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Promotori eucariotici RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II trascrive mRNA per proteine RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA.

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Presentazione sul tema: "Promotori eucariotici RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II trascrive mRNA per proteine RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA."— Transcript della presentazione:

1 Promotori eucariotici RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II trascrive mRNA per proteine RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA

2 LE RNA POLIMERASI COME RICONOSCONO I PROMOTORI? Transcribed region Promotore -contiene sequenze Specifiche per il legame della polimerasi

3 FATTORI DI TRASCRIZIONE FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI core promoter REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI - REPRESSORI Transcribed region ELEMENTO ENHANCER ELEMENTO DEL PROMOTORE PROSSIMALE Basal factor binding sites

4 Il legame promotore RNA polimerasi richiede i fattori di trascrizione generali

5 Promotori ~200 bp gene

6 Reporter gene COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE eg CAT, luciferase ATTIVITA 100% Reporter gene 100% Reporter gene 20% Reporter gene 1% Reporter gene 0%

7 Reporter gene eg CAT, luciferase ATTIVITA 100% Reporter gene 100% Reporter gene 400% Reporter gene 1% Reporter gene 0% COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE

8 Livello di trascrizione basale attivato represso

9 Transcribed region Elementi del Core promoter siti di legame per I fattori di trascrizione generali Che supportano un livello di trascrizione basale La regolazione della trascrizione e ottenuta dalla Azione di fattori di trascrizione gene-specifici

10 ~24bp TATABRE InrDPE TATA-box 8 bp elemento ricco in AT BRE 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIID Bound by TFIIB InrDPE Bound by TFIID RNAP II

11 TFIIA TFIIE TFIIF TFIIH RNAP II TFIIB TFIID 2-3 subunits 2 subunits 1 subunit 10 subunits 2 subunits 12 subunits 9 subunits ~40 polipeptidi

12 ~24bp TATABRE InrDPE TATA-box 8 bp AT BRE 6 bp lega TFIID lega TFIIB InrDPE lega TFIID RNAP II

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16 ~24bp TATABRE InrDPE TFIIH TFIID TFIIA TFIIB TFIIF RNAP II TFIIE

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18 TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein TBP TFIID

19 TFIID e composta da vari TBP Associated Factors TAFs -aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo Lelemento Inr -legano i fattori di trascrizione gene specifici -aiutano a decompattare la cromatina

20 ~24bp TATABRE InrDPE TFIID

21 ~24bp TATABRE InrDPE TFIID TFIIA -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF TFIIA

22 ~24bp TATABRE InrDPE TFIID TFIIA TFIIB -si lega a TBP e richiama la polimerasi -Partecipa alla selezione del sito dinizio e Stabilisce la direzione

23 ~24bp TATABRE InrDPE TFIID TFIIA TFIIB TFIIF RNAP II TFIIF Stabilizza il complesso di preinizio e induce Una torsione nel DNA

24 ~24bp TATABRE InrDPE TFIID TFIIA TFIIB TFIIF RNAP II TFIIE Attira una elicasi ed insieme srotolano il Promotore. Stimola lattivita chinasica di TFIIH

25 ~24bp TATABRE InrDPE TFIIH TFIID TFIIA TFIIB TFIIF RNAP II TFIIE TFIIH Fosforila una delle subunita della polimerasi dando lavvio alla trascrizione

26 REGOLATORI GENE SPECIFICI Transcribed region SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE

27 Regolatori gene specifici hanno una struttura modulare contengono un dominio che lega il DNA contengono uno o piu domini di attivazione trascrizionale qualche volta contengono uno o piu domini di repressione qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione

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32 (MADS box)

33 N H H OC Donatore Accettore

34 A D A M A A D M A D A D A A A A A D A

35 Transcribed region Regolatori gene specifici 1)Contengono un dominio che lega il DNA 2)E un dominio di attivazione trascrizionale

36 Gli Attivatori come influenzano la trascrizione di un gene distante molte migliaia di nucleotidi? DNA loop

37 Enhancers- stimolano la trascrizione 1.Attivatori si legano ad un sito specifico 2.Il DNA si ripiega

38 Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore

39 Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore Si lega la RNA polimerasi Inizio della trascrizione

40 Controllo combinatoriale dellespressione genica

41 Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

42 Heterodimerization of DNA binding proteins can alter their sequence specificity

43 Enhancer e Repressori gene promotore enhancer repressore 10-50,000 bp repressore previene il legame dellenhancer RNAP enhancer interagiscono con RNAP trascrizione

44 Recettori nucleari Fattori di trascrizione regolati da molecole idrofobiche Cambio dellattivita Cambio della localizzazione cellulare

45 Recettori nucleari RGRACANNNTGTYCY TBP TAF RNA pol II Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali

46 Nuclear Receptors GR hsp90 GR Legame dellormone Dissociazione da hsp90 dimerizzazione GR Migrazione nel nucleo GR Legame al DNA TATA

47 Regolazione mediante fosforilazione Ormoni attivano una chinasi La chinasi fosforila un fattore di trascrizione Il fattore e attivato

48 Cascata delle chinasi GF si lega al recettore - protein tyrosine kinase Il recettore dimerizza Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase) MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase SEK fosforila JNK – una MAP kinase MEKK P P SEK P JNK P

49 Cascata delle chinasi JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1 AP-1 attiva la trascrizione legandosi a – TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali JNK P nucleo C-JUN TRE C-JUN P RNA pol II C-FOS P

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51 Metilazione del DNA La citosina puo essere metilata: La metilazione del DNA e coinvolta nellinattivazione del cromosoma X Risulta in una maggiore condensazione della cromatina

52 Trascrizione e struttura della cromatina Il DNA nella cromatina condensata non e accessibile La cromatina condensata (eterocromatina) e trascrizionalmente silente La condensazione della cromatina dipende ANCHE dalla acetilazione degli istoni

53 Acetilazione degli Istoni E una modificazione post-traduzionale Gruppi acetilici (CH 3 COO – ) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive Eliminano le interazioni ioniche con il DNA Diminuiscono la condensazione Associati con una attiva trascrizione

54 –Acetilazione/Deacetilazione

55 Attivatori: acetilazione degli Istoni Alcuni attivatori attirano delle acetilasi Il macchinario di trascrizione puo accedere al DNA meno condensato

56 Alcune Istone Acetilasi (HAT) p300/CBP TAF II 250 Ambedue sono dei co-attivatori SAGA e a ponte tra un Fattore di Trascrizione e la TBP

57 Repressori: deacetilazione degli Istoni Alcuni repressori attirano delle deacetilasi Prevengono laccesso del macchinario di trascrizione al DNA

58 –Acetilazione/Deacetilazione

59 SWI/SNF in Lievito SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO (accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio). Queste proteine catalizzano il rimodellamento ATP-dipendente del DNA

60 Macchinari di Rimodellamento Tutti contengono subunita simili a swi- 2/snf NTP-binding proteins

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63 Regolazione dellEspressione Genica Puo essere regolata in una delle seguenti sei fasi: DNA RNA transcript mRNA inactive mRNA protein inactive protein NUCLEUSCYTOSOL trascrizioneMaturazionetrasporto traduzione degradazione controllo dellattivita

64 Lo Splicing puo produrre anticorpi solubili o legati alla membrana dallo stesso gene Lo splicing alternativo puo produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa specificita Quando attivati dallantigene i linfociti B cominciano a produrre anticorpi solubili Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che codificano per domini idrofobici

65 LRNA Editing altera le sequenze dei pre- mRNA Figure 11-39

66 mRNA editing Nellintestino La deaminasi e presente solo nellintestino Nel fegato

67 Metodi per studiare lespressione dei geni Northern blot Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR) Ibridazione In situ Trascrizione In vitro DNA Microarray

68 Purificazione dellRNA Procedura – Lisi delle cellule con un reagente che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi – Rimozione delle proteine – Precipitazione specifica dellRNA

69 Northern blot Per determinare la dimensione e la quantita di specifici mRNA Studi sullespressione genica

70 Northern blot – Elettroforesi dellRNA in gel contenente formaldeide per mantenere lRNA in forma completamente lineare – Trasferimento dellRNA su una membrana – Ibridazione con una sonda marcata

71 100V0,2A +- generatore di corrente gel di agarosio scatola elettroforetica tampone elettroforetico es. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)

72 Gel Elettroforesi- Separa le molecole in base alla dimensione

73 Trasferimento su supporto solido

74 Trasferimento dal gel alla membrana

75 gel membrana Dopo il trasferimento

76 Preparare la sonda per il Northern Blot

77 Ibridazione La sonda marcata e aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega lRNA da analizzare

78 Lavaggio Rimozione della sonda non legata al supporto solido

79 Rivelazione degli ibridi Esposizione di un film se la sonda e marcata radioattivamente Se la sonda e marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido

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81 Northern blot La rivelazione avviene usando: – DNA marcato con radioattivo( 32 P) – DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore

82 Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves ( L ), germinating seeds ( Se ), roots ( Ro ) and stems ( St ). The blot was hybridized with probes for ElLTP1 ( top panel ) and ElLTP2 ( middle panel ). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb Northern blot

83 Svantaggi del Northern Blot Richiede grandi quantita di RNA E un processo lungo e laborioso

84 Ibridazione dellRNA in situ Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio Preparation of RNA probe with in vitro transcription T7/T3 or SP6 promoter

85 Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root RNA in situ hybridization Colour substrate: nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate (BCIP)

86 Il livello di RNA presente nella cellula non necessariamente riflette direttamente i livelli di trascrizione del gene Per poter asserire che un gene viene attivato TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare lattivita

87 Il saggio di run-on (o della catena nascente di RNA) permette di determinare il livello di trascrizione di un gene 1)Purificare i nuclei 2)+ NTP, 32 P GTP 3)Trascrizione: la catena nascente e radioattiva 4)Estrazione dellRNA 5)Ibridazione a cDNA immobilizzato su filtro

88 Sintesi differenziale di 12 geni codificanti mRNA epato-specifici analizzata tramite run-on Lodish Figure 10-23

89 Northern blotting Probe labeling pBS-SemaIII dATP dGTP dTTP dCTP RNA isolation AAAAAA Gel electophoresis Blotting Hybridization Autoradiography

90 reverse Northern blotting Northernreverse Northern


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