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METASTASI Del fenomeno dell’invasività risultano essenzialmente responsabili fattori intrinseci della cellule neoplastiche che possono essere riassunte.

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Presentazione sul tema: "METASTASI Del fenomeno dell’invasività risultano essenzialmente responsabili fattori intrinseci della cellule neoplastiche che possono essere riassunte."— Transcript della presentazione:

1 METASTASI Del fenomeno dell’invasività risultano essenzialmente responsabili fattori intrinseci della cellule neoplastiche che possono essere riassunte con: a) modificazione dell’adesività intercellulare; b) produzione di sostanze attive sulla membrana basale, sui componenti della matrice extracellulare e sulle cellule normali.

2 c)Locomozione delle cellule neoplastiche per mezzo di pseudopodi; d)produzione di fattori che inducono la formazione del sistema vascolare nel tumore. Durante la transizione dal tessuto normale a carcinoma in situ ed invasivo, lo stroma locale ospite gioca un ruolo attivo. L'interazione fra l'epitelio e i compartimenti mesenchimali produce una zona della membrana epiteliale basale interrotta da cui la cellula maligna emerge ed invade l'altro tessuto. METASTASI

3 cellule del tumore e dello stroma scambiano: fattori di crescita: fattore di crescita tumorale -b (TGF-b), fattore di crescita epidermico (EGF), citochine e chemiotattici: IL-6, fattore di crescita degli epatociti e fattore di invasività (SF/HGF), fattori di angiogenesi: fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF), fattore base di crescita dei fibroblasti (bFGF) Proteasi: le metalloproteinasi della matrice (MMPs) e l'attivatore del plasminogeno urochinasi (uPA). METASTASI

4 1980- supporto cellulare regolazione della migrazione, motilità e adesione, differenziazione e sviluppo embrionico ”full partner” nel regolare eventi cellulari:proliferazione, apoptosi, risposta agli stress, angiogenesi, regolazione della proteasi Funzioni della Matrice Extracellulare

5 Matrice Extracellulare Struttura extracellulare formata da materiale secreto dalla membrana plasmatica, la composizione assoluta varia fra i tessuti differenti e le differenti parti dei tessuti Composizione: laminine, collageni, proteoglicani, altri secreti cellulari Il legame del complesso collageno-proteoglicani alla superficie cellulare avviene attraverso molecole di legame, per esempio fibronectina, laminina Queste molecole sono ancorati alla cellula soprattutto attraverso una famiglia di recettori transmembrane, chiamati integrine

6 Le cellule tumorali attivano i fibroblasti, la proliferazione delle cellule endoteliali e il reclutamento dei leucociti. I fibroblasti attivati e le cellule endoteliali secernono MMPs, fattori di crescita e componenti dell’ECM; i leucociti liberano citochine e chemiochine. Le MMP accelerano la degradazione dell’ECM, il rilascio di fattori di crescita e aumentano il rimodellamento. L’effetto sulla cellula tumorale: migrazione, invasione, sopravvivenza e proliferazione

7 Degradazione di ECM secrezione locale di enzimi proteolitici Proteasi della serina u-PA = attivatore del plasminogeno urochinasi converte Il plasminogeno, proteolizzandolo in plasmina attiva : degrada una serie di proteine, quali la fibrina, fibronectina, collagene, laminina. L’espressione di uPAR è stimolata da fattori di crescita,quali TGFb, EGF, HGF Recettore u-PA (uPAR) è presente sui leucociti sulle cellule di tumore è richiesto per la metastasi, la capacità di invasione marker di prognosi negativa in molti cancri

8 A) Le cellule umane del cancro della prostata secernono uPA (red). u-PA lega il recettore di uPA (uPAR) sulla superficie delle cellule del cancro della prostata (green). B) Le cellule umane del cancro della prostata sono state transfettate con DNA che codifica la forma inattiva di uPA (yellow). Occupando i recettori di uPA, il uPA inattivo impedisce la proteasi attiva legarsi alla superficie delle cellule. Entrambi i tipi di cellule secernono uPA attivo, e producono i tumori una volta iniettati negli animali da laboratorio. Ma le cellule (A) metastatizzano, mentre le cellule (B) no.

9 Ruoli delle MMP secrete dalle cellule tumorali e dello stroma nella metastatizzazione crescita e angiogenesi invasione vasale e nella migrazione crescita e angiogenesi di metastasi distali

10 Espressione delle MMPs ALTO livello di espressione : in vari tumori umani e linee cellulari Angiogenesi Nei depositi di grasso Guarigione ferite Fisiologico remodelling del tessuto La produzione delle MMPs da parte dello stroma è regolata dalle cellule tumorali attraverso l’espressione di chimochine, citochine e l’induttore extracellulare di metalloproteasi di matrice. BASSO livello di espressione

11 MMPs sono sono una famiglia di circa 17 endopeptidasi zinco- dipendenti. MMPs sono classificate in cinque sottoclassi a seconda della loro specificità per un substrato: collagenasi interstiziali, gelatinasi, stromelisine metalloproteinasi di membrana e elastasi. Possono essere secrete o legate alla membrane MT-MMP Tutte le MMPs sono sintetizzate in forma latente. Richiedono attivazione extracellulare. Metalloproteinasi di Matrice (MMPs)

12 Collagenasi (MMPs 1, 8, 13,18) --- fibre di collagene Gelatinasi (MMP-2, MMP-9) --- Gelatina, collageno tipo IV, fibronectina, elastina, laminina, vitronectina Stromelisine (MMP-3, 10, 11, 7) --- Gelatina, fibronectina, caseina, laminina, elastina, MMP-2/ TIMP-2, aggrecani Elastasi (MMP-12) -- Elastina, gelatina, collageno IV, fibronectina, laminina, vitronectina, proteoglicani MMPs legate alla membrane (MMP 14, 15,16, 17) – Pro-MMP2, pro-MMP13 MMPs sono classificate in cinque sottoclassi a seconda della loro specificità per un substrato Classificazione di MMPs

13 Il processo di attivazione delle MMPs consiste di una reazione a due steps: un iniziale cleavage a livello della regione propeptidica che porta alla rimozione del peptide N-terminale, ed il secondo step, una reazione autoproteolitica che genera l’enzima attivo stabile. Oltre ad un’autoattivazione le MMPs possono essere il substrato di altre MMPs. Attivazione delle MMPs

14 Riguardo al ruolo delle MMPs nell’angiogenesi è conflittuale MMP-9 è stata trovata essere upregolata nelle isole angiogeniche e la sua espressione si correla con l’aumento del complesso VEGF/VEGFR. MMPs possono anche regolare negativamente l’angiogenesi. Le MMP-7 e 9 possono convertire il plasminogeno nel potente inibitore angiogenico angiostatina.

15 MMPs AND APOPTOSIS Le MMPs inducono l’apoptosi in almeno due modi: (i) attraverso la degradazione della ECM e la perdita dei segnali di sopravvivenza essenziali (ii) attraverso la solubilizzazione di ligando specifici inducenti la morte. E’ stato visto che la capacità della MMP-7 di contribuire all’apoptosi si correla con l’abilità si liberare il ligando di Fas (FasL), che induce l’apoptosi in cellule che esprimono Fas

16 inibitori tissutali delle metalloproteinasi (TIMPs) Fattori di crescita per alcune cellule tumorali TIMP-1 ? essenziale per l’attivazione di MMP-2 in alcuni sistemi, TIMP-2 Elevati livelli di TIMP sono riportati in associazione con la progressione del cancro e identificati come indicatori di prognosi povera in molti tipi di tumore! Inibitori naturali delle MMP MMP-2 e MMP-9

17 TIMP-3 e TIMP-4 Strettamente legato al ECM, inibisce l’apoptosi indotta da TNF-  Mediante la stabilizazione dei recettori TNF-  sulla superficie cellulare TIMP-3 TIMP-4 Ha un ruolo nell’omeostasi della ECM stimola l’apoptosi quando overespressa

18 Per capire come un segnale cellulare possa essere trasmesso attraverso l’interazione cellula-cellula o cellula- matrice extracellulare, basta ricordare che tali rapporti richiedono sempre la partecipazione di specifiche proteine di membrana, in grado di sostenere l’organizzazione della connessione tra cellule o della matrice extracellulare.

19 Caderinecell-cell Selectinecell-cell Immunoglobuline cell-cell superfamiglia Integrinecell-matrice e cell-cell Famiglie di proteine di adesione

20 Caderine Ca 2+ -dip. omofiliche adesioni unità funzionale = dimero superfamiglia Immunoglobine (CAM) omofiliche o eterofiliche Selectine eterofiliche Integrine eterodimeri, eterofiliche Si lagano a ECM, Ig-CAM, caderine adesione, polarizzazione, migrazione Cad. repeats Ig and Fn III repeats lectin repeats I-CAM MOLECOLE DI ADESIONE CELLULARE adesione CELL-CELL

21 Caderine E-caderina staining in pelle umana E- (epithelial) N- (neuronal)P- (placental) PROTEINE di ADESIONE CELLULARE CALCIO DIPENDENTI Legame omotipico: si lega soltanto a molecole identiche sulla superficie cellure adiacente o forma "zipper" multimolecolare E-caderina è la più importante E-caderina è un soppressore dell’invasione e delle metastasi

22 Precedente modello, dimerizzazione fra L’N-terminale soltanto Nuovo modello, 5-domini di interazione β-catγ-cat α-cat filamenti di actina Siti che legano il Ca

23 Carcinoma gastrico Il carcinoma gastrico può assomigliare al carcinoma del colon o essere diffuso I carcinomi diffusi non formano ghiandole ma si infiltrano come singole cellule 50% dei carcinomi gastrici del tipo diffuso contengono mutazioni di E-cad ed in tutti i casi espressione di E-cad è persa Cancro gastrico con la mutazione germinale del sito di legame della E-cad

24 Seconda mutazione in E-caderina nel carcinoma gastrico diffuso mucosa normale stained per E-cadTumore gastrico diffuso quasi nessun staining Metilazione del promotore di E- cad

25 Le molecole adesive appartenenti alla famiglia delle integrine organizzano una complessa rete di molecole citoplasmatiche che regola la sopravvivenza, la proliferazione e il movimento cellulare Cellula – ECM Integrine Ca2+/Mg2+ - dipendenti

26 Meccanismi Integrina-dipendenti Adesione e diffusione Motilità/migrazione Differenziazione Proliferazione Coagulazione Estravasasione Leucocitaria Generazione segnali di sopravvivenza Protezione contro l’apoptosi (anoikis) Tumorigenesi Metastasi

27 INTEGRINE Integrina è un eterodimero transmembrana Lega la matrice extracellulare e il citoscheletro Espressa a concentrazioni molto alte sulla superficie cellulare Due subunità glicoproteiche:  e  associate covalentemente Entrambi richeste per il legame alla matrice Sulla catena  3-4 domini che legano Ca 2+ o Mg 2+ Cys-rich Catena  Catena 

28 Al momento sono state riconosciute 18 subunità alfa e 9 beta che possono formare 25 eterodimeri differenti. 11 33 22 vv 77 55 66 88 44   2  3  4  5  6  7  8  9  10  11 EE  IIb LMXDLMXD 99

29 Struttura delle Integrine Legame con molecole della ECM es. fibronettina, collageno, vitronectina, ligandi solubili es. fibrinogeno   Legame al citoscheletro e molecole di segnalamento  proteine che legano l’actina es. vinculina, a-actinina, talina,  Proteine che legano i filamenti intermedi es. plakoglobina  Molte molecole di segnalamento es. tirosine chinasi membrana plasmatica citoplasma ligandi:

30 RGD Tensin FAK VinculinTensin FAK Talina-actinin Actin stress fibres OccupazioneClasterezzazione Occupazione e clasterizzazione L’ottimale segnalamento dell’integrina richiede sia occupazione dell’integrina sia la clasterizzazione dell’integrina CITOPLASMA

31 M2+ D S P G R G Talin Pax Tensin FAK src G M2+ D S P G R G Talin Pax Tensin FAK src G a-actinin actin ECM glycoprotein eg fibronectin Cation-binding site SS Small GTPases -Rho,Rac,cdc42 A seconda della taglia e della localizzazione le strutture possono essere contatti focali, adesioni focali, o adesioni fibrillari. I segnali trasdotti attraverso i complessi focali e le adesioni focali sono implicati in una serie di processi cellulari CITOPLASMA

32 La proteina integrina, è in grado di modificare la propria struttura tridimensionale nei punti in cui la matrice extracellulare o le connessioni tra cellule subiscono alterazione, attivando un segnale intracelluare che porta, ad esempio, alla proliferazione cellulare

33 Analogamente, una modificazione della struttura tridimensionale della proteina integrina può determinare l’attivazione di un secondo messaggero in grado di iniziare la sintesi di nuove proteine, come miosina ed actina

34 Talina è la struttura base delle adesioni focali, lega actina, vinculina, e FAK. a-actinina è una proteina di collegamento che può legare anche la vinculina. Vinculina lega actina e tensina. Complesso Adesione Focale COMPONENTI STRUTTURALI

35 Segnalamento attraverso Integrina   Akt FAK PI3-K Survival Grb-2 MAPK Proliferation

36 Struttura di FAK (Focal Adhesion Kinase) Amino Terminal DomainKinase DomainCarboxy-terminal Domain FAT Region Integrin ? Y397 Src PI3-K Cas Nck Crk Sos Y925 Grb-2 Sos talin paxillin Csk Crk FAT Region = Focal Adhesion Targeting Region Grb-7 tirosina chinasi non-recettore (come la famiglia Src –nuotante nel citosol

37 Matrice Extracellulare   Intracellulare fibronectina integrina P fak Organizazione del citoscheletro (rac, rho, ras) Nucleo src Src Integrine, FAK, e MAPK fibronectina MEMBRANA Segnalamento via ECM 1 Aggregazione integrine 5 2 Autofosforilazione di fak 3 Associazione fak/src 4src fosforila fak risposte mitogenetiche 5 AND... P Paxillina

38 Dopo il legame al complesso attivato dell'integrina, FAK autofosforila la sua tirosina Questo fosfotirosina permette che FAK leghi i dominii SH2 di Src o Fyn fosforilandoli c-Src è una tirosin chinasi non recettore citosolica solitamente inattiva per la configurazione auto-impacchettata FAK legandosi attiva c-Src aprendola C-Src fosforila FAK di nuovo! FAK

39 SH2 domain of Grb2 (proteina adattatrice recruta RasGEF SOS alla membrana) c-Src chinasiFAK chinase attivano Ras-MAPK solo legame Attivazione di JNK/NF-kB p85 subunità di PI-3K attivazione PKB/AKT Sopravvivenza Cellulare Sopravvivenza e Propagazione

40 JNK è un modulatore delle funzioni delle cellule epiteliali che è implicato in risposte opposte. Quando è attivato dalle integrine porta alla progressione del ciclo cellulare attraverso l’espressione di geni AP1. Le integrine attivano anche il fattore di trascrizione NF-kB, che promuove la sopravvivenza e l’angiogenesi. Attivazione di JNK/NF-kB

41 L'overespressione di integrine è un forte sostegno per le cellule del tumore fortemente espressa sul fronte invasivo del melanoma maligno e dei vasi sanguigni angiogenici. Integrina α5β3 Espresso a debolmente in nevi e vasi sanguigni quiescenti Integrina α6β4 fortemente espressa durante la progressione dei carcinomi tiroidei Integrina α5β1 NON espressa nelle cellule tiroidee benigne Ha un azione soppressiva del tumore. La sua espressione è persa in molti tumori

42 Integrine e Cancro Il profilo delle integrine cambia nella progressione di molti tumori solidi Spesso, specifiche integrine sono perse Transfezione per ripristinare l’espressione dell’integrina decrementa la tumorigenicità

43 Espressione di  v  6 in epitelio orale normale e carcinoma delle cellule squamose epitelio normale carcinoma Squamoso x33

44 FAK Knockout mice Embrioni letali –Embrioni hanno severi difetti morfogenici –Il numero delle adesioni focali è INCREMENTATO Non difettano nella formazione delle adesioni focali, come fibroblasti FAK-/- fanno eccezionalmente larghe adesioni focali Il difetto sembra essere nella dissoluzione dell’adesione focale, critica per la migrazione cellulare

45 FAK e Cancro In molti tumori solidi, l’espressione di FAK è aumentata FAK può essere un marker di tumori invasivi e metastatici Aumentate sopravvivenza e migrazione, funzioni dell’aumentata espressione di FAK fa di esso un attraente target per lo sviluppo di piccole molecole inibitorie come agenti antineoplastici

46 FAK e SOPRAVVIVENZA L’ingranaggio di FAK dall’integrina stimola un pathway della sopravvivenza Il distacco delle cellule epiteliali dalla ECM provoca un tipo di apoptosi. ANOIKIS La trasduzione del segnale procede attaverso altri enzimi di segnalamento che promuovono la sopravvivenza: FAK-PI3Kinasi-Akt-Bad-anti- apoptosi Questa funzione può essere la principale di FAK


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