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EFFETTO SINERGICO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Relatore: Candidata: prof. Massimo Reverberi Chiara Guarino anno accademico.

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1 EFFETTO SINERGICO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Relatore: Candidata: prof. Massimo Reverberi Chiara Guarino anno accademico 2014/2015 Tesi sperimentale BIOTECNOLOGIE GENOMICHE, INDUSTRIALI ED AMBIENTALI Corso di laurea magistrale

2 La celiachia è un’enteropatia autoimmune scatenata dalla gliadina, sostanza lipoproteica presente in alcuni cereali (grano, segale, orzo e avena), in soggetti geneticamente predisposti. LA SINDROME CELIACA atrofia dei villi intestinali; malassorbimento; diarrea; anemia; osteoporosi; perdita di peso dermatiti L’unica cura è l’aderenza ad una dieta priva di glutine (es. riso, mais). EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

3 Catassi, C.,et al (2014) Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition 59, 7-9.  Virus intestinali (rotavirus)  Batteri patogeni  Contaminanti alimentari (micotossine ) LA SINDROME CELIACA EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

4 Le micotossine sono prodotte dal metabolismo secondario di alcune specie fungine (aflatossine, fumonisine, tricoteceni). LE MICOTOSSINE contaminazione diretta contaminazione indiretta Reg. (UE) N. 165/2010 Reg. (CE) 1126/2007 Reg.(CE) n. 1881/2006 CARCEROGENE EPATOTOSSICHE NEFROTOSSICHE ESTROGENICHE EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

5 MICOTOSSINE e CELIACHIA: il Deossinivalenolo *Maresca M., Fantini J. (2010) Toxicon 56, 282–294. Il deossinivalenolo (DON) è una micotossina appartenente al gruppo dei tricoteceni prodotta da alcune specie di Fusarium e particolarmente diffusa nei cereali quali grano, orzo e mais. Provoca vomito, dissenteria ed immunodepressione. ** Scientific Cooperation (SCOOP) , Brussels, Belgium,  Effetti del DON sulla permeabilità dell’epitelio intestinale*.  Consumi medi di pane e pasta ed esposizione al DON ( fino al 46,1 % per gli adulti e al 95,9 % del TDI per i bambini). ** Ruolo nell’eziologia e nella persistenza della celiachia EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

6 SCOPO DELLA TESI Ruolo del DON nella sindrome celiaca Cellule Caco-2 umane trattate con gliadina digerita e DON 1. Valutazione degli effetti citotossici (MTT test); 2. Studi di permeabilità cellulare (spettrometria di massa); 3. Analisi della risposta infiammatoria (western blot, ELISA). EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

7 EFFETTO CITOTOSSICO DELLA GLIADINA CTRL (PBS) 50  g di gliadina digerita per 6h 50  g di gliadina digerita per 12 h 50  g per 6h EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

8 EFFETTO CITOTOSSICO DEL DON CTRL (PBS) 100 ng/mL di DON per 12 h 5, 50, 100 ng/mL per 12h EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

9 EFFETTO CITOTOSSICO SINERGICO CTRL (PBS) 100 ng/mL di DON per 12 h 100ng/ml di DON + gliadina (50ug) EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

10 PERMEABILITA’ CELLULARE Metodo analitico basato sulla spettrometria di massa tandem Ione molecolare Ione genitore (m/z) Ione figlio (m/z) Energia di collisione (eV) [M+H] - 295,0265,010 [M+H] - 295,0138,015 HPLC-UV EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

11 PERMEABILITA’ CELLULARE EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

12 RISPOSTA INFIAMMATORIA (COX-2) EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

13 RISPOSTA INFIAMMATORIA (Il-6) EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

14 RISPOSTA INFIAMMATORIA (Il-8) EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

15 CONCLUSIONI  Si verifica un effetto citotossico sinergico della gliadina e del DON;  L’assorbimento del DON è minore in presenza della gliadina;  Il DON causa l’over-espressione di COX-2, Il-6 e Il-8 al pari o in maggior misura della sola gliadina.  Si verifica un aumento della risposta infiammatoria dovuto alla co-presenza della gliadina e del DON. Il DON può attivare uno stato infiammatorio tale da alterare la funzionalità intestinale e causare l’insorgere della sindrome celiaca in individui predisposti. Il DON può peggiorare lo stato infiammatorio acuto dovuto alla sindrome celiaca, e può quindi influenzare la persistenza della patologia. EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

16 PROSPETTIVE FUTURE Reale effetto tossicologico causato dal DON presente negli alimenti? EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015  Co-presenza di altre micotossine (fumonisine, aflatossine, T2, HT2, ZEA,…).  Particolari categorie di consumatori che presentano una compromessa funzionalità intestinale e/o una dieta poco varia (celiaci).  Consumatori caratterizzati da un basso peso corporeo (primissima infanzia) ai quali vengono erroneamente proposti alimenti per adulti, sia gluten-free che glutinati, contenenti tenori maggiori di micotossine.

17 RINGRAZIAMENTI EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015

18 Chiunque sia stato stato il padre di una malattia, un’alimentazione non corretta ne è stata la madre. (cit. George Herbert) “Il pranzo” di Diego Velázquez (1617). Museo dell'Ermitage di San Pietroburgo. EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015 GRAZIE PER L’ATTENZIONE

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20 ng/mLRecupero (%) RSDr (%) (n=6) 591≤2 5098≤ ≤3 PERMEABILITA’ CELLULARE Validazione del metodo analitico basato sulla spettrometria di massa tandem EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015 LODLOQ 0,1 ng/mL1 ng/mL

21 EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015 RISPOSTA INFIAMMATORIA (COX-2)

22 EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015 RISPOSTA INFIAMMATORIA (Il-6) La scelta è ricaduta proprio su queste interleuchine poiché alcuni studi riportano che esse vengono prodotte dalle cellule Caco-2 o dalle cellule dendritiche se stressate con gliadina e sono over-espressi in vivo nei soggetti celiaci che assumono glutine. L'IL-6 è un'interleuchina che agisce come citochina pro-infiammatoria, secreta dai Linfociti T e dai macrofagi per stimolare la risposta immunitaria, ad esempio durante un'infezione o in seguito ad un trauma come una scottatura o altri danni tissutali che portino ad infiammazione. E’ considerata un importantissimo indice di patologie infiammatorie croniche dell'intestino.

23 EFFETTO DELLA GLIADINA E DEL DEOSSINIVALENOLO NELLA SINDROME CELIACA Tesi di Chiara Guarino, Relatore: prof. Massimo Reverberi Roma, 15 Luglio 2015 L'IL-8 induce chemotassi delle cellule bersaglio, in primo luogo neutrofili ma anche altri granulociti, che in questo modo migrano verso il sito di infezione. L'interleuchina-8 è spesso associata ad infiammazione ed a stress ossidativo. RISPOSTA INFIAMMATORIA (Il-8)


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