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L'interfase è il periodo tra successive mitosi e consiste in tre fasi: G 1, S, e G 2. Durante la fase S (sintesi), le molecole di DNA di ogni cromosoma.

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1 L'interfase è il periodo tra successive mitosi e consiste in tre fasi: G 1, S, e G 2. Durante la fase S (sintesi), le molecole di DNA di ogni cromosoma vengono replicate producendo un identico paio di molecole di DNA chiamate cromatidi (talvolta cromatidi "fratelli"). Ogni cromosoma replicato quindi entro in mitosi con due molecole identiche di DNA. Sottili filamenti di cromatina appaiono comunemente come materiale granulare amorfo nel nucleo colorato di cellule in interfase.

2 Prima e dopo la fase S vi sono due periodi di intensa attività metabolica, crescita e differenziamento, detti G 1 (gap = intervallo 1) G 2 (gap 2). Durante la fase G 1 le cellule si preparano per la sintesi di DNA (fase S) e durante la G 2 hanno luogo la crescita e l'espansione cellulare. Le cellule possono uscire dal ciclo cellulare in fase G 1 ed entrare in uno stato di riposo, o G 0. Le cellule in G 0 non proliferano ma sono vitali e metabolicamente attive, e possono rientrare nel ciclo attraverso la fase G 1. Una volta in G 1 la cellula è obbligata a completare il ciclo.

3 La fase M, o mitosi, comprende quattro tappe principali considerate in dettaglio più avanti: profase, metafase, anafase e telofase. La mitosi è di solito la fase più breve del ciclo cellulare, occupando 1 h del tempo totale di h richiesto per il ciclo completo in una cellula animale ideale. Il tempo trascorso in ogni fase della mitosi varia notevolmente. La profase richiede molto più tempo delle altre; la metafase è la più breve.

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5 Cyclin/cdk complexes are required at specific cell cycle transitions

6 G 1 cyclins segnalano alla cellula di preparare i cromosomi per la replicazione S-phase promoting factor (SPF) preparano la cellula a entrare in fase S e duplicare il DNA * durante la sintesi di DNA la ciclina E si degrada e compaiono le cicline di fase M (mitotiche) M-phase promoting factor (MPF) inizia: - Lassemblaggio del fuso mitotico - Dissolvimento dellinvolucro nucleare - Condensazionedei cromosomi Inizia la metafase A questo punto MPF attiva il copmesso APC (Anaphase Promoting Complex)che permette: 1) la separazione dei cromatidi fratelli e la migrazione ai poli 2) la degradazione delle cicline mitotiche (M-phase) 3) avvia la sintesi delle cicline della fase G1per il ciclo successivo 4) degradazione della geminina, una proteina che blocca la replicazione pre-mitotica del DNA sintetizzato in fase S., E B A

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9 Control of Cell Cycle The cell cycle has checkpoints where feedback information from the cell can trigger the next phase Proteins are responsible for the control through bonding to signal receptors. 3 checkpoints : G1 checkpoint- makes the decision as to whether the cell will divide. If conditions are favorable. Like the cell is healthy and large enough proteins will stimulate the cell to start the S Phase. The cell cycle can also be stopped or sent to a resting point, Ex. Muscle and nerve cells, at this checkpoint.

10 G2 checkpoint- DNA replication is checked hear by DNA repair enzymes. If the DNA is copied correctly with no errors proteins then signal mitosis phase. Mitosis Checkpoint- Triggers the exit from mitosis phase.

11 Cell Cycle Arrest DNA Repair G1 Checkpoint

12 Apoptosis G1 Checkpoint

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14 G1/S checkpoint Arresto rapido della replicazione, dovuto alla degradazione della fosfatasi Cdc25A la cui normale funzione e di defosforilare e così attivare la chinasi Cdk2 del complesso SMP, che a sua volta attiva la proteina Cdc45, che è essenaziale per lassemblaggio del complesso di replicazione sullorigine di replicazione del DNA Mediato dalle chinasi Chk1 e Chk2 Rapido e transiente Mantenimento prolungato Danno prima dellentrata in S

15 Il gene p53 Poco più del 50% dei tumori umani presenta mutazioni di questo gene. Nella maggior parte dei casi, le mutazioni inattivanti che colpiscono entrambi gli alleli p53 sono acquisite dalla cellula somatica. Meno frequentemente alcuni soggetti ereditano un allele p53 mutato (sindrome Li-Fraumeni) e possono sviluppare numerosi tipi di neoplasie quali: 1.Sarcomi; 2.Carcinomi della mammella; 3.Leucemie; 4.Tumori cerebrali; 5.Carcinomi della corticale del surrene. Rispetto alle forme sporadiche, le forme ereditarie si presentano in soggetti più giovani. La proteina p53 è localizzata nel nucleo ed entra in gioco come freno demergenza quando il DNA è danneggiato da radiazioni ionizzanti, raggi UV o sostanze chimiche.

16 p21 Puma, Bax Rilasco del citocromo c apoptosi Attivazione di p53 in risposta al danno del DNA IR,UV, MMC.etposide,ROS p53, inattivo e stabile Geni target on

17 p53 si lega al DNA e stimola la trascrizione di alcuni geni che mediano due funzioni fondamentali: larresto del ciclo cellulare e lapoptosi.

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19 Sono stati identificati studiando malattie rare come il retinoblastoma, che colpisce 1 bambino su % = casi sporadici, un singolo tumore si sviluppa in un occhio nella prima infanzia. 40% = casi familiari con trasmissione autosomica dominante, tumori multipli si sviluppano nella retina di entrambi gli occhi nella prima settimana dalla nascita. Affinché il retinoblastoma si sviluppi è necessario che entrambi gli alleli siano inattivi.

20 Prodotti proteici degli oncosoppressori. 1.Molecole che regolano la trascrizione nucleare ed il ciclo cellulare. Il gene Rb Rb è stato il primo gene oncosoppressore scoperto. Il suo prodotto è una fosfoproteina nucleare, pRb, che nel suo stato attivo (IPOfosforilato) costituisce un freno al passaggio dalla fase G 1 alla fase S del ciclo cellulare.

21 La forma attiva di pRb complessata ai fattori di trascrizione E2F si lega al DNA ed inibisce la trascrizione dei geni i cui prodotti sono necessari alla fase S del ciclo cellulare. Quando i complessi ciclina D/CDK4,6 e ciclina E/CDK2 la inattivano IPERfosforilandola, rilascia i fattori E2F. I fattori E2F formano eterodimeri con la famiglia di proteine DP ed attivano la trascrizione di diversi geni bersaglio Quindi, se la proteina pRb è assente o alterata da mutazioni, la cellula progredisce verso la fase S senza alcun freno.

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23 REGOLAZIONE DEL CICLO CELLULARE DA PARTE DEI NUTRIENTI

24 Vitamina A

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26 A/BCDE/F Nuclear Hormone Receptor Superfamily Steroid familyNon-steroid family ER, GR TR, RAR, PPAR, VDR RXR, PR AR DBD Type I family Type II family Helix 12 AF1 LBD - AF2 CAR, SXR/PXR MR LXR,, FXR

27 Conserved domains of transcription factors in nuclear-hormone receptor superfamily Fig Lodish et al. Molecular Cell Biology Two non-repeating C 4 Zn finger motif A/BCE AF-2 domain AF-1 domain

28 Retinoid X Receptor (RXR) E espresso in tutte le cellule Regola numerosi processi eterodimerizzando con altri recettori nucleari (PPAR, VDR, LXR, FXR…….) Il suo ligando naturale e lacido 9 cis retinoico, …..altri ?

29 Diverse Structure of Ligands for Nuclear Receptors

30 Ligand Induces a Conformational Change in the LBD that Repositions helix 12 No LigandAgonist

31 NR Antagonists Alter the Position of Helix 12 No Ligand Agonist (ER) Antagonist (ER)

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33 Consensus sequences of DNA response elements for different nuclear hormone receptors Fig Lodish et al. Molecular Cell Biology The glucocorticoid receptor and oestrogen receptor bind to their respective response elements as homodimers. The response element is an inverted repeat The vitamin D receptor, the thyroid hormone receptor and the retinoic acid receptor bind to their respective response elements as heterodimers (with RXR). The response element is an direct repeat. The spacing between these repeats determines the specificity of the interaction.

34 RAR A B C D E F A/Bdominio di transattivazione INDIPENDENTE dal ligando Cdominio che lega il DNA Dcerniera Edominio che lega il ligando e dimerizzazione Ffunzione non conosciuta

35 RAR-RXRAGGTCAnnnnnAGGTCA(DR5) RXR-RXRAGGTCAnAGGTCA(DR1) RARE RXRE

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37 Nuclear Hormone Receptor- Ligand Complex Action 2 DNA Response Element TATA Box RNA polymerase II or pol II complex actually transcribes, starting at TATA box DNA site NH – receptor Ligand Bound L NH – receptor Ligand Bound L Recruitment of Coactivators is Necessary They are an Obligate Bridge to Pol II complex* * Receptor-ligand can bind DNA and NOT recruit pol II = Antagonist

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39 In tumori sensibili lacido retinoico causa un arresto della crescita cellulare cellule normalitumori sensibilit. resistenti Trattamento con++- a.retinoico Trasfezione Concrescitacrescitacrescita RAR inibitainibitainibita

40 RAR ha 2 sottotipi: RAR e RAR RAR funziona come un gene soppressore di tumore RAR come un dominante negativo Topi transgenici con poco RAR o con molto RAR sviluppano tumori. Quindi lacido retinoico agisce come soppressore della crescita cellulare legandosi a RAR 2, mentre elevati livelli di RAR 4 sopprimono questo effetto (tumori resistenti allacido retinoico)

41 RETINOIDI e NEUROBLASTOMA Retinoidi inducono differenziamento in cellule nervose Nei neuroblastomi inducono apoptosi DNA Microarray hanno dimostrato linduzione di geni Pro-apoptotici da parte di retinoidi

42 Estrazione dellmRNA dai 2 campioni di cellule che si vogliono confrontare Conversione in cDNA Marcatura con 2 fluorocromi diversi Riconoscimento tra i cDNA Eccitazione della fluorescenza tramite laser Immagine a colori raffigurante il microarray provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti sul microarray (1) (2) (3) (4) (5) (6) Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi

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44 LAcido retinoico induce arresto della crescita cellulare oppure proliferazione a seconda del tipo cellulare (es. epidermide o epitelio tracheale). Topi privati di vitamina A sviluppano molti tumori specialmente da epitelio tracheale. Trattamento con acido retinoico le blocca in G1: Ac. Retinoico - + ciclinaD1 mRNA

45 Ciclina D1 Ub Acido retinoico Degradazione e arresto in G1 Induzione dei geni Addetti alla Ubiquitinazione

46 EFFETTO ANTIPROLIFERATIVO DELLACIDO RETINOICO SU VARI TUMORI Tumoreciclina repressa TracheaD1 NeuroblastomaD3 Mieloide (U937)A, B, D2, D3, E Epatoma D1

47 Vitamina D

48 Produzione della Vitamina D da UVB UVB ( nm) converte 7-deidrocolesterolo in pre-vitamina D Previtamina D3 subisce una isomerizzazione che risulta nella formazione della vitamina D3 (25 idrossivitamina D (25(OH)D)) Questa e convertita in 1,25-diidrossivitamina D3 (1,25(OH) 2 D3) nel fegato e nei reni

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50 A/BCDE/F Nuclear Hormone Receptor Superfamily Steroid familyNon-steroid family ER, GR TR, RAR, PPAR, VDR RXR, PR AR DBD Type I family Type II family Helix 12 AF1 LBD - AF2 CAR, SXR/PXR MR LXR,, FXR

51 Diverse Structure of Ligands for Nuclear Receptors

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53 Consensus sequences of DNA response elements for different nuclear hormone receptors Fig Lodish et al. Molecular Cell Biology The glucocorticoid receptor and oestrogen receptor bind to their respective response elements as homodimers. The response element is an inverted repeat The vitamin D receptor, the thyroid hormone receptor and the retinoic acid receptor bind to their respective response elements as heterodimers (with RXR). The response element is an direct repeat. The spacing between these repeats determines the specificity of the interaction.

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55 La vitamina D causa un arresto della proliferazione cellulare e differenziamento in cheratinociti osteoblasti cellule ematopoietiche VDR e specialmente espresso nelle sopracitate cellule quando sono proliferanti

56 Crescita dopo trattamento con Vitamina D Cellule di tumore prostaticoAlva-31(linea cellulare) 50%0% Arresto in G1

57 La mortalita del tumore alla prostata aumenta con la diminuzione alla esposizione alla luce solare I livelli di vitamina D circolanti diminuiscono con leta Alti livelli di sintesi di melanina correlano con un aumento dellincidenza di tumori alla prostata Crescita dopo trattamento con Vitamina D Alva-31(linea cellulare) + VDR antisenso 0%100%

58 La forma attiva di pRb complessata ai fattori di trascrizione E2F si lega al DNA ed inibisce la trascrizione dei geni i cui prodotti sono necessari alla fase S del ciclo cellulare. Quando i complessi ciclina D/CDK4,6 e ciclina E/CDK2 la inattivano IPERfosforilandola, rilascia i fattori E2F. I fattori E2F formano eterodimeri con la famiglia di proteine DP ed attivano la trascrizione di diversi geni bersaglio Quindi, se la proteina pRb è assente o alterata da mutazioni, la cellula progredisce verso la fase S senza alcun freno.

59 Vitamina D X Induzione di p21 Rilascio di citocromo C Repressione di geni Antiapoptotici

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62 Promotore di p27 Gene Luciferasi

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66 Vitamina D p27p27fosforilata ( proteina : piu stabile meno stabile) Arresto in G1

67 Paracalcitolo (analogo della vitamina D) HL60 (linea leucemica) A concentrazione nanomolare riduce le cellule in fase S Aumenta le cellule in fase G1 Ha effetto pro-differenziante Aumenta il numero di cellule che vanno incontro ad apoptosi

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69 or Vit D3 (gene Oncosoppressore) Trattamento con Vit D3 aumenta lespressione della Tuberina

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72 Attivita del promotore di p21

73 TGF-b e Vit D3 aumentano lespressione della Tuberina, di p21 e diminuiscono la ciclina A

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78 Cellule ERa+ Il trattamento con vitamina D induce i geni per: Molecole di adesione p53 p21 Retinoblastoma Varie caspasi TGFb e il gene per il retinoblastoma sono indotti in tutti e due i tipi cellulari

79 Lo svantaggio maggiore per un suo impiego come farmaco antitumorale e la sua enorme influenza sul metabolismo del calcio e dellosso.


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