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Metodi di sequenziamento Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)

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Presentazione sul tema: "Metodi di sequenziamento Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)"— Transcript della presentazione:

1 Metodi di sequenziamento Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)

2 Metodo di Sanger primer nuovo DNA dideossinucleotide terminatore quattro dNTP (incluso 32PdNTP) DNA polimerasi La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP Denaturare e separare su gel di poliacrilammide ddTTPddCTPddGTPddATP

3 Metodo di Maxam e Gilbert DNA singolo filamento marcato ad una estremità 4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina Es. metilazione delle G con dimetilsolfato Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide

4 Gel di poliacrilammide di sequenza

5 Confronto metodi di sequenziamento Sanger rapida e semplice attuazione disponibilità di kit necessità di primer sensibile a strutture secondarie Maxam e Gilbert lunga preparazione del DNA reazioni da mettere a punto relativamente economico strutture non influenti utilizzabile per oligonucleotidi

6 Sequenziamento automatico

7 Sequenziamento con Taq polimerasi

8 Trasferimento di acidi nucleici (Blotting) Southern Northern

9 Schema trasferimento

10 Schema ibridazione

11 Metodi di trasferimento Capillare Elettroblot

12 carta 3MM membrana nylon gel supporto } carta 3MM tampone vaschetta Assemblaggio del blot capillare

13 - + tampone carta 3MM spugnette gel membrana nylon Assemblaggio dellelettroblot

14 Analisi di espressione con Northern blot

15 Altre tecniche di analisi Estensione del primer (primer extension) Protezione dalla S1/RNasi (mapping) RT-PCR

16 mRNA totale oligo antisenso marcato mRNA globina cap 53 ibridazione estensione con RT Analisi dei frammenti estesi su gel di sequenza frammento protetto Estensione del primer

17 Protezione da RNasi (RNase Protection) mRNA totale sonda RNA antisenso mRNA globina cap 53 ibridazione trattamento con RNasi Analisi dei frammenti protetti su gel di sequenza frammento protetto inizio trascrizione

18 Analisi interazioni DNA-proteine: saggio di footprinting

19 Analisi interazioni DNA-proteine: saggio EMSA

20 Sistemi di espressione In vitro (estratti cellulari) In vivo (cellule in coltura) Animali transgenici

21 Gene reporter

22 diversi tipi di vettori vettori navetta batteri-lievito possibilità di ricombinazione omologa Trasformazione del lievito (Saccharomyces cerevisiae)

23 Vettori di clonaggio per lievito

24 Ricombinazione omologa

25 transiente stabile vettori episomali Trasfezione di cellule in coltura

26 Vettore di espressione in cellule di mammifero

27 Trasfezione in cellule in coltura

28 Vettori episomali

29 fosfato di calcio liposomi (e simili) elettroporazione virus (SV40, retrovirus) Metodi di trasfezione

30

31 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae A)Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP) B)Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western blot di estratti frazionati Parte A 1)Isolamento di DNA genomico da lievito (I parte) 2)Isolamento di DNA genomico da lievito (II parte) Analisi spettrofotometrica del DNA preparato PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare) 3)Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione 4)Analisi su gel di agarosio Reazione con enzima "ligasi" 5)Preparazione piastre di agar Trasformazione batterica 6)Analisi risultati trasformazione Minipreparazione DNA plasmidico 7)Analisi su gel di agarosio 8)Fasi iniziali di Southern blot

32 Clonaggio con doppia digestione GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA G CTTAA AGCTT A EcoRI AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII AAGCTT TTCGAA HindIII

33

34 Trasfezione con liposomi

35 Elettroporazione

36 Vettori virali

37 Vettori retrovirali


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