mg/dl) alcool etilico. Se inutilizzati, i calibratori devono essere chiusi ermeticamente e refrigerati a una temperatura di 2…8 ー C per evitare l’evaporazione di alcool. Calibrare il metodo immediatamente dopo l’inserimento dei calibratorinnell’analizzatore.Tracciabilità: Fare riferimento all'inserto nella confezione dei calibratori. Controllo di qualità Utilizzare i campioni del controllo di qualità almeno una volta al giorno, dopo ogni calibrazione e ogni volta che si utilizza un nuovo flacone di reagente. Controlli disponibili: Set controllo E DoA, codice Il set contiene: 1 x 5 ml Livello 1 E, 0.5 g/l (50 mg/dl) alcool etilico 1 x 5 ml Livello 2 E, 3.0 g/l (300 mg/dl) alcool etilico Se inutilizzati, conservare i controlli ermeticamente chiusi e refrigerati a 2…8 ー C per evitare l’evaporazione di alcool. Misurare i controlli immediatamente dopo il loro inserimento nell’analizzatore. Gli intervalli e i limiti del controllo devono essere adattati ai requisiti dei singoli laboratori. I risultati dei campioni del controllo di qualità devono rientrare nei limiti di variabilità stabiliti a priori dal laboratorio. CALCOLO DEI RISULTATI I risultati vengono calcolati automaticamente dall’analizzatore Konelab in base ad una curva di calibrazione. FASE ANALITICA E POST-ANALITICA ANALISI ENZIMATICA DI SUBSTRATI

63 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA INTERVALLO DI MISURAZIONE g/l ( mg/dl) I campioni con una concentrazione alcolica superiore a 3.5 g/l o 350 mg/dl possono essere diluiti con il calibratore negativo E0. Ripetere il dosaggio e moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione per ottenere la concentrazione effettiva. Limite di rilevabilità 0.1 g/l (10 mg/dl) Il limite di rilevabilità rappresenta la più bassa concentrazione misurabile quantitativamente. Imprecisione FASE ANALITICA E POST-ANALITICA

64 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA

65 Metodo di confronto Sono stati eseguiti studi comparati utilizzando un analizzatore Konelab 60 e i seguenti metodi come riferimento (x): 1) Siero: Metodica enzimatica disponibile in commercio (x) regressione lineare (g/l): y = 1.03x – 0.02 r = n = 60 Le concentrazioni del campione erano comprese fra 0 e 3.0 g/l. 2) Urina: Metodica GC disponibile in commercio (x) Regressione lineare (g/l): y = 0.93 x – 0.02 r = n = 47 Le concentrazioni dei campioni erano comprese tra 0 e 2.7 g/l (GC). I risultati ottenuti nei singoli laboratori possono differire dai dati sulle prestazioni riportati. Specificità Sono stati testati per cross-reattività nel dosaggio vari composti organici strutturalmente correlati.

66 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Determinazione della concentrazione di glucosio nel siero del sangue: GLUCOSIO OSSIDASI b- D -glucosio + O 2  D-gluconolattone + H 2 O 2 PEROSSIDASI H 2 O 2 + ABTS + 2H +  ABTS ossidato + 2 H 2 O (incolore) (assorbe a 610 nm) ABTS (2,2’-azino-di[3-etilbenzotiazolina acido solfonico]) ANALISI ENZIMATICA DI SUBSTRATI

67 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Rapid Enzymatic Tests for Glucose Introduction: Reagent strips have been designed to perform rapid and semi-quantitative analysis for glucose. They are easy to use and require no addition laboratory equipment of reagents. Three reagent strips, Clinistix, Dextrostix and Diastix, will be used. The enzymatic reactions involved are as described below. Step 1: Glucose Glucose Oxidase Glucose > Gluconic Acid + H2O2 Step 2: Clinistix and Dextrostix: H2O2 + chromogen orthotolidine- Peroxidase H2O2 + chromogen orthotolidine > oxidized orhotolidine Diastix: H2O2 + Potassium iodide ---Peroxidase H2O2 + Potassium iodide > iodine complex The intensity of the color gives a semi-quantitative analysis of the level of glucose in the samples. Materials: Please refer to class notes and p b of the Laboratory Manual. Bottles of Reagent Strips Instead of blood and urine samples, Sample Solutions A, B, and C will be used Procedure: Clinistix: · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 10 seconds, compare to colour chart provided Dextrostix: · Add a drop of sample solution to the test strip · After exactly 60 seconds, wash with water for 2 second (water bottle) · Blot once gently · Compare to colour chart immediately Diastix: · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 30 seconds, compare to colour chart

68 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA ENZIMI IMMOBILIZZATI UN ESEMPIO: GLUCOMETRO

69 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Test invasivi Test non invasivi Esempi di glucometri

70 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Tipo di Test: glicemia su sangue intero capillare metodo: elettrochimico enzima: glucosio ossidasi sistema di riferimento: sangue intero Campione di sangue: 2 µL (microlitri) Intervallo di misura: mg/dL * Tempo di analisi: 30 secondi Memoria: 20 risultati memorizzati (glicemia e test di controllo) Nota: se in memoria sono già presenti 20 risultati e ne viene aggiunto uno nuovo, il risultato più vecchio viene automaticamente cancellato. Temperatura di lavoro: 10° - 40°C Umidità ambientale: % (umidità relativa) Programmazione: mediante apposita striscia di programmazione Alimentazione: 2 batterie al litio da 3 Volt (CR2032) Durata delle batterie: autonomia per determinazioni circa Certificazione CE: il sistema risulta conforme alla direttiva IVDD 98/79/CE Classe tecnologica: 2b Controllo Qualità: soluzioni di glucosio a titolo noto ELITE™ Control Dimensioni: 81 x 51 x 14 mm Peso: 50 grammi circa Contenuto confezione: 1 strumento, 1 custodia, 1 striscia di verifica, 2 batterie, 1 pungidito MICROLET®, 5 lancette sterili monouso MICROLET®, manuale d’uso del sistema Garanzia strumento: 3 anni dalla data di acquisto Produttore: Bayer Consumer Care AG Postfach 4002 Basel Switzerland Distributore: Bayer Spa Viale Certosa, Milano Italy Esempi di glucometri

71 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA ENZYME CYCLING Glucosio-6-fosfato Acido-6-fosfogluconico NADPHNADP + Acido ossoglutarico + NH 4 + Acido L-glutamminico G6PDH GDH Aumento della sensibilità del metodo

72 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Bile acids Oxidized bile acids NADH + H+ + NBT NAD+ + formazan 3-  HSD NAD+ NAD + H+ Determinazione acidi biliari Enzymatic assay

73 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Bile acids Oxidized bile acids Thio-NADThio-NADH 3-  HSD NADH NAD Determinazione acidi biliari Enzymatic cycling assay

74 FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA ANALITICA CLINICA Reagent format Lyophilized powder Liquid stable Detection  nm 405nm Sample volume 20  L 3-5  L Interference by lipemic samples yes no Interference by hemolytic samples yes no Instrument contamination yes no Enzymatic assayEnzymatic cycling Determinazione acidi biliari Confronto dei metodi


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