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Cromatografia Il termine “cromatografia” deriva dal greco kromatos = colore e graphia da graphos scrivere, che letteralmente significa scrivere in colore.

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Presentazione sul tema: "Cromatografia Il termine “cromatografia” deriva dal greco kromatos = colore e graphia da graphos scrivere, che letteralmente significa scrivere in colore."— Transcript della presentazione:

1 Cromatografia Il termine “cromatografia” deriva dal greco kromatos = colore e graphia da graphos scrivere, che letteralmente significa scrivere in colore. Le sue origini risalgono ai primi anni del XX secolo quando il botanico russo Michail SemenovichTswett filtrò una soluzione di sostanze vegetali su una colonna contenete carbonato di calcio ottenendo la separazione dei pigmenti colorati

2 Cromatografia: Definizione Definizione IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry): "Metodo usato primariamente per la separazione dei componenti di una miscela, in cui i componenti vengono distribuiti tra due fasi una delle quali è fissa mentre l'altra è mobile”.

3 Cromatografia: Definizione La fase stazionaria, che può essere un solido, o un liquido supportato su di un solido, o un gel, può essere: - impaccata in una colonna, - sparsa come uno strato, - distribuita come un film.

4 Cromatografia: Definizione La definizione "letto cromatografico" è usata come termine generale per denotare una qualsiasi delle varie forme in cui può essere usata la fase stazionaria. Quindi la cromatografia è una tecnica di separazione basata sulla migrazione differenziata delle sostanze da separare attraverso due fasi tra loro immiscibili.

5 Classificazione Fase stazionaria Fase mobile Forma del letto cromatografico Tecnica di sviluppo Meccanismo di interazione tra l’analita e la fase stazionaria

6 Il processo di separazione Le singole specie sono trasportate dalla fase mobile e ritardate in funzione delle varie interazioni con la fase stazionaria. I meccanismi di base che intervengono nella separazione sono riconducibili essenzialmente a fenomeni dovuti a: 1.Assorbimento superficiale; 2.Solubilità relativa; 3.Carica; 4.Dimensioni. Una delle ragioni del successo della cromatografia risiede proprio nei diversi meccanismi che possono essere utilizzati per la separazione di specie con caratteristiche diverse.

7 Influenza della fase stazionaria nella cromatografia Scegliere la tecnica cromatografica adatta per una particolare miscela può essere, talvolta, un compito difficile. Il primo parametro da valutare è la distinzione tra i vari tipi di fasi stazionarie che servono a caratterizzare un metodo da un altro.

8 Adsorbimento Questa tecnica è legata all'adsorbimento di un soluto su un adsorbente polare come gel di silice, allumina, farina fossile, ossido di magnesio e carbone o altri composti che abbiano le stesse caratteristiche fisiche. Il meccanismo che regola questo tipo di separazione è da attribuirsi alla competizione del soluto tra i gruppi polari presenti sulla superficie della fase stazionaria e la fase mobile non polare.

9 Adsorbimento Fra le tecniche di separazione è stata per lungo tempo la più usata per l'alta risoluzione nella separazione con l'impiego di solventi apolari. Con l'introduzione della fase inversa è stato possibile migliorare questa tecnica impiegando nella fase di eluizione dei solventi polari (acquosi) al contrario della fase diretta dove l'acqua ha un'azione disattivante sulla fase stazionaria.

10 Adsorbimento

11 Fase normale (NP) Fase stazionaria polare (es. silice, allumina) Fase mobile non polare (es. esano, cloruro di metilene) Separazione di composti polari

12 Fase normale (NP) Il materiale adsorbente più comunemente usato è il gel di silice, che è preparato facendo reagire silicato di sodio con un acido minerale. Ne risulta una polimerizzazione con formazione di un sistema tridimensionale di tetraedri di Si0 4

13 Fase inversa (RP) Fase stazionaria non polare (es. C18, C8) Fase mobile polare (es acqua, mtanolo o loro miscele Separazione di composti non polari

14 Fasi legate Fasi stazionaria legate chimicamente ad un supporto inerte per produrre fasi idroliticamente stabili.

15 Fasi legate Cromatografia a fase normale Il letto stazionario è polare, la fase mobile è non polare o meno polare Cromatografia a fase inversa Il letto stazionario è apolare, la fase mobile è polare o più polare

16 Esclusione (SEC) Due tipi : − Gel filtrazione − Gel permeazione Fase stazionaria è gel di silice o un polimero con dimensione controllata dei pori. La fase mobile semplicemente scioglie e trasporta il campione attraverso il sistema

17 Tipi di matrici utilizzate Agarosio:Agarosio: polisaccaride derivante da particolari alghe rosse, cosituito da residui alternati di D- galattosio e 3,6-anidro-L-galattosio. Disponibile commercialmente come Sepharose, Sepharose CL (cross-linking con 2,3- dibromopropanolo), Superose, Bio-Gel A. Cellulosa :Cellulosa : Polimero di unità glucosidiche unito da legami  -1,4. Tramite epicloridrina vengono ottenuti i legami crociati essenziali per l’utilizzo come matrice in cromatografia, il numero dei quali determina la dimensione dei pori.

18 Tipi di matrici utilizzate Destrano:Destrano: polimero di residui di glucosio uniti da legami  - 1,6, prodotto dal batterio Leuconostoc mesenteroides. E’ presente in commercio con il nome di Sephadex. La porosita’ dei gel a base di destrano e’ controllata dalla massa molecolare del destrano usato e dall’introduzione di legami crociati ottenuti con epicloridrina. Poliacrilamide:Poliacrilamide: polimero di acrilamide e N,N’- metilenbisacrilamide (quest’ultimo determina la formazione di legami crociati). E’ disponibile in commercio come Bio-GelP. Polistirene:Polistirene: polimero di stirene legato con divinilbenzene.

19 Influenza della fase mobile nella cromatografia per adsorbimento Le interazioni implicano una competizione tra le molecole del soluto (X) e le molecole della fase mobile (S) per i siti di adsorbimento. Questo equilibrio è descritto dall'equazione: X m + nSads ↔ Xads + nS m dove: X m = molecole di soluto nella fase mobile X ads = molecole di soluto nello stato adsorbito S ads = molecole della fase mobile adsorbite sulla superficie S m = molecole del solvente nella fase mobile libera n = numero delle molecole di solvente adsorbite spostate dall'adsorbi- mento di una molecola di X Un adsorbimento più forte della fase mobile fa diminuire perciò l'adsorbimento del soluto.

20 Influenza della fase mobile nella cromatografia per adsorbimento I solventi possono essere distinti a seconda della loro forza di adsorbimento. Una classificazione quantitativa di questo tipo viene chiamata serie eluotropica.

21 Serie eluotropica in ordine di forza crescente SolventeParametro della forza del solvente Pentano0,00 Etere0,01 Esano0,01 Cicloesano0,04 Tetraeloruro di carbonio0,18 Xilene0,26 Toluene0,29 Clorobenzene0,30 Benzene0,32 Etere etilico0,38 Cloroformio0,40 Cloruro di metilene0,42 'fetraidrofurano0,45 Dieloroetilene0,49 Metiletilchetone0,51 Diossano0,56 Acetone0,56 Acetato di etile0,58 Dimetilsolfossido0,62 Acetonitrile0,65 Piridina0,71 iso-propanolo0,82 n-propanolo0,82 Metanolo0,95 Acido acetico1,0 AcquaAlta

22 Influenza della fase mobile nella cromatografia per adsorbimento La serie eluotropica può essere usata per trovare il solvente ottimale per una data separazione. L’uso di un solvente a composizione costante viene chiamato eluizione isocratica. Si possono usare, però, anche miscele binarie o ternarie di solventi per ottenere un valore ottimale del parametro di forza del solvente. Bisogna tenere conto, però, che la relazione tra composizione del solvente e forza del solvente non è necessariamente lineare a causa di interazioni preferenziali solvente-solvente e solvente superficie.

23 Esempio di cromatografia per adsorbimento: Cromatografia su strato sottile (TLC) E’ una tecnica in cui la fase mobile è liquida e la fase stazionaria solida è supportata su una lastrina generalmente di vetro o di alluminio. I punti di forza di questa tecnica sono: Rapidità di esecuzione: la maggior parte delle separazioni si ottengono, su uno strato opportuno, in pochi minuti; Bassi costi; ottimo potere separatore; ottima sensibilità; Facilità di esecuzione

24 Cromatografia su strato sottile (TLC) I punti di debolezza di questa tecnica sono: La difficoltà di effettuare determinazioni quantitative valori di R f sono difficilmente riproducibili per TLC poichè sono influenzati dai seguenti fattori: 1.La natura del materiale adsorbente 2.La natura della fase mobile 3.L’attività della fase adsorbente e il suo spessore ed uniformità 4.La temperatura dell’apparato 5.La quantità del campione 6.L’equilibrio di pressione di vapore tra la lastra e l’atmosfera della camera di sviluppo

25 Cromatografia su strato sottile (TLC)

26 Metodi di rivelazione: Fluorescenza (fluoresceina o un silicato di zinco e magnesio attivato) Acido solforico concentrato (50%) Camera a vapori di iodio Reattivi selettivi capaci di produrre una colorazione

27 Cromatografia su strato sottile (TLC) Rivelazione con luce UV. Se le sostanze da rivelare possiedono cromofori derivanti da particolari gruppi funzionali quali doppi legami coniugati, carbonili, carbossili, ecc, è sufficiente illuminare la lastrina con una lampada UV che emetta a 254 e 366 nm. Si osservano così delle macchie luminose sul fondo scuro. Se, invece, le sostanze da rivelare non possiedono cromofori, si può usare una lastra la cui fase stazionaria, prima o dopo l’eluizione, viene impregnata di una sostanza fluorescente ai raggi UV. Illuminando la lastra con le apposite lampade, si osservano delle macchie scure su sfondo fluorescente.

28 Cromatografia su strato sottile (TLC) Rivelazione con reagenti chimici. Questi reagenti, vaporizzati sulle sostanze eluite, formano con esse composti colorati. Per la vaporizzazione si usa un nebulizzatore o, ancora meglio, una bomboletta spray di gas inerte. A volte in mancanza di questi apparecchi si immerge la lastrina nel contenitore con il reattivo dopodiché si lascia scaldare il tutto su una piastra riscaldante fino alla comparsa delle macchie che indicano la fine dello sviluppo.

29 Cromatografia su strato sottile (TLC) Principali classi di reattivi spray: 1.Reagente di Dragendorff (alcaloidi): soluzione preparata mescolando a) nitrato di bismuto (17%) in Acido acetico (20%). b) ioduro di potassio in acqua (40%) miscelare 4 parti di a) con una parte di b) e 14 parti di acqua

30 Cromatografia su colonna D p =  m Diametro tipico della colonna = 20 – 50 mm Lunghezza tipica della colonna = 50 – 200 mm Pressione = < 1 atm Come colonna si usa un tubo di vetro, metallo o plastica con l’uscita conica. Per contenere il riempimento sul fondo della colonna viene poso un tampone di cotone, di lana di vetro o un setto poroso. Le particelle solide vengono versate dalla sommità della colonna in modo uniforme finché la colonna non sia piena. È molto importante che la colonna sia riempita uniformemente affinché non siano lasciati spazi vuoti.

31 HPLC Sebbene la tecnica classica della cromatografia liquida su colonna sia ancora largamente adoperata, la moderna cromatografia liquida ad alta efficienza (HPLC) sta diventando la tecnica standard per le separazioni su colonna. Il motivo fondamentale è che questa tecnica associa le prestazioni della cromatografia a quella della spettroscopia il che permette non solo di isolare composti in miscele complesse, ma anche di identificarli spettroscopicamente.

32 HPLC Nell’HPLC il solvente (fase mobile) viene forzato in colonna per mezzo di una pompa. Infatti, le particelle usate per il riempimento in colonna classica sono dell’ordine di 100 – 250  m di diametro, così una colonna di 1 – 5 cm di diametro permette una percolazione per gravità, a pressione atmosferica. Nell’HPLC il diametro delle particelle è dell’ordine di 5 – 10  m fino ad un massimo di 70  m e necessita di alte pressioni per ottenere un adeguato flusso.

33 HPLC Quando il flusso dell’eluente è forzato in colonna, esso genera una contropressione. La relazione tra questa contropressione  P e le altre variabili cromatografiche è data da:  L v  P =  d p 2 Dove:  = viscosità della fase mobile v = velocità lineare della fase mobile L = lunghezza della colonna d p = diametro medio delle particelle  = costante

34 HPLC Rivelatora ad assobimento UV- visibile La radiazione emessa passa attraverso una lente e si sdoppia un fascio passa attraverso un circuito vuoto o riempito di eluente puro, l’atro fascio passa attraverso un circuito in cui passa l’eluito dalla colonna. La differenza di assorbimento genera il cromatogramma

35 HPLC Rivelatore ad indice di rifrazione La variazione di indice di rifrazione si evidenzia come un cambiamento nella quantità di luce che giunge al fotodiodo.

36 HPLC Sistemi cromatografici HPLC per specifiche Sostanze. amfetamine: Colonna: C18 Fase inversa Fase mobile: metanolo/soluzione tampone di nitrato d’ammonio (90/10) velocità di flusso: 1 ml/min Sistema di rivelazione: UV –Vis Limite di identificazione: 5  g/L in urine

37 Gas-cromatografia La gas cromatografia è un tipo di cromatografia di partizione gas-liquido, avendo come caratteristiche fondamentali: 1.la fase mobile (che è un gas) 2.la modalità di sviluppo cromatografico in cui lo spostamento delle bande che compongono la miscela cromatografica implica la diffusione forzata delle rispettive sostanze nella loro fase di vapore.

38 Gas-cromatografia

39 Colonne e fasi stazionarie: Come regola generale le fasi stazionarie a maggiore polarità tendono a trattenere maggiormente i composti aumentando i tempi di separazione. Si potrebbe ovviare a questo aumento del tempo aumentando la temperatura della colonna; tuttavia un aumento della temperatura tende a ridurre la selettività della colonna.

40 Gas-cromatografia

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42 La temperatura: la temperatura è cruciale nella separazione gas cromatografica e conviene controllarla entro un range di 0,5°C. L’innalzamento della temperatura della colonna velocizza l’eluizione ed anche la velocità di raggiungimento dell’equilibrio tra fase stazionaria e fase mobile. La temperatura ottimale è condizionala da una parte dalla risoluzione richiesta e dall’altra dall’esigenza di minimizzare il tempo di separazione richiesto.

43 Gas-cromatografia per ottenere risultati ottimali una separazione deve essere condotta a temperatura costante (separazione isoterma). Se variamo la temperatura nel corso dell’analisi (gradiente di temperatura) possiamo farlo in due modi: o linearmente (aumento progressivo di temperatura nel tempo) o a rampe e plateau (in modo da abbassare il tempo di eluizione dell’analisi).

44 Gas-cromatografia Rivelatori: i rivelatori sono la parte più delicata dell’intero strumento in quanto a loro è affidato il compito di analizzare i componenti separati in colonna. Per i rivelatori è importante definire il limite di rilevabilità (ossia la sensibilità) che per la gas cromatografia è espressa in ppm (richiedendo appena g di prodotto

45 Gas-cromatografia Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) questo è uno dei rivelatori più utili nella pratica gas cromatografica in quanto è praticamente universale. Il che significa che esso presenta una risposta pressocchè identica per unità di massa di analita indipendentemente dalla struttura chimica

46 Gas-cromatografia Il FID funziona bruciando l’effluente in una fiamma idrogeno/aria in presenza di un eccesso stechiometrico di ossigeno rispetto all’idrogeno. In assenza di altro non si ha nessuna produzione di ioni, mentre quando i componenti dellala miscela, già separati, passano attraverso il rivelatore, essi reagiscono alla fiamma producendo cationi nel flusso dell’eluente.

47 Gas-cromatografia Rivelatori a spettrometria di massa

48 Gas-cromatografia Settore magnetico di uno spettrometro di massa

49 Esempio di determinazione qualitativa e quantitativa del grado di THC in un campione di Canabis sativa: 500 mg del campione costituito da materiale erbaceo disidratato sono stati posti a macerare in 2 ml di metanolo per 24 ore. un’aliquota della fase organica è stata quindi sottoposta ad analisi qualitativa in gas massa e ad analisi quantitativa con il metodo dello standard esterno

50 Gas-cromatografia

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