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Biologia Molecolare e Biochimica Monica Bianchini Dipartimento di Ingegneria dellInformazione e Scienze Matematiche 1 La scienza.

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Presentazione sul tema: "Biologia Molecolare e Biochimica Monica Bianchini Dipartimento di Ingegneria dellInformazione e Scienze Matematiche 1 La scienza."— Transcript della presentazione:

1 Biologia Molecolare e Biochimica Monica Bianchini Dipartimento di Ingegneria dellInformazione e Scienze Matematiche 1 La scienza non può risolvere il mistero ultimo della natura. E ciò perché, in ultima analisi, noi stessi facciamo parte del mistero che stiamo cercando di risolvere. ( M. Planck )

2 Sommario Introduzione Il materiale genetico Struttura del gene e contenuto informativo Struttura e funzione proteica La natura dei legami chimici Strumenti per la biologia molecolare Contenuto informativo del genoma 2

3 Introduzione 1 La caratteristica dominante degli organismi vi- venti è la loro capacità di conservare, utilizzare e trasmettere le informazioni Bioinformatica La Bioinformatica mira a: determinare quali informazioni sono biologicamente significative decifrare come vengono usate per il controllo della chimica degli organismi viventi 3

4 Introduzione 2 Bioinformatica BiologiaInformatica nuove tecnologie La Bioinformatica è una disciplina che si situa allincrocio tra la Biologia, lInformatica e le nuove tecnologie È caratterizzata dallapplicazione di metodi mate- matici, statistici, computazionali allanalisi di dati biologici, biochimici e biofisici DNA dati proteici Principale soggetto di studio è il DNA, ma con il diffondersi di tecniche sempre più economiche ed efficaci per acquisire dati proteici, anchessi sono diventati disponibili allanalisi bioinformatica 4

5 Introduzione 3 Bioinformatica Nella Bioinformatica, si possono individuare tre principali sottosettori: Sviluppo e implementazione di strumenti per conservare, analizzare e gestire dati Creazione di biobanche, database management Analisi e interpretazione dei dati per individuare informazioni Data mining Sviluppo di nuovi algoritmi per estrarre/verificare le relazioni tra un gran numero di informazioni Metodi statistici, intelligenza artificiale 5

6 Introduzione 4 Bioinformatica La Bioinformatica è quindi… linsieme di metodi e strumenti informatici e delle ricerche di base e applicate che li utilizzano, che si sviluppano nei diversi settori della Biologia, della Chimica e della Medicina Bioinformatica Sono oggetto della Bioinformatica: le tecniche di realizzazione di banche dati utili alla ricerca biomedica ed i software necessari per la loro interrogazione gli strumenti, tipici dellintelligenza artificiale e della statistica, che consentono lanalisi di tali dati e lindividuazione/estrazione automatica di informa- zioni originali 6

7 Il materiale genetico 1 DNAacido desossiribonucleicomateriale genetico Il DNA (acido desossiribonucleico) è il materiale genetico È infatti linformazione contenuta nel DNA che permette lorganizzazione di molecole inanimate in cellule viventi e in organismi capaci di regolare la propria composizione chimica interna e la propria crescita e riproduzione geni È inoltre il DNA che ci garantisce lereditarietà delle caratteristiche somatiche dei nostri avi, tramite la trasmissione dei geni 7

8 Il materiale genetico 2 sequenze nucleotidiche I geni contengono linformazione, sotto forma di specifiche sequenze nucleotidiche che costituisco- no le molecole del DNA basi azotateguaninaadeninatiminacitosina gruppo fosfato zucchero desossiribosio nucleotide Le molecole del DNA utilizzano solo quattro basi azotate, guanina, adenina, timina e citosina (G,A,T,C), a cui sono attaccati un gruppo fosfato (PO 4 ) ed uno zucchero desossiribosio (C 5 H 10 O 4 ), a formare un nucleotide CitosinaGuaninaAdeninaTimina 8

9 Il materiale genetico 3 Tutta linformazione contenuta nei geni deriva dal- lordine in cui i quattro nucleotidi si trovano lungo la molecola di DNA Geni complicati possono essere composti da centinaia di nucleotidi genoma Il codice genetico di un organismo, detto genoma, è conservato in milioni/miliardi di nucleotidi Struttura chimica dellAdenosina 5 monofosfato: ogni nucleotide è composto da tre parti, un gruppo fosfato, uno zucchero desossiribosio centrale ed una delle quattro basi azotate 9

10 Il materiale genetico 4 catene polinucleotidiche cromosoma Stringhe di nucleotidi possono essere unite tra loro a formare lunghe catene polinucleotidiche e, su larga scala, un cromosoma legami fosfodiestere Lunione di due nucleotidi avviene attraverso la formazione di legami fosfodiestere, che uniscono il gruppo fosfato di un nucleotide allo zucchero desossiribosio di un altro nucleotide estere I legami estere coinvolgono collegamenti mediati da atomi di ossigeno I legami fosfodiestere si hanno quando un atomo di fosforo di un gruppo fosfato lega due molecole tramite due legami estere 10

11 Il materiale genetico 5 I nucleotidi del DNA sono uniti tra loro mediante legami covalenti fra i gruppi ossidrile ( OH) in 5 e 3: lalternanza dei residui fosfato e dei pentosi forma lo scheletro degli acidi nucleici 11

12 Il materiale genetico 6 Tutti gli esseri viventi formano legami fosfodie- stere esattamente allo stesso modo pentosio Ognuno dei cinque atomi di carbonio del desossi- ribosio pentosio ha assegnato un numero dordine (da 1 a 5) 12

13 Il materiale genetico 7 I gruppi fosfato di ogni nucleotide libero si trova- no sempre legati al carbonio 5 dello zucchero I gruppi fosfato fanno da ponte tra il carbonio 5 del desossiribosio di un nuovo nucleotide e il carbo- nio 3 di una catena polinucleotidica preesistente Una stringa di nucleotidi termina sempre con un carbonio 5, mentre allaltra terminazione della molecola vi è un carbonio 3 libero Lorientamento della molecola del DNA è fonda- mentale per decifrare il contenuto informativo della cellula 13

14 Il materiale genetico 8 Un tema comune a tutti i siste- mi biologici, ed a tutti i livelli, è lidea che struttura e funzione siano intimamente correlate J.WatsonF. Crick La scoperta di J. Watson e F. Crick (1953) che la molecola di DNA allinterno delle cellule so- litamente esistesse come mole- cola a doppio filamento fornì un inestimabile indizio su come il DNA potesse agire come mate- riale genetico 14 J. Watson e F. Crick (Nobel per la Medicina con M. Wilkinson, 1962)

15 Il materiale genetico 9 Il DNA è dunque costituito da due filamenti e linformazione contenuta in un filamento è ridondante rispetto allinfor- mazione contenuta nellaltro Il DNA può essere replicato e trasmesso fedelmente da una generazione allaltra separan- do i due filamenti e usandone ciascuno come stampo per la sintesi di un nuovo filamento 15

16 Il materiale genetico 10 Durante la duplicazione del DNA, il doppio filamento viene separato per mezzo dellelicasi; ogni filamento di DNA serve come stampo per la sintesi di un nuovo filamento, prodotto grazie alla DNA polimerasi 16 (Single Strand Binding Protein)

17 Il materiale genetico 11 Più esattamente: linformazione contenuta nei due filamenti del DNA è complementare Per ogni G di un filamento si trova una C sul filamento complementare e viceversa Per ogni A di un filamento si trova una T sul filamento complementare e viceversa Linterazione tra G e C e tra A e T è specifica e stabile Nello spazio presente fra due filamenti di DNA (11 Å), la guanina, con la sua struttura a doppio anello, è troppo grande per accoppiarsi con il doppio anello delladenina o di unaltra guanina La timina, con la sua struttura ad anello singolo, è troppo piccola per interagire con unaltra base a singolo anello (citosina o timina) 17

18 Il materiale genetico 12 Lo spazio tra i due filamenti di DNA non è una barriera allinterazione tra G e T, né tra A e C, ma la loro natura chimica le rende incompatibili Tre legami idrogeno Due legami idrogeno 18 Linterazione chimica che si forma tra i due diversi tipi di coppie è così stabile ed energeticamente favorevole che da sola è responsabile dellunione dei due filamenti complementari

19 Il materiale genetico 13 antiparalleli I due filamenti della molecola di DNA non hanno lo stesso orientamento (5/3): sono antiparalleli, con lestremità 5 di un filamento che corrisponde allestremità 3 del filamento complementare e viceversa 19

20 Il materiale genetico 14 Esempio Se la sequenza nucleotidica di un filamento è 5GTATCC3, la sequenza del filamento comple- mentare sarà 3CATAGG5 (o, per convenzione, 5GGATAC3) upstream downstream Sequenze caratteristiche poste in posizione 5 rispetto ad un dato punto di riferimento sono comunemente definite upstream (a monte), quel- le in posizione 3 si dicono invece downstream (a valle) 20

21 Il dogma centrale della biologia molecolare 1 enzimicataliz- zatori Benché la specifica sequenza nucleotidica di una molecola di DNA contenga importanti informa- zioni, sono gli enzimi che, agendo come cataliz- zatori, compiono il lavoro di modifica della chimi- ca della cellula I catalizzatori sono molecole che permettono a specifiche reazioni chimiche di procedere più velocemente: non si consumano, né si alterano, e possono quindi essere utilizzati più volte per catalizzare la stessa reazione 21

22 geni I geni contengono le istruzioni necessarie per realizzare i catalizzatori enzimatici prodotti dalla cellula Il processo di estrazione dellinformazione dalla sequenza nucleotidica di un gene per la costru- zione degli enzimi è comune a tutti gli esseri viventi linformazione conservata nel DNA è utilizzata per sintetizzare una molecola transitoria polinucleotide a singolo filamento, det- ta RNA (acido ribonucleico), che è a sua volta utilizzata per sintetizzare le proteine Più in dettaglio: linformazione conservata nel DNA è utilizzata per sintetizzare una molecola transitoria polinucleotide a singolo filamento, det- ta RNA (acido ribonucleico), che è a sua volta utilizzata per sintetizzare le proteine 22 Il dogma centrale della biologia molecolare 2

23 trascrizione RNA polimerasi Il processo di copia di un gene in RNA è chiamato trascrizione ed è realizzato attraverso lattività enzimatica di una RNA polimerasi uracile Corrispondenza unoaduno tra i nucleotidi G, A, U (uracile), C dellRNA e G, A, T, C del DNA traduzione ribosoma Il processo di conversione dalla sequenza nucleo- tidica dellRNA alla sequenza aminoacidica che costituisce le proteine è chiamato traduzione, ed è svolto da un complesso di proteine ed RNA, detto ribosoma 23 Il dogma centrale della biologia molecolare 3 DNA-polimerasi RibosomiRNA-polimerasi

24 Trascrizione da DNA a RNA tramite RNA polimerasi 24 Il dogma centrale della biologia molecolare 4

25 La struttura del gene 1 Tutte le cellule interpretano le istruzioni gene- tiche allo stesso modo, grazie alla presenza di segnali specifici usati come segni di interpunzione fra geni Il linguaggio del DNA è stato elaborato allinizio della storia della vita sulla terra ed ha subito poche modifiche nel corso di milioni di anni Sia gli organismi procarioti (batteri), sia gli eucarioti (organismi complessi) utilizzano lo stes- so alfabeto di nucleotidi e lo stesso formato ed approccio per immagazzinare e utilizzare linfor- mazione genetica 25

26 La struttura del gene 2 Struttura di una cellula procariotica (a sinistra) e di una cellula eucariotica animale (a destra) 26

27 La struttura del gene 3 espressione genica Lespressione genica è il processo che utilizza linformazione conservata nel DNA per costruire una molecola di RNA che codifica a sua volta una proteina Costo energetico significativo per la cellula Gli organismi che esprimono proteine inutili competono sfavorevolmente per la sopravvivenza rispetto agli organismi che regolano la propria espressione genica in modo più efficace Le RNA polimerasi sono responsabili dellattiva- zione dellespressione genica attraverso la sintesi di copie di RNA del gene 27

28 La struttura del gene 4 Le RNA polimerasi devono: distinguere in modo affidabile linizio del gene determinare quali geni codificano proteine necessarie LRNA polimerasi non può cercare un particolare nucleotide perché ogni nucleotide si trova casual- mente in qualsiasi parte del DNA Le RNA polimerasi procariotiche esaminano una sequenza di DNA cercando uno specifico insieme di 13 nucleotidi 1 nucleotide serve come sito dinizio per la trascrizione 6 nucleotidi sono posti 10 nucleotidi a monte del sito dinizio 6 nucleotidi sono posti 35 nucleotidi a monte del sito dinizio Sequenza promotrice del gene 28

29 La struttura del gene 5 Poiché i genomi procariotici sono lunghi solo pochi milioni di nucleotidi, le sequenze promo- trici, che si possono trovare casualmente solo una volta ogni 70 milioni di nucleotidi, permet- tono allRNA polimerasi di identificare in modo statisticamente affidabile linizio del gene Il genoma degli eucarioti è di diversi ordini di grandezza più lungo: le RNA polimerasi devono riconoscere sequenze promotrici più lunghe e complesse per individuare linizio di un gene 29

30 La struttura del gene 6 Due biochimici francesi, F. Jacob e J. Monod, furono i primi ad ottenere evidenza sperimentale su come le cellule distinguano tra geni che debbano o meno essere trascritti Il loro lavoro sulla regolazione dei geni procariotici (Nobel 1965) rivelò che lespressione dei geni strutturali (che codificano per proteine coinvolte nella struttura o nel metabolismo cellulare) è controllata da specifici geni regolatori Le proteine codificate dai geni regolatori sono in grado di legarsi al DNA cellulare solo vicino alla sequenza promotrice e solo se lo richiede linterazione con lam- biente esterno dei geni strutturali la cui espressione esse controllano 30

31 La struttura del gene 7 regolazio ne positivanegativa Quando il legame fra DNA e proteine rende più facile linizio della trascrizione da parte dellRNA polimerasi, si dice che è avvenuta una regolazio- ne positiva, negativa quando il legame impedisce invece la trascrizione I geni strutturali procariotici sono attivati/disattivati da una o due proteine regolatrici Gli eucarioti utilizzano un complesso di sette (o più) proteine 31

32 Il codice genetico 1 aminoacidi Mentre i nucleotidi sono le unità fondamentali utilizzate dalla cellula per conservare le informa- zioni (DNA) e per costruire le molecole atte a trasferirle (RNA), gli aminoacidi sono le unità fondamentali costitutive delle proteine La funzione di una proteina è fortemente dipen- dente dallordine in cui gli aminoacidi sono legati dai ribosomi durante la traduzione Struttura chimica di un aminoacido: il gruppo amminico, il carbonio, ed il gruppo carbossilico sono identici per tutti gli aminoacidi, che si differenziano invece in base al gruppo R (catena laterale) 32

33 Il codice genetico 2 Tuttavia, se per costruire le molecole di DNA ed RNA vengono utilizzati solo 4 nucleotidi, per la sintesi delle proteine si hanno 20 aminoacidi 33

34 Il codice genetico 3 Pertanto, non vi può essere corrispondenza uno auno tra i nucleotidi dei geni e gli aminoacidi delle proteine che essi codificano, ne vi può essere corrispondenza fra coppie di nucleotidi (16 al più) e aminoacidi È necessario che i ribosomi utilizzino un codice a triplette codone Con tre sole eccezioni, ogni gruppo di tre nucleotidi, un codone, in una copia di RNA della porzione codificante di un gene corrisponde ad uno specifico aminoacido codoni di stop I tre codoni che non indicano al ribosoma di inserire un aminoacido sono i codoni di stop 34

35 Il codice genetico 4 35 Per un limitato numero di geni batterici, il codone UGA codifica un ventunesimo aminoacido, la selenocisteina; un ventiduesimo aminoacido, la pirrolisina, è codificata da UAG in qualche specie batterica ed eucariotica

36 Il codice genetico 5 Gli aminoacidi sono classificati in quattro diverse categorie Gruppi R non polariidrofobici Gruppi R non polari, idrofobici: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina Gruppi R polariidrofilici Gruppi R polari, idrofilici: serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina, glutammina Acidi Acidi (carica elettrica negativa): acido aspartico, acido glutammico Basici Basici (carica elettrica positiva): lisina, arginina, istidina 36

37 Il codice genetico 6 37

38 Il codice genetico 7 degenerazione Ben 18 aminoacidi su 20 sono codificati da più di un codone: questa caratteristica del codice gene- tico è detta degenerazione Un singolo cambiamento allinterno di un codone non è di solito sufficiente a causare la codifica di un aminoacido di categoria diversa Ovvero, durante la replicazione/trascrizione del DNA si possono compiere errori che non hanno effetto sulla composizione aminoacidica della proteina Il codice genetico è molto robusto e minimizza le conseguenze dei possibili errori presenti nella sequenza nucleotidica, evitandone il ripercuotersi sulla funzione della proteina codificata 38

39 Il codice genetico 8 La traduzione, ad opera dei ribosomi, avviene a partire da un sito dinizio, posto sulle copie di RNA di un gene, e procede fino al primo codone di stop codone dinizio AUG Il codone dinizio è costituito dalla tripletta AUG (che codifica anche la metionina), sia negli eucarioti che nei procarioti cornice di lettura La traduzione è accurata solo quando i ribosomi esaminano i codoni allinterno della cornice di lettura (delimitata da codone diniziocodone di stop) Lalterazione della cornice di lettura di un gene cambia ogni aminoacido posto a valle dellalterazione stessa e causa solitamente la produzione di una versione troncata della proteina 39

40 Il codice genetico 9 La maggior parte dei geni codificano per proteine lunghe centinaia di aminoacidi Dato che, in una sequenza generata casualmente, i codoni di stop si hanno circa ogni 20 triplette (3 codoni su 64), le cornici di lettura dei geni presentano solitamente sequenze molto lunghe in cui non si presentano codoni di stop Cornici di lettura aperte Open Reading Frame ORF Cornici di lettura aperte (Open Reading Frame ORF): sono una caratteristica distintiva di molti geni procariotici ed eucariotici 40

41 Introni ed esoni 1 mRNA Le copie di RNA messaggero, mRNA, dei geni procariotici corrispondono perfettamente alle sequenze di DNA presenti nel genoma, con leccezione dellura- cile, che viene utilizzato al posto della timina, mentre le fasi di trascrizione e traduzione sono parzialmente sovrapposte Negli eucarioti, le due fasi dellespressione genica sono fisicamente separate dalla membrana nucleare: la trascrizione avviene nel nucleo, la traduzione solo dopo che lmRNA è stato trasportato nel citoplasma Le molecole di RNA trascritte dalla polimerasi eucariotica possono essere modificate prima che i ribosomi le traducano 41

42 Introni ed esoni 2 Molti geni eucariotici hanno un numero di introni assai elevato Esempio: Esempio: il gene associato al- la fibrosi cistica ha 24 introni ed è lungo più di un milione di coppie di basi, mentre lmRNA tradotto dai ribosomi è costi- tuito da circa mille coppie di basi splicing introniesoni La modificazione più evidente che subisce il trascritto primario dei geni eucariotici è lo splicing, che prevede il taglio degli introni ed il ricongiungimento degli esoni che li affiancano 42

43 Introni ed esoni 3 43

44 Introni ed esoni 4 La grande maggioranza degli introni eucariotici è conforme alla regola GTAG, secondo cui gli introni iniziano con il dinucleotide GT e terminano con il dinucleotide AG Il fallimento del corretto splicing degli introni dal trascritto primario di RNA eucariotico può: introdurre uno spostamento della cornice di lettura generare un incontro prematuro con un codone di stop Inutilizzabilità della proteina tradotta 44

45 Introni ed esoni 5 splicesoma Le coppie di nucleotidi sono statisticamente troppo frequenti per essere considerate un segnale sufficiente per il riconoscimento degli introni da parte dello splicesoma Si esaminano altri sei nucleotidi addizionali alle termi- nazioni 5 e 3, che possono essere diversi per cellule diverse Splicing alternativo Splicing alternativo: incremento della diversità proteica causato da modificazione dello splicesoma e delle proteine accessorie responsabili del riconoscimento del vicinato degli introni/esoni 45

46 La funzione delle proteine proteine I compiti delle proteine sono incredibilmente diversificati proteine strutturalicollagene Le proteine strutturali, come il collagene, forniscono supporto alle ossa ed ai tessuti connettivi enzimi pepsina Gli enzimi agiscono come catalizzatori biologici, come la pepsina che regola il metabolismo emoglobina insuli na rodopsina Le proteine sono inoltre responsabili del trasporto di atomi e molecole nellorganismo (emoglobina), dei segnali e delle comunicazioni intercellulari (insuli- na), dellassorbimento dei fotoni per i processi visivi (rodopsina), etc. 46

47 La struttura primaria 1 Seguendo le istruzioni contenute nellmRNA, le proteine vengono tradotte dai ribosomi in un polimero lineare (catena) di aminoacidi I 20 aminoacidi hanno una struttura chimica simile e si diversificano solo in base al gruppo R catena principale catene laterali La regione costante di ogni aminoacido è detta catena principale, mentre i diversi gruppi R vanno a costituire le catene laterali struttura primaria Lordine in cui i diversi aminoacidi sono assem- blati in una proteina ne costituisce la struttura primaria 47

48 La struttura primaria 2 La catena proteica ha una direzione Unestremità della catena ha un gruppo amminico libero (NH), mentre laltra estremità termina con un gruppo carbossilico (COOH) terminale amminico terminale carbossilico La direzione della catena va dal terminale amminico (che è il primo ad essere sintetizzato) fino al terminale carbossilico 48

49 La struttura primaria 3 struttura nativa Dopo la traduzione, la proteina collassa, cioè si piega e si modella in una complessa struttura globulare, assumendo la struttura nativa, che dipende comunque dalla disposizione degli amino- acidi nella catena primaria La struttura nativa definisce la funzionalità della proteina 49

50 La chimica stessa della catena principale di una proteina ne forza la forma fondamentalmente planare Questi due legami permettono una rotazione circolare, dando origine agli angoli diedri ( e ) Tutte le varie conformazioni in cui può ripiegarsi la proteina derivano da tali rotazioni La struttura primaria 4 I soli segmenti mobili della catena principale sono i legami fra lazoto ed il carbonio e tra il carbonio ed il carbonio carbonile 50

51 La struttura secondaria 1 Lesame della struttura delle proteine conosciute rivela che esiste un piccolo numero di motivi strutturali locali comuni struttura secondaria La posizione e la direzione di tali motivi strutturali regolari definiscono la struttura secondaria della proteina elica foglietto Le strutture più comuni sono lelica (che ha for- ma elicoidale simile ad una molla, 60°, 3.6 aminoacidi per giro) ed il foglietto (135°,135°) 51

52 La struttura secondaria 2 Foglietto Foglietto elicaelica 52

53 Strutture terziaria e quaternaria struttura terziaria Le regioni di struttura secondaria di una proteina si impacchettano insieme e si combinano con altre regioni meno strutturate della catena principale a formare una figura tridimensionale che è chiama- ta struttura terziaria della proteina struttura quaternaria Spesso un enzima attivo è composto da due o più catene proteiche che si compongono insieme in un unico grande complesso, detto struttura quaternaria dellenzima 53

54 Le strutture proteiche 54

55 La natura dei legami chimici Molto di ciò che noi consideriamo essenziale per la vita può essere ricondotto ad un insieme di rea- zioni chimiche ed alle caratteristiche degli enzimi che ne controllano la velocità elemento Per definizione, elemento è ciò che non può essere ulteriormente ridotto attraverso reazioni chimiche atomi àtomos tomé Gli elementi sono atomi ( dal greco àtomos: indivisibi- le, a [alfa privativo] e tomé, divisione) singoli compo- sti da particelle subatomiche più piccole che posso- no essere separate solo tramite reazioni fisiche 55

56 Esistono centinaia di particelle subatomiche, ma solo tre sono stabili e particolarmente importanti per la chimica degli organismi viventi: neutroni neutroni ( grammi, senza carica) protoni protoni ( grammi, con carica positiva) elettroni elettroni ( grammi, con carica negativa) Anatomia dellatomo 1 numero atomico Il numero di protoni presenti nel nucleo determina il tipo di elemento (e definisce il numero atomico) 56

57 57 Tavola periodica degli elementi

58 Anatomia dellatomo 2 orbitale Per ogni protone nel nucleo esiste un elettrone posto in un orbitale relativamente lontano dal nucleo che ruota ad una velocità prossima a quella della luce Grandi spazi vuoti allinterno dellatomo Gli elettroni non hanno orbite prevedibili: lorbitale è lo spazio tridimensionale in cui lelettrone passa il 90% del suo tempo 58

59 Anatomia dellatomo 3 fotoni A livello atomico, lenergia è suddivisa in pacchetti di luce, i fotoni: più lelettrone si trova lontano dal nu- cleo, maggiore è la sua energia potenziale: U kZe 2 /r dove k è la costante di Coulomb Ze è la carica positiva contenuta nel nucleo ( Z numero atomico) e r è la distanza dellelettrone dal nucleo Gli elettroni emettono luce quando passano da un orbitale più distante ad uno più prossimo al nucleo quanto La quantità di energia richiesta è un quanto salto quantico Si dice infatti che effettuano un salto quantico 59

60 La valenza 1 Poiché le cariche negative degli elettroni fanno sì che si respingano, solo due elettroni possono con- dividere un orbitale ad un certo istante 1s Gli elettroni ad energia più bassa si trovano nellorbitale (sferico) più vicino al nucleo, indicato con 1s 2s2p Il secondo livello di elettroni è costituito da quattro or- bitali: un orbitale sferico 2s e tre orbitali a manubrio 2p … 60

61 La valenza 2 61

62 La valenza 3 Le proprietà chimiche di un atomo dipendono dal suo guscio di elettroni più esterno Mentre il numero di protoni nel nucleo non cambia durante una reazione chimica, la posizione relativa degli elettroni, e talvolta anche il loro numero, è variabile Sebbene sia una regola fondamentale in Natura quella del bilanciamento delle cariche, vi è anche, tuttavia, la tendenza a mantenere gli orbitali atomici più esterni completamente pieni o completamente vuoti Regola dellottetto: Regola dellottetto: Nella formazione di legami, ogni atomo tende, attraverso la cessione, lacquisto o la messa in comune di elettroni, a raggiungere la configurazione elettronica dei gas nobili, corrispondente alla presenza di 8 elettroni negli orbitali s e p dello strato più esterno 62

63 La valenza 4 Queste due priorità, potenzialmente conflittuali, si risolvono permettendo agli orbitali di un atomo di sovrapporsi a quelli di altri atomi legame covalente La condivisione di elettroni, che deriva dalla so- vrapposizione degli orbitali, è alla base del legame covalente 63

64 La valenza 5 Gli elementi, come lelio ( 2 He), che non presen- tano elettroni spaiati nellorbitale più esterno, non sono chimicamente reattivi e non sono mai legati covalentemente ad altri atomi Viceversa, atomi con valenze simili hanno pro- prietà chimiche simili ( 14 Si, 6 C) valenza Il numero di elettroni spaiati nellorbitale più ester- no di un atomo, la sua valenza, rappresenta la sua capacità di legame ( 1 H1, 8 O2, 7 N3, 6 C4) 64

65 La valenza 6 c Due esempi di legame covalente: Acqua (a) e Metano (b); nella molecola di acqua esiste un legame covalente fra due atomi di idrogeno ed uno di ossigeno; nella molecola di metano, quattro atomi di idrogeno formano legami covalenti con un solo atomo di carbonio (b) (a) 65 La forma e la dimensione di un composto dipen- dono dalla valenza degli atomi da cui è formato

66 Lelettronegatività 1 elettronegatività Lelettronegatività di un atomo è una funzione del numero di elettroni che latomo deve acquisire o donare per completare o svuotare gli orbitali più esterni Per esempio, sia 1 H che 6 C hanno lo shell di elettroni più esterno pieno per metà Hanno uguale elettronegatività Nei legami covalenti tra idrogeno e carbonio gli atomi partecipano allo stesso modo 66

67 Lelettronegatività 2 La situazione è molto diversa nei legami con lossigeno; dato che 8 O deve acquisire due elet- troni o perderne sei, esso è molto più elettro- negativo rispetto a idrogeno e carbonio tendono a passare più tempo nelle vicinanze dellatomo di ossigeno Gli elettroni coinvolti nei legami covalenti dellac- qua, per esempio, tendono a passare più tempo nelle vicinanze dellatomo di ossigeno legami polari I legami polari provocano pertanto una leggera separazione delle cariche, che rende lossigeno nellH 2 O leggermente negativo e gli idrogeni leg- germente positivi 67

68 Lelettronegatività 3 legame idrogeno La leggera separazione di cariche derivante dai legami polari genera una particolare interazione tra molecole, chiamata legame idrogeno Ogni molecola di acqua è debolmente associata ad una rete di altre molecole di acqua, perché le legge- re cariche positive degli idrogeni generano affinità con le leggere cariche negative degli atomi di ossi- geno posti nelle vicinanze È richiesta molta meno energia per rompere un legame idrogeno che un legame covalente, dato che nel primo caso non vi è condivisione fra gli atomi 68

69 I legami idrogeno La molecola dacqua (a) e linterazione tra molecole tramite legami idrogeno (b) (b) (a) 69

70 Idrofilicità e idrofobicità 1 I composti chimici possono essere divisi in due categorie, quelli che interagiscono e quelli che non interagiscono con lacqua idrofilici I composti idrofilici sono costituiti da molecole dotate di legami polari, capaci di formare legami idrogeno con lacqua Si disciolgono facilmente in soluzioni acquose 70

71 Idrofilicità e idrofobicità 2 idrofobici I composti che hanno atomi legati solo da legami covalenti non polari sono detti idrofobici e non interagiscono con le molecole dacqua La loro presenza fisica induce le molecole dellacqua ad interagire fra di loro e impedisce la compen- sazione delle loro cariche parziali Di conseguenza, molecole come i grassi (con legami carboniocarbonio e carbonioidrogeno) sono esclu- se dalle soluzioni acquose e costrette ad associarsi le une con le altre (es. doppio strato lipidico che costituisce la membrana cellulare) 71

72 Idrofilicità e idrofobicità 3 72

73 Strumenti per la biologia molecolare 1 Il riconoscimento dellinformazione contenuta nel- la sequenza di DNA del genoma procariotico è molto più facile rispetto al compito equivalente sul più complesso genoma eucariotico Inoltre, negli eucarioti, il problema di identificare linformazione che codifica una proteina è ulte- riormente complicato dal fatto che un introne in un particolare tipo di cellula può essere un esone in unaltra Tuttavia… i problemi associati alla decifrazione del contenuto informativo del genoma non sono in- sormontabili quando si conoscono le regole utilizzate dalle cellule allo scopo 73

74 Strumenti per la biologia molecolare 2 pattern È compito della bioinformatica riconoscere/estrarre le regole dai pattern, che si osservano dallenorme quantità di dati disponibili Sorprendentemente piccolo è invece il numero di stru- menti comunemente usati dai biologi molecolari per: generare i dati grezzi necessari per tali analisi… …verificare il significato biologico delle possibili re- gole estratte 74

75 Strumenti per la biologia molecolare 3 Sei principali tecniche di laboratorio definiscono lintera disciplina della biologia molecolare: Enzimi di restrizione Elettroforesi su gel Blotting e ibridazione, microarray Clonaggio Reazione a catena della polimerasi (PCR) Sequenziamento del DNA 75

76 Enzimi di restrizione 1 Il lavoro originale di Wilkinson, Watson e Crick (1953), che valse loro il Nobel nel 1962, spiegava come il DNA fungesse da materiale genetico enzimi di restrizione Ma fu solo venti anni dopo che H. Smith et al. scoprirono gli enzimi di restrizione, che permisero di manipolare le molecole di DNA in modo spe- cifico per decifrare il loro contenuto informativo Nel corso dello studio sulla causa che portava alcune cellule batteriche a migliorare la propria difesa contro le infezioni virali, infatti, rilevarono che i batteri producevano degli enzimi capaci di rompere le molecole di DNA in corrispondenza di particolari stringhe di nucleotidi 76

77 Enzimi di restrizione 2 Gli enzimi di restrizione possono essere isolati dalle cellule batteriche ed utilizzati come forbici, che permettono ai biologi di tagliare/incollare le molecole di DNA Di solito le molecole di DNA a doppio filamento vengono scisse in modo da lasciare una breve sequenza di DNA a singolo filamento allestremità di ogni frammento Tale sequenza è, per natura, complementare con la sequenza di qualunque altra estremità prodotta dallo stesso enzima terminazioni coesive appiccicose ligasi Le due sequenze hanno dunque terminazioni coesive oappiccicose, in grado di tenere insieme i due frammenti fino a che un altro speciale enzima, detto ligasi, li ricongiunge in modo permanente, ricostruendo i legami fosfodiestere tagliati dallenzima di restrizione 77

78 Enzimi di restrizione 3 78

79 Enzimi di restrizione 4 terminazioni piatte Gli enzimi di restrizione possono dare origine an- che a terminazioni piatte, che si legano a moleco- le di DNA con uguali terminazioni 79

80 Enzimi di restrizione 5 Scinde la molecola di DNA tra i nucleotidi G ed A ogniqualvolta li incontra nella sequenza (che si verifi- ca in media ogni (1/4) 61/4096 cop- pie di basi) 5GAATTC3 sito di restrizione La stringa di nucleotidi riconosciuta da EcoRI è il suo sito di restrizione Provoca la terminazione coesiva 5AATT3, la cui sequenza com- plementare è 5AATT3 80 Esempio EcoRI ( Escherichia Coli batterio che vive nella parte infe- riore dellintestino di animali a sangue caldo, Restrizione, I )

81 Enzimi di restrizione 6 Comunque… mappe di restrizione tagliando una molecola di DNA e determinando lordine dei tagli (ottenuti con più enzimi) ed il numero di frammenti, si può comprendere la specifica organizzazione e sequenza della molecola mappe di restrizione con gli enzimi di restrizione si possono isolare e manipolare sperimentalmente i singoli geni 81

82 Elettroforesi su gel 1 Per genomi composti da milioni (come il genoma di E.coli ) o da miliardi di coppie di basi (come il genoma umano), la scissione completa tramite enzimi di restrizione può fornire centinaia di migliaia di frammenti di DNA elettroforesi su gel agarosiopoliacrilammi de Lelettroforesi su gel di agarosio (o poliacrilammi- de) è una tecnica classicamente utilizzata per analizzare e separare tali frammenti 82

83 Elettroforesi su gel 2 Lelettroforesi su gel sfrutta le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (la catena principale è carica negativamente, grazie alla presenza dei fosfati) per farle migrare, in un campo elettrico, attraverso il gel Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, che consentono di separare le mole- cole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi si avrà una separazione in funzione della velocità 83

84 Elettroforesi su gel 3 84

85 Blotting ed ibridazione 1 Individuare il singolo frammento di DNA che con- tiene uno specifico gene tra centinaia di migliaia di frammenti, anche se divisi per dimensione, è un compito impossibile ibridazione Libridazione è una tecnica che consente di verifi- care la complementarietà esistente tra due mole- cole di acidi nucleici in base alla loro omologia di sequenza Ciò è possibile perché le proteine a funzione biolo- gica fondamentale, come lemoglobina, linsulina, lormone per la crescita, hanno sequenze molto simili tra di loro in organismi filogeneticamente vicini 85

86 Blotting ed ibridazione 2 Lappaiamento di basi può avvenire tra due DNA, due RNA o un DNA ed un RNA Il principio della reazione consiste… …nellesporre luna allaltra due preparazioni di acido nucleico a singolo filamento (di cui uno marcato radioattivamente) e, successivamente, nel visualizzare (autoradiogra- fia o colorazione) oppure misurare la quantità di materiale a doppio filamento che si è formato (quantificandone la radioattività incorporata) 86

87 Blotting ed ibridazione 3 ibridazione su filtro o membrana blotting La tecnica di ibridazione su filtro o membrana, detta blotting, è la più utilizzata per verificare la presenza di sequenze particolari (e quindi di geni) di diversa origine, provenienti ad esempio da un altro animale o da unaltra specie sonde Si utilizzano a questo scopo delle sonde mole- colari, cioè frammenti di DNA che codificano per la proteina da analizzare 87

88 Blotting ed ibridazione 4 La sonda viene marcata con un isotopo radioattivo e mescolata in soluzione, ed a temperatura prossima ai 100° (per ottenere la denaturazione dei 2 filamenti di DNA) con un filtro (nitrocellulosa o nylon) su cui è fissato un frammento di DNA che dovrebbe contenere la sequenza complementare 88

89 Blotting ed ibridazione 5 Al termine della procedura di ibridazione, la sonda non legata viene lavata via e la membrana viene esaminata per vedere dove è avvenuto laccoppia- mento tra la sonda e la sequenza bersaglio Lesposizione del filtro ad una lastra fotosensibile (o la colorazione) permetterà di rilevare una trac- cia che confermerà lappaiamento, mentre se non sussiste omologia non avverrà nessuna ibrida- zione 89

90 Blotting ed ibridazione 6 Blotting: ibridazione su membrana 90

91 Microarray 1 microarraychip a DNAbiochip Una variante del sistema di ibridazione mediante membrana è la tecnologia del microarray, o chip a DNA, o biochip In questo caso, decine di migliaia di sequenze nucleotidiche vengono fissate una per una in una specifica posizione sulla superficie di un piccolo chip di silicio probe target I microarray sfruttano una tecnica di ibridazione inversa, che consiste nel fissare tutti i segmenti di DNA, detti probe, su un supporto e nel marcare invece lacido nucleico che vogliamo identificare, detto target 91

92 Microarray 2 È una tecnica che è stata sviluppata negli anni 90 e oggi permette lanalisi dellespressione genica monitorando in una sola volta gli RNA prodotti da migliaia di geni Sforzi computazionali significativi sono necessari sia per costruire i chip sia per interpretarne i risultati 92

93 Microarray 3 93

94 Clonaggio 1 Mentre per le cellule è normale estrarre infor- mazione dalle singole molecole di DNA, in biologia molecolare occorrono quantità di materiale da analizzare tali da essere quasi visibili a occhio nudo (molti milioni di molecole) Invocare laiuto delle cellule nella generazione di sufficienti quantità di specifiche molecole di DNA 94

95 Clonaggio 2 Nel genoma di un organismo diploide, ad esempio in una cellula umana, un gene è presente in ge- nere in duplice copia, diluito in mezzo a moltis- sime altre sequenze di DNA clonaggio molecolare Tramite il clonaggio molecolare è possibile isolare un singolo gene o, più in generale, un frammento di DNA dal genoma di un organismo, e produrne molte copie identiche La disponibilità di un gene in forma pura e in grande quantità ne consente lo studio a livello molecolare 95

96 Clonaggio 3 vettori Il clonaggio coinvolge linserimento di frammenti specifici di DNA allinterno di trasportatori simili ai cromosomi, chiamati vettori, che ne permettono la replicazione e lisolamento allinterno di cellule viventi plasmidi I primi vettori che furono utilizzati derivavano da virus batterici e da piccoli pezzi di DNA extra- cromosomale, detti plasmidi, presenti nelle cellule procariotiche 96

97 Clonaggio 4 Tutti i vettori devono possedere le seguenti caratteristiche: polylinker Disporre di una zona in cui può essere inserito il DNA esogeno (detta polylinker) Contenere le sequenze che permettono al vettore di replicarsi allinterno della cellula vivente Contenere le sequenze che conferiscono alla cellula ospite la capacità di rilevarne la presenza Dimensioni e forma tali da permettere al vettore di essere separato dal DNA della cellula ospite 97

98 Clonaggio 5 98

99 Clonaggio 6 cloni moleco lari librerie genomiche Tutte le copie identiche dei frammenti, i cloni moleco- lari, possono essere utilizzate per uno studio immedia- to o conservate in librerie genomiche Una libreria genomica ideale dovrebbe contenere una copia per ogni segmento del DNA di un organismo equivalente genomico Il numero di cloni (dato dalla dimensione del genoma diviso la lunghezza media dei frammenti) definisce un equivalente genomico Esempio Esempio: E.coli ha un genoma lungo coppie di basi; se fosse completamente digerito da un enzima di restrizione come EcoRI, per la costruzione di una libreria genomica completa dovrebbe essere clonato ogni fram- mento di DNA, su un totale di più di 1000 frammenti di lunghezza media pari a coppie di basi 99

100 Clonaggio 7 Sfortunatamente, però, la libreria non può essere costruita con una semplice digestione del DNA genomico di una singola cellula e quindi con la costruzione di cloni per ogni frammento Il processo di clonaggio non è efficiente e di solito è necessario raccogliere DNA da migliaia di cellule per clonarne un singolo frammento Inoltre, la natura casuale del processo di clona- zione fa sì che qualche frammento venga clonato più volte, mentre altri non sono rappresentati nellequivalente genomico 100

101 Clonaggio 8 Aumentare il numero di cloni in una libreria geno- mica equivale ad aumentare la probabilità che essa possa contenere almeno una copia di ogni segmento di DNA Una libreria genomica contenente da quattro a cinque equivalenti genomici ha, in media, da quattro a cinque copie di ogni frammento di DNA il 95% di probabilità di contenere almeno una copia di ogni porzione del genoma dellorganismo 101

102 Clonaggio 9 Implicazioni pratiche: I vettori che permettono il clonaggio di lunghi frammenti di DNA sono i migliori per la realiz- zazione di librerie genomiche, perché richiedono pochi cloni per realizzare lequivalente genomico Il clonaggio dellultimo 5% di un genoma è spesso unoperazione difficile quanto il clonaggio del primo 95% 102

103 Clonaggio 10 Alternativa:libreria di cDNA Alternativa: libreria di cDNA La porzione di genoma di maggior interesse è quella che corrisponde alle regioni che codificano per le proteine, che vengono quindi trascritte preventiva- mente in mRNA trascrittasi inversa Gli mRNA possono essere separati dagli altri poli- nucleotidi presenti nella cellula tramite un enzima, la trascrittasi inversa, che converte le sequenze di mRNA in DNA complementare (cDNA) e quindi clona i cDNA come parte di una libreria Tuttavia… si perde il contenuto genomico relativo a sequenze regolatrici, introni, etc. 103

104 Reazione a catena della polimerasi 1 reazione a catena della polimerasi Polymerase Chain ReactionPCR La tecnica della reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR, K. Mullis, 1985) ha rivoluzionato le metodiche dellingegneria genetica, offrendo uno strumento straordinaria- mente potente nellamplificare in vitro e in poco tempo particolari sequenze di DNA Questa tecnica consente di ottenere centinaia di migliaia di copie del DNA di interesse per succes- sive caratterizzazioni (determinazione della lun- ghezza, della sequenza nucleotidica, etc.) senza dover ricorrere ai comuni metodi di clonaggio né alluso di enzimi di restrizione 104

105 Reazione a catena della polimerasi 2 DNA polimerasi La PCR sfrutta la reazione di sintesi in vitro del DNA, reazione catalizzata dalla DNA polimerasi template primer Questo enzima richiede per il suo funzionamento uno stampo (template), rappresentato da un fila- mento di DNA a cui deve trovarsi appaiato un primer, che funge da innesco per la replicazione del DNA I primer sono necessari perché molte DNA poli- merasi non possono iniziare la sintesi di un nuovo filamento ex novo, ma possono solo aggiungere nucleotidi ad un filamento preesistente 105

106 Reazione a catena della polimerasi 3 La PCR si basa sulluso di due primer di lunghez- za pari a 1820 nucleotidi, che sono disegnati in modo da essere esattamente complementari alle corrispondenti sequenze fiancheggianti il tratto di DNA da amplificare I due primer sono diretti in direzione opposta ma convergente e definiscono le estremità del futuro prodotto dellamplificazione Lattività della DNA polimerasi determinerà la sintesi di nuovi filamenti a partire da ciascun primer 106

107 Reazione a catena della polimerasi 4 La reazione è divisa in tre stadi, ciascuno condotto ad una tempe- ratura diversa denaturazione denaturazione (94°C) per separare i due filamenti della molecola stampo annealing annealing (5060°C) durante la qua- le i primer si appaiano ai filamenti denaturati, determinando il punto di innesco della sintesi di DNA polimerizzazioneestensioneallun gamento polimerizzazione (estensione, allun- gamento, 72°C) 107

108 Reazione a catena della polimerasi 5 Il ciclo di denaturazioneappaiamentoestensione viene ripetuto 2030 volte in modo tale da otte- nere una grande amplificazione del DNA compreso nella regione di appaiamento dei due primer I primi prodotti di buona qualità di PCR si formano a partire dal terzo ciclo e si accumulano con un andamento di tipo esponenziale ( N 2 n 2, dove N è il numero di molecole di partenza e n il numero di cicli di amplificazione) 108

109 Reazione a catena della polimerasi 6 Le molecole di DNA amplificate sono prodotte molto più velocemente ed efficacemente rispetto a quelle ottenibili dai cloni Il maggior vantaggio della PCR, tuttavia, consiste nel poter iniziare con quantità di materiale (come quelle tipicamente associate a campioni prove- nienti da musei, o fossili o forensi) molto minori di quanto non siano solitamente disponibili (e neces- sarie) negli esperimenti di clonaggio 109

110 Sequenziamento del DNA 1 sequenziamento Il termine sequenziamento indica il processo per la determinazione della struttura primaria esatta di un biopolimero (una macromolecola), cioè del- lordine delle basi nel caso di un acido nucleico, o degli aminoacidi nel caso delle proteine La caratterizzazione molecolare finale di un fram- mento di DNA consiste, infatti, nella determina- zione dellordine, o sequenza, dei suoi nucleotidi 110

111 Sequenziamento del DNA 2 Tutte le strategie di sequenziamento del DNA comprendono tre passi 1) Generazione di un insieme completo di sottofram- menti della regione in esame, che differiscono luno dallaltro per un singolo nucleotide tag 2) Marcatura di ogni frammento con una delle quattro differenti etichette (tag) che dipendono dal nucleo- tide posto al termine del frammento 3) Separazione dei frammenti sulla base delle loro di- mensioni (mediante elettroforesi su gel) per leg- gere la sequenza in base al riconoscimento del- lordine in cui sono posti i diversi tag 111

112 Sequenziamento del DNA 3 degradazione chimica del DNA Metodo di A. M. Maxam e W. Gilbert (1977): degradazione chimica del DNA a terminazione di catena Metodo di F. Sanger (1978): a terminazione di catena Hanno in comune la generazione di una scaletta di frammenti di DNA a singolo filamento, ciascuno più lungo del precedente di una base 112

113 Sequenziamento del DNA 4 Metodo di Maxam e Gilbert Basato sulla degradazione chimica di frammenti di DNA, è ormai poco utilizzato perché impiega com- posti chimici dannosi alla salute e perché non adat- to al sequenziamento automatico Si differenzia dal metodo di Sanger perché non uti- lizza sintesi enzimatiche, ma trattamenti chimici che agiscono a livello di singoli nucleotidi È basato sullabilità di alcuni composti chimici idrazina, N 2 H 4, acido formico, HCOOH, dimetilsolato, (CH 3 ) 2 SO 4 di modificare in modo specifico le basi allinterno del DNA e di altri piperidina, (CH 2 ) 5 NH di catalizzare la rottura del filamento di DNA a li- vello dei nucleotidi modificati 113

114 Sequenziamento del DNA 5 Metodo di Sanger Il sottogruppo di frammenti necessari per il sequen- ziamento è generato attraverso lincorporazione di nucleotidi modificati che impediscono laggiunta di ulteriori basi alla catena da parte della DNA polimerasi Tali nucleotidi differiscono dalla loro controparte standard per la mancanza del gruppo idrossile alla terminazione 3, a cui dovrebbe attaccarsi il nucleo- tide successivo in un normale frammento di DNA che cresce Sono dotati di tag (colorante fluorescente) per individuarli quando vengono frazionati per dimensione 114

115 Sequenziamento del DNA 6 115

116 Il paradosso del valore C 1 Nel 1948 fu scoperto che la quantità di DNA allinterno di ogni cellula di uno stesso organismo è la stessa valore C Tale quantità è detta valore C, termine coniato nel 1950 da Henson Swift costanteSono spiacente per il fatto che la lettera C non stia per nulla di più emozionante di costante, con riferimento ad esempio allammontare del DNA caratteristico di un parti- colare genotipo (H. Swift a Michael Bennett) È interessante notare che, mentre la grandezza del genoma di una specie è costante, si osservano forti variazioni tra le varie specie, ma senza una correlazione con la complessità dellorganismo 116

117 Il paradosso del valore C 2 paradosso del valore C Lassenza di correlazione tra la complessità e la dimensione del genoma origina il paradosso del valore C La quantità totale di DNA spesso differisce di un fattore maggiore di cento tra specie molto simili Limplicazione chiara ma difficile da provare è che una lunga porzione di DNA presente in alcuni organismi è in eccesso e, apparentemente, non fornisce un contributo significativo alla comples- sità dellorganismo 117

118 Il paradosso del valore C 3 118

119 Cinetica di riassociazione 1 Quando i filamenti complementari della doppia catena di DNA sono separati, o denaturati, per mezzo del calore o di trattamenti alcalini, possono facilmente rinaturarsi nella struttura a doppio fila- mento quando le condizioni allinterno della cellula tornano alla normalità Si può comprendere qualcosa della struttura di un genoma dal modo in cui si riforma il DNA dena- turato Più una sequenza genomica è unica, maggiore sarà il tempo necessario affinché ogni filamento trovi e ibridizzi con il suo filamento complementare 119

120 Cinetica di riassociazione 2 equa zionecot Britten e Kohne, nel 1968, hanno descritto lequa- zione cot che definisce la cinetica di riassociazione del DNA nella forma: c/c 0 = 1 /( 1 +kc 0 t) dove c è la concentrazione di DNA a singolo fila- mento al tempo t ( c 0 concentrazione iniziale) e k è una costante (dipendente dalla concentrazione di cationi, dalla temperatura, dalla dimensione del frammento e dalla complessità della sequenza nucleotidica) 120

121 Cinetica di riassociazione 3 equazione cot Lequazione cot stabilisce una relazione di propor- zionalità inversa fra la frazione rimanente di DNA a singolo filamento e c 0 t Da tale equazione si può ricavare per ogni organismo uno specifico valore c 0 t 1/2, che è diretta- mente proporzionale al numero di nucleotidi delle sequenze non ripetute Pertanto, la misura del tempo t 1/2 richiesto da me- tà dei singoli filamenti di DNA per rinaturarsi ( c/c ) permette la determinazione sperimentale della quantità totale di informazione genetica uni- ca codificata in un genoma 121

122 Cinetica di riassociazione 4 Dato che c 0 t 1/2 è il prodotto tra la concentrazione ed il tempo necessario per la rinaturazione di me- tà della quantità totale di DNA, un valore grande di c 0 t 1/2 implica una reazione lenta e riflette la si- tuazione in cui ci sono poche copie di una parti- colare sequenza dentro una data massa di DNA Il valore c 0 t 1/2 è una misura della lunghezza totale di sequenze diverse allinterno del genoma e ne descrive la complessità 122

123 Cinetica di riassociazione 5 Mentre il valore C non è in generale indicativo della complessità di un organismo, il valore c 0 t 1/2 solitamente lo è junk DNA La disparità fra i due valori di solito indica la presenza di copie multiple di sequenze di DNA inutili, chiamate junk DNA Sequenze ripetute allinterno del DNA spazzatura differiscono molto in termini di complessità (da uno o due a migliaia di nucleotidi) e distribuzione (raggruppamenti locali o casuale sparsità) allin- terno del genoma 123

124 Concludendo… 1 Il DNA è la molecola che contiene linformazione conservata allinterno della cellula Lordine specifico dei quattro differenti nucleotidi è trascritto dalla RNA polimerasi in mRNA, che viene tradotto in proteine Per costruire le proteine vengono utilizzati venti diversi aminoacidi e lordine e la composizione specifica di questi mattoni giocano un ruolo importante nella costruzione e nel mantenimento della struttura e della funzione delle proteine 124

125 Concludendo… 2 I biologi molecolari hanno a disposizione un numero piuttosto limitato di strumenti per studiare il DNA e linformazione contenuta al suo interno Gli enzimi di restrizione tagliano la molecola di DNA quando riconoscono una determinata stringa di nucleotidi Lelettroforesi permette la separazione dei frammenti di DNA in base alla loro lunghezza ed alla loro carica Le tecniche di blotting e ibrididazione garantiscono il reperi- mento di specifici frammenti di DNA in una mistura Il clonaggio permette la propagazione di sequenze specifiche, per un utilizzo ripetuto La PCR garantisce una rapida amplificazione e caratterizzazione di specifici frammenti di DNA Il sequenziamento, infine, determina lordine dei nucleotidi, garantendo la caratterizzazione della molecola di DNA 125

126 Concludendo… 3 La cinetica di riassociazione ha rivelato che il contenuto di DNA di una cellula, il suo valore C, non sempre corrisponde direttamente al contenu- to informativo di un organismo Negli organismi complessi vi sono ampie zone di DNA spazzatura 126


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