Meccanismi di contrasto: Microscopia ottica

Presentazione sul tema: "Meccanismi di contrasto: Microscopia ottica"— Transcript della presentazione:

1 Meccanismi di contrasto: Microscopia ottica
Imaging Technique Brightfield (contrasto di ampiezza) Darkfield (contrasto di diffrazione) Contrasto di fase Differential Interference Contrast (DIC) Polarizzazione Fluorescenza Tecniche speciali solo in trasmissione Imaging (mapping) Technique Hoffman Modulation Contrast Oblique Illumination Rheinberg Illumination Dispersion Staining

2 Campo chiaro (Bright Field, BF)
È la tecnica “normale”: l’obbiettivo raccoglie tutta la luce che è trasmessa o riflessa dal campione. È basata sull’assorbimento della luce (o di alcune lunghezze d’onda) maggiore o minore da parte di aree diverse del campione che quindi risultano più o meno chiare (o di colore diverso). Quindi è una tecnica che si basa direttamente sul contrasto di intensità (o di colore). Per questo si chiama contrasto di ampiezza (l’intensità è il quadrato dell’ampiezza dell’onda).

3 Campo scuro (Dark Field, DF)
È la tecnica per oggetti che assorbono poco ma diffondono: l’obbiettivo raccoglie solo la luce che diffusa dal campione. L’illuminazione è fatta in modo tale che la luce che illumina il campione non entra nell’obiettivo. Risultano quindi chiari solo gli oggetti che diffondono, mentre il fondo risulta scuro.

4 Contrasto di polarizzazione
È la tecnica per oggetti birifrangenti: il fascio ordinario e straordinario acquistano una differenza di fase diversa per tipi diversi di cristalli e dipendente dallo spessore. La loro interferenza produce colori che permettono di identificare i diversi cristalli. L’anisotropia che genera birifrangenza può essere intrinseca al materiale o indotta da stress

5 Immagini ortoscopiche

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7 Contrasto di fase È la tecnica per oggetti trasparenti e che non diffondono. Nell’attraversamento del campione la luce subisce però un cambiamento di fase che può venir sfruttato per creare interferenza con il fascio diretto. Applicato p.es. per il conteggio delle fibre di amianto

8 Differential Intereference Contrast (DIC)

9 Microscopia ottica: rapporto campione  meccanismo
Specimen Type Imaging Technique Transmitted Light Transparent Specimens Phase Objects Bacteria, Spermatozoa, Cells in Glass Containers, Protozoa, Mites, Fibers, etc. Phase Contrast Differential Interference Contrast (DIC) Hoffman Modulation Contrast Oblique Illumination Light Scattering Objects Diatoms, Fibers, Hairs, Fresh Water Microorganisms, Radiolarians, etc. Rheinberg Illumination Darkfield Illumination Phase Contrast and DIC Light Refracting Specimens Colloidal Suspensions powders and minerals Liquids Phase Contrast Dispersion Staining DIC Amplitude Specimens Stained Tissue Naturally Colored Specimens Hair and Fibers Insects and Marine Algae Brightfield Illumination Fluorescent Specimens Cells in Tissue Culture Fluorochrome-Stained Sections Smears and Spreads Fluorescence Illumination Birefringent Specimens Mineral Thin Sections Liquid Crystals Melted and Recrystallized Chemicals Hairs and Fibers Bones and Feathers Polarized Illumination Specimen Type Imaging Technique Reflected Light Specular (Reflecting) Surface Thin Films, Mirrors Polished Metallurgical Samples Integrated Circuits Brightfield Illumination Phase Contrast, DIC Darkfield Illumination Diffuse (Non-Reflecting) Surface Thin and Thick Films Rocks and Minerals Hairs, Fibers, and Bone Insects Amplitude Surface Features Dyed Fibers Diffuse Metallic Specimens Composite Materials Polymers Brightfield Illumination Darkfield Illumination Birefringent Specimens Mineral Thin Sections Hairs and Fibers Bones and Feathers Single Crystals Oriented Films Polarized Illumination Fluorescent Specimens Mounted Cells Fluorochrome-Stained Sections Smears and Spreads Fluorescence Illumination

10 Trasmissione

11 Riflessione Scansione

12 (oltre la massima risoluzione)
A cosa è dovuto l’ingrandimento nel SEM? 300m 300mm Esempio 600 pixel Risoluzione max 300m/600pixel  0.5 m/pixel Nessuna informazione può essere ottenuta sulla struttura interna del pixel sul campione Ingrandimento 300mm/300m 1000 X Il numero di pixel nello schermo e la dimensione dell’area scansionata definiscono la dimensione dell’area del campione corrispondente ad un pixel, cioè la risoluzione. L’ingrandimento è il rapporto tra la lunghezza della linea sullo schermo e quella sul campione. Ingrandimento a vuoto (oltre la massima risoluzione) fascio Area sul campione corrispondente a un pixel La risoluzione ha un limite inferiore nella dimensione del fascio.

13 Specimen Image Mag=1 Mag=3

14 Differenza importante tra TEM e SEM
Ricordando che: il coefficiente di aberrazione sferica aumenta con la lunghezza focale delle lenti e questi due numeri hanno lo stesso ordine di grandezza (Cs ~ f/2) Il TEM analizza piccoli campioni posti tra i pezzi polari della lente obiettivo, che quindi può essere operata a lunghezza focale molto piccola con (relativamente) piccoli valori del coefficiente di aberrazione alta risoluzione possibile (conseguenza secondaria: più alta è la risoluzione, minore spazio c’è per orientare il campione o per accessori vari). Nel SEM grandi campioni sono posti fuori dalla lente obiettivo che è operata a grandi lunghezze focali limitata risoluzione (per raggiungere alte risoluzioni esistono SEM speciali, in cui piccoli campioni sono inseriti nelle lenti; sono necessari anche rivelatori speciali)